一、广东金环蛇细胞毒素ⅩⅢ的化学组成和部分一级结构（论文文献综述）
陈俊[1]（2021）在《717解毒合剂治疗蝮蛇咬伤的临床及实验研究》文中认为1目的1.1观察717解毒合剂对蝮蛇咬伤患者的临床疗效,对蝮蛇伤患者血生化值如心肌酶谱（CK、CK-MB）,肝功能指标（AST、ALT）,肾功能指标（BUN、CREA）,血常规（WBC、CRP）,凝血功能（APTT、PT）,炎症介质（TNF-α、IL-6、5-HT、Histamine）等值进行检测,探求717解毒合剂治疗蝮蛇咬伤的作用机制。1.2蛋白组学观察蝮蛇伤大鼠创面组织差异蛋白表达:收集各组大鼠腓肠肌创面组织,采用基于双向电泳（2-DE）-基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）蛋白质组学分析方法,对比分析正常大鼠与蝮蛇上大鼠创面蛋白差异表达情况。1.3动物实验观察蝮蛇毒对大鼠致毒效应以及717解毒合剂的治疗作用;屏障环境下,从脏器系数、生化指标、炎症因子水平等方面,观察蝮蛇毒对大鼠的致毒效应。并从NF-κB和MAPK信号通路研究717解毒合剂抗蝮蛇毒治疗蛇伤机制。2方法2.1临床观察:从2018年9月至2020年11月间在江西省中医院外一科住院部就诊的患者中择取150例符合临床试验条件的病患,随机分为治疗组及对照组,每组各分配75例病患。对照组予西医常规治疗,治疗组在此治疗基础上,每日另口服1剂717解毒合剂,分2次（早、晚饭后）温服。详细记录两组患者治疗7天内的病情表现、生化仪检测相关生化指标、ELISA检测TNF-α、IL-6、5-HT、Histamine数值,具体内容为:2.1.1临床疗效;2.1.2两组患者病情程度与临床疗效比较;2.1.3肿胀、疼痛、瘀斑消退时间及治愈时间;2.1.4治疗前后局部症状、全身体征积分及总积分;2.1.5治疗前、治疗后1天、治疗后3天、治疗后7天总积分;2.1.6治疗前后心肌酶谱、肝功能指标、肾功能指标检测2.1.7两组患者治疗前后相关因子表达水平。2.2动物实验2.2.1实验一:将16只SPF级SD大鼠随机、对半分成两组,雌雄各半,取蝮蛇毒皮下注射于大鼠左下肢制成蛇伤模型,2h后取2种疮面肌肉进行蛋白质分析,2D-DIGE双向电泳,MALDI-TOF-MS质谱分析,观察大鼠蛋白表达情况,采用软件Mascot distiller过滤基线峰、识别信号峰。应用Mascot软件搜索NCBI数据库,寻找匹配的相关蛋白质,同时查询其功能,来明确鉴定的差异蛋白质为何种蛋白质。2.2.2实验二:52只SPF级SD大鼠（雌雄各半）分为正常组和蝮蛇毒组,蝮蛇毒组再分为2h、4h、12h、24h、36h、72h共计六组,于大鼠左后肢注射蝮蛇毒造模,分别于2h、4h、12h、24h、36h、72h麻醉模型大鼠并取心、肝、脾、肺、肾组织及动脉血。观察:（1）大鼠注射蛇毒后一般反应;（2）生化仪检测血清CK、CK-MB、LDH、AST、ALT、GLDH、ALP、UREA、CREA、UA等数值;（3）观察脏器病理学改变。2.2.3实验三:72只SPF级SD大鼠（雌雄各半）随机分为正常对照组、模型对照组、蛇毒血清组、低剂量药物组、中剂量药物组、高剂量药物组,共计6组。左下肢注射蝮蛇毒,2小时后给予治疗,蛇毒组尾静脉注射抗蛇毒血清0.6mL/只,717解毒合剂组按5、20、50mL/kg.d剂量灌胃,共灌6天。20只KM小鼠随机、对半分成2组,雌雄各半,按10mL/kg.d剂量灌胃,共灌3天。SD大鼠各组分别于注射蝮蛇毒后2h、治疗后72h、治疗第6天腹腔麻醉后腹主动脉取血、取肝脏组织。观察:2.2.3.1观察大鼠一般情况,蝮蛇毒小鼠腹膜情况,镜下大鼠肝脏组织结构;2.2.3.2 ELISA法检测三次取血所得血清中TNF-α、NF-κB含量,第6天所取血清中IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α、NF-κB、CRP、INF-β因子表达水平;RT-PCR法检测IκBαmRNA、p38MAPK mRNA表达水平,Western blot检测iNOS、COX-2蛋白表达,免疫组化法检测各组织中NF-кB P50、NF-кB P65表达。3结果3.1临床研究3.1.1治疗组、对照组总有效率分别为90.41%、76.39%,两组患者在临床疗效方面差异显着（P<0.05）,具有统计学意义;3.1.2治疗组62例轻、中度患者,治愈17例、显效25例、有效16例、无效4例;11例重度患者,治愈5例、显效2例、有效1例、无效3例。对照组65例轻、中度患者,治愈8例、显效20例、有效22例、无效15例;7例重度患者,治愈4例、显效1例、无效2例。两组在轻、中度患者的临床疗效上差异不显着（P>0.05）,在重度患者的临床疗效方面差异显着（P<0.05）,具有统计学意义;3.1.3治疗组患者平均肿胀、疼痛、瘀斑消退时间4.48±0.87天、4.95±0.57天、7.43±1.42天,平均住院时间4.98±1.17天;对照组患者平均肿胀、疼痛、瘀斑消退时间5.75±1.01天、6.50±0.86天、8.52±1.44天,平均住院时间6.46±1.45天。两组患者在肿胀、疼痛、瘀斑消退及疾病治愈时间方面差异显着（P<0.05）,具有统计学意义;3.1.4治疗后治疗组患者局部症状积分、全身体征积分、总积分具体为1.48±0.87、1.94±1.15、2.44±1.44;对照组分别为2.46±0.86、2.95±1.15、4.20±1.30,组间差异显着（P<0.01）,具有统计学意义;3.1.5 717解毒合剂能有效治疗蝮蛇咬伤患者,治疗后两组患者积分均下降,第3天、第7天积分下降明显（P<0.01）,比较有统计学意义;3.1.6两组患者治疗前后CK、CK-MB、LDH、ALT、AST、BUN、Cr值比较差异显着（P<0.05）,有统计学意义;3.1.7两组患者治疗后的WBC、CRP、APTT、PT、TNF-α、IL-6、5-HT、Histamine数值均下降,治疗前后有统计学意义。3.2动物实验3.2.1实验一蝮蛇伤模型大鼠较正常大鼠蛋白表达升高斑点为160个,降低的斑点为141个,其中蝮蛇伤四个斑点鉴定蛋白主要含有Myosin-4,Alpha-1B-glycoprotein两种蛋白,初步验证了蛋白组学技术应用于蛇伤早期鉴别诊断标志物筛选的可行性。3.2.2实验二3.2.2.1创面2h后出现中毒现象,4h水肿明显,12h组织液渗出,36h出现自愈趋势,72h开始结痂;3.2.2.2在无菌环境中,蝮蛇毒大鼠脏器或增大或减小,36h后各脏器均有恢复趋势;3.2.2.3治疗后,各组TP、ALB值均降低,GLOB先减小后增大,ALT、AST、ALP、CK、LDH、UREA、CREA、UA值先升高后降低,各指标均有后期恢复趋势;3.2.2.4心肌细胞、肝细胞、肾脏组织4h出现较明显损伤、见炎性浸润,72h出现组织溶解、坏死现象。肺组织后期见轻微肺泡间增宽现象,少见炎细胞浸润。3.2.3实验三3.2.3.1血清组及717解毒合剂中、高剂量组大鼠皮毛光润,精神状态良好,饮食、活动均趋于正常,创面愈合程度高;模型组大鼠皮毛较松散,精神状况不佳,饮食、活动量较少,反应迟钝。造模4小时后小鼠腹部皮下见紫黑色弥漫性出血,72小时症状减轻,中药组减轻更明显。3.2.3.2正常大鼠肝小叶肝细胞排列整齐呈多角形,模型组肝小叶结构稍紊乱,肝细胞体积增大,胞浆染色淡、胞内空泡化,有明显炎细胞浸润,点状坏死灶,717解毒合剂能减轻肝细胞肿胀程度,以高剂量组效果最明显,肝索排列较为整齐,组织结构趋向正常。3.2.3.3蝮蛇伤大鼠血清中TNF-α、NF-κB、IL-2、IL-4、IL-6、CRP、INF-β表达升高;肝组织中COX-2、i NOS、p38MAPK、p-p38MAPK、STAT3、P-STAT3、IκBαmRNA,NF-κB,NF-κB P50蛋白表达升高,p38MAPK mRNA、IκBα蛋白表达下调,717解毒合剂能起到有效的逆向调节作用。4结论4.1 717解毒合剂能有效治疗蝮蛇咬伤患者,减少肿胀、疼痛、瘀斑消退及疾病治愈时间,降低局部症状、全身体征积分及总积分;4.2 CK、CK-MB、LDH、ALT、AST、BUN、Cr,TNF-α、NF-κB、IL-6、p38MAPK、p-p38MAPK、STAT3、P-STAT3、IκBαmRNA、NF-κB P50等可作为蝮蛇咬伤程度及疗效评价指标;4.3 717解毒合剂通过调控NF-ΚB与MAPK信号通路起到抗蝮蛇毒活性,对主要炎症因子具有抑制作用,在治疗后期更具有抗炎活性及免疫调节作用,也为临床研究提供了实验依据。
盛欢[2]（2019）在《毒蛇咬伤后心肌酶和肝功能指标动态变化用于预后判断的价值评估》文中研究表明目的本研究通过回顾性分析安徽中医药大学第一附属医院急诊科收治的蝮蛇咬伤患者225例,对其住院期间的临床资料进行整理与统计学分析,动态观察蝮蛇咬伤患者心肌酶及肝功能指标,得出每个时间截断点上影响患者预后的因素,进行分析对比,从而有利于对疾病及早干预和治疗。方法回顾性分析安徽中医药大学第一附属医院急诊科2013年3月到2017年11月收治的225位蝮蛇咬伤患者的临床资料,且入选病例参照本研究的纳入标准、剔除标准。首先采集患者的姓名、性别、年龄、咬伤部位、职业分布、咬伤至入院时间、住院天数、住院总费用、是否口服中药等一般资料,根据抽血送检的实验室指标,主要收集并动态观察的指标为白细胞计数（WBC）、超敏C反应蛋白（HS-CRP）、肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、乳酸脱氢酶（LDH）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、总胆红素（TBIL）、尿素氮（UREA）、血肌酐（SCR）、凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）,其中心肌酶3项指标为CK、CK-MB、LDH,肝功能3项指标为ALT、AST、TBIL。3次指标送检及观察时间分别为入院后24小时内、住院第3天、住院第5天。根据住院第5天患者咬伤后临床表现及复查的WBC、HS-CRP、CK、CK-MB、LDH、ALT、AST、TBIL、UREA、SCR、PT、APTT检测指标,将患者分为痊愈组和好转组。运用SPSS 21.0软件,对一般资料及两组患者入院后24小时内、住院第3天、住院第5天的心肌酶及肝功能指标分别进行正态性检验和方差分析,对符合正态分布及方差齐性的计量资料采用两独立样本t检验,对非正态分布及方差不齐数据采用两独立样本秩和检验（Mann-whitney U检验）,数据用均数±标准差（sx±）表示,计数资料采用卡方检验。显着性水平是P﹤0.05。结果1.好转组住院总费用及天数均高于痊愈组,住院天数（z=7.427,P﹤0.01）、住院总费用（z=6.794,P﹤0.01）,差异有统计学意义;2.患者入院后予我院协定方蛇伤冲剂口服,其口服中药痊愈率占33.33%,未口服中药痊愈率占12%。χ2=11.762,p﹤0.01,差异有统计学意义;3.入院后24小时内,两组中肌酸激酶（z=5.795,p﹤0.01）、肌酸激酶同工酶（z=4.280,p﹤0.01）、乳酸脱氢酶（z=3.287,p=0.001）、丙氨酸氨基转移酶（z=4.429,p﹤0.01）、天门冬氨酸氨基转移酶（z=4.354,p﹤0.01）、总胆红素（z=2.265,p=0.024）差异有统计学意义;4.住院第3天,两组中肌酸激酶（z=1.849,p=0.064）、肌酸激酶同工酶（z=1.270,p=0.204）、乳酸脱氢酶（z=1.587,p=0.113）、丙氨酸氨基转移酶（z=1.707,p=0.088）、天门冬氨酸氨基转移酶（z=1.761,p=0.078）、总胆红素（z=0.894,p=0.372）差异无统计学意义（p均大于0.05）;5.住院第5天,两组中肌酸激酶（z=5.222,p﹤0.01）、乳酸脱氢酶（z=5.084,p﹤0.01）、丙氨酸氨基转移酶（z=3.744,p﹤0.01）、天门冬氨酸氨基转移酶（z=5.019,p﹤0.01）、总胆红素（z=2.641,p=0.008）差异有统计学意义;肌酸激酶同工酶（z=0.971,p=0.331）差异无统计学意义。结论1)痊愈组的住院总费用及天数均少于好转组（但好转组患者均最终痊愈出院）;2)经口服蛇伤冲剂（院内协定方）后,可明显改善患者临床症状;3)建议观察并监测入院后24小时内CK、CK-MB、LDH、ALT、AST、TBIL及除外CK-MB的第5天CK、LDH、ALT、AST、TBIL指标,可不监测住院第3天的心肌酶及肝功能指标,即可有效评估患者预后,减少住院花费。
李家冬[3]（2018）在《高纯度重组家蚕Ⅱ型乙酰胆碱酯酶蛋白制备研究》文中研究指明酶抑制法是当前农药快速检测的主流方法之一。在实验室前期工作中,我们发现,重组家蚕II型乙酰胆碱酯酶（rBmAChE2）对有机磷农药和氨基甲酸酯农药均表现出良好的敏感性,提示其可能作为一种用于农药快速检测的新酶源。为进一步了解该酶的晶体结构特征以便为后期的分子进化提供理论基础,需要制备高纯度的酶蛋白,为此本论文在对家蚕II型乙酰胆碱酯酶基因及蛋白序列生物信息分析的基础上,分别选取大肠杆菌表达系统和毕赤酵母表达系统,通过尝试不同的表达策略、优化分离纯化方法等开展高纯度酶蛋白制备研究,为后期酶工作机制的理论研究等应用方面奠定基础,主要研究内容及结果如下:（1）BmAChE2的生物信息学分析利用NCBI、PDB、SignalP 4.1 Server、Transmembrane Prediction server、ExPASy Proteomics tools、Phyre2等数据库和在线服务器及相关软件,从核酸序列分析,一级、二级、三级结构预测,同源性比对等方面对BmAChE2进行生物信息学分析。结果显示,BmAChE2基因片段大小为1917 bp,由638个氨基酸组成,分子量为71645.66 Da,分子式为C3254H4912N830O937S31,其中含有大肠杆菌稀有密码子48个,理论等电点为5.49,其中酸性氨基酸残基和碱性氨基酸残基各有70个,占10.97%。蛋白的N端存在一个由23个氨基酸组成的信号肽,C端有一个由17个氨基酸组成的疏水尾,分析其二级结构,无规卷曲含量达到50%,α螺旋占36%,β折叠占11%,TM螺旋占3%。其中TM螺旋刚好在C末端,与“DAS”预测的C端疏水尾结果一致。此外,发现BmAChE2氨基酸序列中含有9个Cys,形成了4对分子内二硫键和1个分子间二硫键。还有3个潜在的N-糖基化位点,分别是N138,N321,N522,均位于BmAChE2结构表面,且远离活性峡谷。进而,将BmAChE2的氨基酸序列与PDB中公布的其他来源的AChE的氨基酸序列进行同源比对。发现BmAChE2与果蝇AChE同源性相对较高,达50%,且BmAChE2的N端信号肽和C端疏水尾部分在其他已经结晶的AChE的两端并不存在,提示这两部分对于AChE三级结构的维持可能不是必须的。（2）BmAChE2在大肠杆菌中的表达根据对BmAChE2生物信息学分析结果,以稀有密码子、二硫键形成以及蛋白的可溶性为BmAChE2在大肠杆菌中表达的主要考虑因素,探究不同表达策略的作用。通过选用Transetta（DE3）作为宿主菌降低稀有密码子对表达的影响;通过与PDI共表达以及选用大肠杆菌Origami2为宿主菌促进目的蛋白二硫键的形成;通过去除BmAChE2片段中的信号肽和疏水肽,利用PelB信号肽促进分泌,与MBP、GST标签蛋白融合表达以及选取大肠杆菌Origami2作为宿主菌来促进目的蛋白的可溶性表达。最终分别构建了4种表达载体（pET22b-Bmace2、pET30b-Bmace2/pBAD-myc-hisA-PDI、pGEX-4T-1-Bmace2、pMAL-P2E-Bmace2）,选用了3种表达宿主菌（BL21（DE3）、Transetta（DE3）、Origami2）对BmAChE2进行诱导表达。结果显示,目的蛋白在大肠杆菌中主要以包涵体形式表达,仅载体与宿主组合为pGEX-4T-1/Origami2时,胞内有少许可溶性目的蛋白产生,经Ni柱纯化发现纯化蛋白得率较低。进而优化包涵体表达的条件,确定在IPTG浓度为0.3 mM,18℃诱导30 h时,表达量最高。经复性、变性后,纯度达到90%以上,但经鉴定发现,重组蛋白没有乙酰胆碱酯酶活性。（3）BmAChE2在毕赤酵母中的表达对前期已获得的BmAChE2毕赤酵母表达工程菌株pPIC9K-ace-opt-GS115,进行诱导表达,并优化了BmAChE2的纯化条件。经过Ni柱、Q柱、SEC柱三步纯化之后,目的蛋白保留了乙酰胆碱酯酶活性,比酶活为2300 U/mg。但SDS-PAGE电泳结果显示,目的蛋白具有严重拖尾现象。将纯化的目的蛋白经PNGase F处理后,拖尾消失,提示N-糖基化修饰可能是造成了拖尾的原因。进而根据预测的N-糖基化位点,选取N321,N522两个位点进行突变。构建突变重组载体pPIC9K-ace-opt-M23（N321Q,N522Q）后,转入毕赤酵母GS115基因组,筛选得到重组突变株pPIC9K-ace-opt-M23-GS115。经甲醇诱导表达后,取上清并经Ni柱纯化。参照Ellman法测定纯化目的蛋白活性,发现该重组BmAChE2/M23保留乙酰胆碱酯酶活性,比酶活为1137.33 U/mg,表明N321Q和N522Q糖基化突变后,BmAChE2/M23保留了乙酰胆碱酯酶活性。同时,经SDS-PAGE分析发现,突变后的BmAChE2/M23拖尾现象消失,目的蛋白纯度在90%以上,达到结晶蛋白纯度要求。
胡玲玲[4]（2017）在《银环蛇L-氨基酸氧化酶的分离纯化与鉴定》文中指出以蛇入药治疗多种疾病在我国已有相当悠久的历史。银环蛇（Bungarus multicinctus）俗称金钱白花蛇,隶属于脊索动物门、爬行纲、有鳞目、眼镜蛇科、环蛇属。中医学认为金钱白花蛇味甘、咸,性温、有毒,具有祛风、通络、定惊、止痒、止痉的功能。蛇毒是毒蛇的毒腺分泌的毒液,作为一类天然的动物毒素蛋白,其含有多种酶类蛋白、非酶蛋白和其他小分子物质,并具有广泛的生物学活性和药理作用,最明显的特征就是具有极强的毒性。银环蛇蛇毒含有多种活性成分,是复杂的混合物,主要以神经毒素为主。中医历来有“以毒攻毒”的治疗法则,研究表明蛇毒中含有纤溶、促凝、镇痛、抗癌等方面的药理功能成分,具有降压、镇痛、消炎和抗肿瘤作用。目前为止,蛇毒液中的某些活性成分经过修饰和改造已被制成成品药,用于临床上疾病的治疗。近年来,随着高通量测序技术和生物信息学分析技术的发展以及日益成熟,越来越多的科研人员将研究重点转移到动物药中多肽物质的研究与开发上来,动物药成为寻找与开发天然活性药物的源泉。因此,探究银环蛇蛇毒的成分以及其发挥药理作用的活性物质具有极其重要的理论和现实意义。本研究利用Illumia HiseqTM2500技术构建且分析银环蛇的转录组文库。使用Trinity拼接软件对所得到的序列进行De novo拼接,最终共获得63,947条高质量的 Unigene（>200bp）,总长度为 64,485,567 bp,其中最长 Unigene 为 23,902 bp,最短为200 bp,平均长度为1008 bp,N50为1806 bp。通过Blastx搜索五大数据库进行基因功能注释,共有21,900条（34.25%）Unigene在NR数据库中存在着相似序列。在NR库注释中筛选出与毒素有关的Unigene,显示银环蛇蛇毒富含神经毒素。同时,分别有17,987条（28.13%）、13,963条（21.84%）、6981条（10.92%）、15,964 条（24.96%）Unigene 在 SWISSPROT、KOG、KEGG和GO数据库中注释成功。结果表明,构建的银环蛇转录组文库质量较高,筛选获得的毒素相关Unigene为银环蛇功能基因的分子克隆、蛇的药用价值研究奠定了基础。采用三步层析纯化法,即凝胶过滤层析、凝胶过滤层析和阴离子交换层析,从银环蛇粗毒中分离纯化得到一种新的L-氨基酸氧化酶,并命名为Bm-LAAO,每500 mg银环蛇蛇毒中纯化得到4.40 mg的LAAO,约占蛇毒总蛋白质含量的0.88%。纯化得到的Bm-LAAO的总活力为297.81 U,酶的比活力为67.70 U/mg,通过RP-HPLC技术和SDS-PAGE均证实其为均一蛋白。通过肽质量指纹图谱分析发现,本研究分离得到的银环蛇LAAO的蛋白序列与NCBI数据库中银环蛇LAAO的cDNA序列高度相符合。Bm-LAAO是一种糖基化的黄素蛋白酶,在还原条件下,其表观分子质量约为62.5 KDa。大部分的蛇毒LAAO在37℃左右活性最高,然而,Bm-LAAO的反应最适温度为45℃,最适pH分别为8.4。酶动力学研究表明,此酶对疏水性L-氨基酸具有较高的催化活性,且不能催化D-氨基酸的氧化脱氨反应,最好的底物基质是L-Met、L-Leu、L-Phe。研究发现去糖基化的Bm-LAAO的酶活力下降了 54.3%,说明糖基化对银环蛇的酶活性有较大的影响。储存温度同样对Bm-LAAO也很重要,相对而言,-80℃是最佳的储存温度。利用PCR技术,本研究从提取的银环蛇毒腺总RNA中克隆出了Bm-LAAO的cDNA序列,该序列编码一条由496个氨基酸残基组成的成熟肽。并采用蛋白质的同源建模技术,以哈里氏蝮蛇毒LAAO的晶体结构作为模板,预测Bm-LAAO的三维结构。本研究利用抑制肿瘤细胞增殖作用的体外实验对Bm-LAAO的抗肿瘤活性进行测定,采用MTT法测定其对肿瘤细胞和人正常细胞增殖能力的影响,采用显微镜及流式细胞仪观察和检测Bm-LAAO对肿瘤细胞的细胞凋亡作用的影响。在所检测的11种肿瘤细胞株中,Bm-LAAO对人胃癌细胞MGC-803具有最强的增殖抑制活性,其IC50为314 ng/ml;对三种人乳腺癌细胞BT474、MDA-MB-231、MCF-7的IC50分别为378、1213、1480 ng/ml,而对正常人乳腺细胞MCF-10A的IC50为13,556 ng/ml,分别是上述三种人乳腺癌细胞的35.86倍、11.18倍和9.16倍。研究表明,相对于正常细胞,Bm-LAAO对肿瘤细胞具有较强的选择性和细胞毒性。当过氧化氢酶及Bm-LAAO共同作用肿瘤细胞时,细胞活性恢复了 75%,表明在很大程度上,Bm-LAAO对细胞的增殖抑制活性可能是LAAO催化过程中产生的H2O2所致。流式细胞仪分析结果显示Bm-LAAO可以诱导MGC-803和MCF-7细胞凋亡,且呈现剂量依赖性的方式,而过氧化氢酶Catalase可以很大程度上减弱Bm-LAAO诱导的细胞凋亡作用,提示Bm-LAAO诱导的细胞凋亡作用也可能与H2O2的产生有关。综上所述,本研究构建并分析了银环蛇的转录组文库,且克隆得到了Bm-LAAO的基因序列;从银环蛇粗毒中分离纯化得到了 LAAO,并对其体外抗肿瘤作用和诱导细胞凋亡作用的机制进行了初步的研究,这为进一步深入地探讨其作用机制和可能的实际应用奠定了基础。
贺宜龙[5]（2014）在《眼镜蛇毒酶解后所得镇痛小肽的分离纯化及鉴定》文中进行了进一步梳理蛇毒中含有多种具有药理作用的多肽及蛋白质,三指蛋白属于其蛋白家族中的一种。近年来,三指蛋白止痛无成瘾性、无依赖性,用量少,镇痛作用时间长等优点已不断引起人们的关注,揭示其镇痛机制,从而开发出选择性高、安全性好、副作用小的镇痛药已成为亟待解决的问题。本文旨在探寻基于蛇毒三指蛋白的镇痛小肽并研究其镇痛作用,将眼镜蛇毒进行胃蛋白酶水解后分离纯化,寻找可口服并能快速起效的镇痛小肽,为研究三指蛋白的镇痛机制奠定一定基础并为相关研究提供参考依据。本实验首先将眼镜蛇蛇毒进行沸水浴处理以获得含有三指蛋白在内的热稳定性高的碱性蛋白混合物,再模拟胃部条件不同时间梯度水解眼镜蛇蛇毒,用热板法检测不同水解时长的产物的镇痛活性;采用高效液相色谱对水解产物进行分离纯化以及纯度鉴定;用热板法观察所得小肽的镇痛作用。结果表明眼镜蛇蛇毒经胃蛋白酶适当水解后灌胃有显着镇痛效果,并且水解6 h后对小鼠灌胃的镇痛效果最好,10 min即可起效并且药效稳定维持至48h以上;腹腔注射组与灌胃组结果相反,随着水解程度的加深至彻底水解,腹腔注射水解混合小肽基本无镇痛效应。HPLC分离纯化后在12 min左右收集的组分经热板法验证与之前结果较一致,经纯化后进行MALDI-TOF鉴定,其分子量约为1267.727,比对数据库确定其氨基酸序列为KDHRGTRIER,合成此段小肽,通过对小鼠灌胃的镇痛实验效果来看,10 min即观察到明显痛阈提高,镇痛持续时间较长,可维持48 h,小鼠痛阈值可提高60%左右,与之前的结果较一致。初步认为我们已获得快速起效、镇痛药效时间长且可口服的镇痛小肽,其镇痛机制尚待进一步研究。
李凤君,韩丽萍,蒋琳兰,李玉华[6]（2013）在《蛇毒神经毒素的研究进展》文中提出蛇毒神经毒素是蛇毒毒液中主要的毒性成分,是一种低分子质量的碱性多肽。神经毒素因其能够治疗神经性疼痛、癌痛及神经硬化症等,应用于临床;而且是研究神经系统中神经递质的产生和传递过程分子作用机制的重要探针,神经毒素具有科学研究及临床应用的重要前景。该文就各类神经毒素的研究进展状况及镇痛机制方面的研究作了综述。
鄢航[7]（2013）在《广西眼镜蛇CT和PLA2基因的真核表达和镇痛活性检测》文中研究说明眼镜蛇神经毒素（Neurotoxin, NT）是一种潜在的麻醉剂和解毒药物,在医用研究领域发挥巨大的作用。但由于蛇毒的产量小且分离难度大,限制了蛇毒在医用上的应用范围。因此,本研究旨在利用昆虫杆状病毒表达系统在体外获得具有镇痛活性的广西眼镜蛇蛇毒蛋白（Cobortoxin, CT）和凝脂酶A2（Phospholipase A2, PLA2）。分别利用分段克隆和反转录PCR的方法克隆了广西眼镜蛇CT和PLA2基因的编码序列。然后将携带和不携带His标签的CT和PLA2插入杆状病毒穿梭载体pFastBacTM Dual启动子PH和p10的下游,获得不携带His标签的重组质粒：pD-CT、pD-PLA2、pD-CT-PLA2和携带His标签的重组质粒：pD-H-CT、pD-H-PLA2、pD-HCT-HPLA2。将6种穿梭载体转入DH10Bac中,用抗生素（庆大霉素、卡那霉素和四环素）和蓝白斑筛选、PCR和测序鉴定,得到携带目的基因的6种昆虫病毒表达载体：BM-CT、BM-PLA2、BM-CT-PLA2、BM-HCT, BM-HPLA2、BM-HCT-HPLA2。利用转染试剂CellfectinⅡ将携带目的基因的6种昆虫病毒表达载体和空载体转入Sf9昆虫细胞,经PCR鉴定,成功获得了7种病毒颗粒。用病毒颗粒感染细胞,经SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达,结果显示,在细胞裂解上清中检测到特异目的条带,提示目的蛋白是可溶的。分别利用电洗脱和Ni柱亲和纯化的方法成功从细胞裂解上清中纯化出不携带His标签的目的蛋白CT和PLA2和携带His标签的目的蛋白HCT和HPLA2。用小鼠的扭体实验检测其镇痛活性,结果显示：CT镇痛效果极显着（P<0.05）,并且Ni柱纯化的效果显着好于电洗脱（P<0.05）。HPLA2的镇痛效果不很明显（P>0.05）。
李凤君[8]（2013）在《广东舟山眼镜蛇（Naja naja atra）抗肿瘤活性成分的分离鉴定及其作用》文中进行了进一步梳理背景和目的蛇毒是蛇毒腺分泌的一种天然的蛋白质毒液，其化学成分非常复杂，是由1015种以上的物质组成的混合物，其中有515种酶、312种非酶蛋白质和多肽，以及其他各类小分子物质。目前蛇毒中研究比较广泛的蛇毒组分是心脏毒素、神经毒素、神经生长因子及抗凝和促凝血毒素等。本文研究舟山眼镜蛇（Naja naja atra）中抗肿瘤活性成分的分离纯化以及鉴定，初步研究该活性成分SVI3细胞毒效应；探讨抗肿瘤活性成分SVI3对A549细胞凋亡的作用机理。方法利用聚丙烯酸PAA吸附法除去蛇毒粗毒中的部分物质，采用离子交换UNO SphereTMS阳离子交换层析得到高纯度的蛇毒活性成分SVI3；利用SDS-PAGE对分离所得产物进行性质的鉴定；采用HPLC对蛇毒活性成分SVI3进行蛋白质纯度鉴定；MTT法测定蛇毒活性成分SVI3体外细胞毒作用；吉姆萨染色法和Hoechst33258染色法观察SVI3对A549细胞的形态影响；流式细胞仪检测蛇毒活性成分SVI3作用于A549细胞的凋亡率；JC-1法观察对A549细胞的线粒体膜电位的变化的影响；分光光度计法检测蛇毒活性成分SVI3对A549细胞Caspase-3、Caspase-9活性的影响；Western-blotting测定蛇毒活性成分SVI3作用于A549细胞后Cytochrome C，procaspase-3、-9含量的变化；S180小鼠肉瘤模型检测SVI3体内抗肿瘤活性。结果1.通过实验分离得到分析纯纯度活性成分SVI3，MTT法结果表明不同的心脏毒素CTXs对肺癌A549细胞具有不同程度的细胞毒性，同时检测蛇毒活性成分SVI3对A549细胞的毒性作用结果显示，蛇毒活性成分SVI3对A549细胞的毒性较其他的蛇毒成分更为显着，活性成分SVI3的IC50可以达到0.770μg/mL。2.吉姆萨染色法和Hoechst33258染色法结果显示在蛇毒活性成分SVI32μg/mL作用下出现明显的凋亡小体，3μg/mL作用后，细胞数量显着减少，且用药组出现细胞变圆，细胞核皱缩，染色质浓缩，形成染色质边集等现象。流式细胞仪检测技术检测随着蛇毒活性成分SVI3浓度的增加，细胞凋亡率显着增加。3. JC-1法结果显示蛇毒活性成分SVI3可以诱导A549细胞膜线粒体膜电位下降。活性成分SVI3诱导A549细胞后Caspase-3、Caspase-9活性升高，Western blotting结果显示活性成分SVI3（5μg/mL）在诱导A549细胞0.5h后，胞浆中检测到Cytochrome C；cleave caspase-3出现时，procaspase-9的含量没有显着变化，结果显示诱导细胞凋亡具有实效关系；体内抑肿瘤显示在剂量为0.5mg/kg/d和1.0mg/kg/d时，抑制率分别为59.99%和85.45%。结论1.建立了从舟山眼镜蛇蛇毒中分离纯化出一种具有抗肿瘤作用的活性成分SVI3，且活性成分纯度可以达到99%。2.经过体外实验和体内实验结果显示，蛇毒活性成分SVI3具有非常显着的抗肿瘤活性。3.活性成分SVI3对A549细胞凋亡作用不仅仅是通过线粒体途径，还有可能通过其他途径影响caspase家族参与凋亡作用。
乔玉莉[9]（2012）在《广西眼镜蛇毒磷脂酶A2的分离纯化及对肝癌细胞SMMC-7721生长的影响》文中研究说明目的从广西产眼镜蛇（Naja）蛇毒中分离纯化磷脂酶A2（phospholipase A2, PLA2）,并研究其理化性质及其对肝癌细胞生长的影响。方法（1）采用凝胶过滤层析法和离子交换层析法分离眼镜蛇粗毒,经平板法和自动电位滴定法测定各峰的PLA2活性,得到具有PLA：活性的组分Ⅰ（命名为DEAE Ⅰ）,通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE）、高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography, HPLC）和MALDI-TOF鉴定其纯度并测定分子量。（2）通过自动电位滴定法测定DEAE Ⅰ的最适温度、最适pH及热稳定性。并通过动物急性毒性实验,研究DEAE Ⅰ的LD5o。（3）通过MTT实验研究DEAE Ⅰ对正常成人肝细胞（HL-7702）和肝癌细胞（SMMC-7721）的细胞毒性,并用倒置相差显微镜观察细胞形态的改变。（4）利用扫描电镜观察DEAE Ⅰ对细胞形态学改变的影响。（5）采用流式细胞术,用Annexin Ⅴ/PI双染色法检测细胞凋亡,用PI染色法检测细胞周期,观察PLA2对细胞凋亡及周期的影响,进一步推测其作用机制。结果（1）通过凝胶过滤层析法和离子交换层析法,分离得到具有PLA2活性的组分Ⅰ（即DEAE Ⅰ）,自动电位滴定法测DEAE Ⅰ的PLA2活力为66.12μmol/（mg*min）;经SDS-PAGE,得出该组分的分子量约为14.4KD,且基本达电泳纯。该组分经HPLC-TSK2000凝胶柱鉴定,仅有单一峰,且基本对称,说明该组分基本达90%以上。经MALDI-TOF鉴定的分子量为13282.02Da。（2）自动电位法测得DEAE Ⅰ的最适温度约为50℃,最适pH在6.0附近,且具有良好的热稳定性。急性毒性实验结果显示,DEAE Ⅰ对昆明小鼠的半数致死剂量（LD50）为13.86±0.057mg/Kg,表明对动物的毒性较小。（3）将DEAE Ⅰ作用于HL-7702及SMMC-7721,通过其对细胞的剂量依赖性和时间依赖性的筛选,确定DEAE Ⅰ的最佳作用浓度为200μg/ml,最佳最用时间为48h。将200μg/ml的DEAE Ⅰ作用于细胞,发现其对HL-7702细胞的抑制率为66.34±12.62%：对SMMC-7721的抑制率为77.82±9.70%。统计分析表明,DEAE Ⅰ对细胞的抑制率与10μg/ml的CDDP对细胞的抑制率差别无统计学意义（p>0.05）；与粗毒（3μg/ml）、G50Ⅰ （40μg/ml）和CM Ⅰ （80μg/ml）比较,p<0.05,表明DEAE Ⅰ与之差别有统计学意义。将DEAE Ⅰ对SMMC-7721的抑制率与HL-7702比较,发现其对SMMC-7721的抑制作用稍强（p<0.05）。（4）细胞形态学的扫描电镜结果显示,DEAE Ⅰ作用24h能使少部分HL-7702和SMMC-7721形成有膜包围的含有核和细胞质碎片的大小不一的凋亡小体状结构,且细胞死亡较少；作用48h,两株细胞均见到明显的凋亡小体样结构,但HL-7702坏死较多。（5）流式细胞仪检测凋亡结果显示,DEAE Ⅰ作用24h后,HL-7702和SMMC-7721无明显的凋亡发生。延长作用时间至48h,DEAE Ⅰ作用于SMMC-7721诱导出现明显的凋亡,凋亡率为33.03%；而作用于HL-7702细胞的凋亡率仅为5.62%,但细胞碎片比较大增；而CDDP对两株细胞的抑制率分别为41.92%和87.37%。（6）细胞周期结果显示,DEAE Ⅰ作用24h后,HL-7702细胞S期值略增高,其他时相均有所下降；而SMMC-7721的细胞周期G0/G1期增加；而CDDP作用与两株细胞24h后,均见凋亡峰。作用48h后,DEAE Ⅰ可使两株细胞的G0/G1期数值均增加,CDDP可使HL-7702出现大量坏死。结论（1）分离得到的组分DEAE Ⅰ具有磷脂酶A：的酶活力,经SDS-PAGE和MALDI-TOF鉴定其分子量为13282.02Da。（2）电位滴定法测得的DEAE Ⅰ的最适温度在50℃左右,最适pH约为6.0,并具有良好的热稳定性。动物急性毒性实验表明DEAE Ⅰ对小鼠的毒性较小。（3）MTT结果显示200μg/ml的DEAE Ⅰ对细胞的作用与10μg/ml的CDDP相当；将DEAE Ⅰ对SMMC-7721的抑制率与HL-7702比较,发现其对SMMC-7721的抑制率稍强。（4）细胞形态学的电镜观察,DEAE Ⅰ能诱导SMMC-7721的凋亡,但对HL-7702的诱导作用稍弱。（5）采用流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期,发现DEAE Ⅰ作用两株细胞48h均能诱导凋亡,但对HL-7702的诱导作用稍弱；并能使两细胞的G0/G1期增加。
王小娟[10]（2011）在《莽山烙铁头蛇粗毒活性分析及蛋白质组学研究》文中研究表明目的：①分析莽山烙铁头蛇（Zhaoermia mangshanensis）粗毒的生物学活性以及对粗毒中的蛋白质（或者多肽）进行鉴定和分析。②分离纯化具有生物活性的毒素分子。实验方法：①膜片钳全细胞记录模式下检测莽山烙铁头蛇粗毒对大鼠背根神经节（DRG）细胞上电压门控钠、钾、钙离子通道的影响。②利用分子筛、反相高效液相色谱（RP-HPLC） MALDI-TOF质谱技术分离纯化粗毒并分析蛇粗毒中的分子量信息（主要分析分子量<10000Da的多肽组分）。③利用超滤、双向凝胶电泳（2-DE）、蛋白质点的胶内酶解、两种质谱技术（TOF-Q和HCT）以及通过生物信息学处理,鉴定并分析蛇粗毒中的蛋白质信息。测定粗毒的三种酶活力（乙酰胆碱酯酶、酪蛋白水解酶、碱性磷酸酶）。结果：①膜片钳实验表明莽山烙铁头蛇粗毒对大鼠背根神经节细胞上河豚毒素不敏感型（TTX-R）钠电流有抑制作用,且具有浓度依从性,IC50大于1000mg/L, 1000mg/L粗毒可抑制TTX-R型钠电流49.4%。粗毒对大鼠背根神经节细胞上河豚毒素敏感型（TTX-S）钠通道、钾通道和钙通道几乎无作用。②莽山烙铁头蛇粗毒多肽部分的分子量集中在1000Da-5000Da之间,且在分离纯化毒素时乙腈浓度升至20%时开始有毒素组分被洗脱出来,其中分子量为924Da,1232Da, 1814Da,3081Da,4082Da的毒素分子在粗毒中含量较高。③经蛋白质组分析,从莽山烙铁头蛇粗毒共鉴定到153种蛋白质,分子量范围在3474Da到243,128Da之间,处于10kDa-30kDa之间的蛋白质居多；等电点分布在4.61-10.46之间,主要集中在5-7和8-10之间；疏水值在-0.883-+0.052之间,90%以上蛋白质的疏水值为负；鉴定到的大部分蛋白是与催化作用有关的蛋白,测定的粗毒三种酶活中蛋白水解酶活力较高（76.40U/mg）,乙酰胆碱酯酶活力为46.45U/g,碱性磷酸酶活力为3.1836U／g。有9种蛋白质可能发生了磷酸化修饰,其中有7种与催化作用相关,磷酸化位点需进一步验证。结论：莽山烙铁头蛇粗毒抑制TTX-R型钠通道,且这种抑制作用呈浓度依赖性,这对于进一步筛选具有镇痛等活性成分的分子具有重要的生物学意义。本研究将莽山烙铁头蛇粗毒中多肽及蛋白质信息做了较为详尽的鉴定和分析,对完善并尽快建立稀有蛇种莽山烙铁头蛇蛋白质资源数据库具有极为重要的生物学意义。
二、广东金环蛇细胞毒素ⅩⅢ的化学组成和部分一级结构（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、广东金环蛇细胞毒素ⅩⅢ的化学组成和部分一级结构（论文提纲范文）
（1）717解毒合剂治疗蝮蛇咬伤的临床及实验研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 英文缩写词注释表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 717 解毒合剂治疗蝮蛇咬伤的临床研究 |
| 第一节 资料与方法 |
| 1 病例纳入 |
| 2 研究方法 |
| 第二节 结果与分析 |
| 1 一般资料分析 |
| 2 试验结果分析 |
| 第三节 讨论 |
| 1 中医学对蝮蛇咬伤的认识 |
| 2 现代医学对蝮蛇咬伤的认识 |
| 3 717 解毒合剂治疗蝮蛇咬伤的机制探讨 |
| 参考文献 |
| 第二章 实验研究 |
| 第一节 蝮蛇伤大鼠创面组织差异蛋白组学初步研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 实验小结 |
| 第二节 屏障环境下蝮蛇毒对动物致毒作用研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 实验小结 |
| 第三节 717 解毒合剂抗蝮蛇毒作用机制研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 实验小结 |
| 第三章 不足与展望 |
| 1 结论 |
| 2 创新 |
| 3 不足与展望 |
| 附录一:试验相关表格 717解毒合剂治疗蝮蛇咬伤临床试验病例观察表 |
| 附录二:综述 蛇毒的中毒机制与植物药干预研究综述 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
（2）毒蛇咬伤后心肌酶和肝功能指标动态变化用于预后判断的价值评估（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 1.前言 |
| 1.1 中医学与毒蛇咬伤 |
| 1.2 西医学与毒蛇咬伤 |
| 1.3 本文研究的意义 |
| 2.临床研究 |
| 2.1 资料与方法 |
| 2.2 研究方法 |
| 3 研究结果 |
| 3.1 一般资料 |
| 3.2 结果 |
| 4 结论 |
| 5 讨论 |
| 5.1 蝮蛇流行病学现状 |
| 5.2 研究结果分析 |
| 6 问题与优势 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 致谢 |
（3）高纯度重组家蚕Ⅱ型乙酰胆碱酯酶蛋白制备研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 前言 |
| 1.1 乙酰胆碱酯酶概况 |
| 1.2 乙酰胆碱酯酶在农药检测中的应用 |
| 1.3 重组乙酰胆碱酯酶的研究现状 |
| 1.4 乙酰胆碱酯酶的结构 |
| 1.5 本研究课题的研究意义及研究内容 |
| 1.6 技术路线图 |
| 第2章 BmAChE2的生物信息学分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 核酸序列分析 |
| 2.2.2 BmAChE2一级结构分析及部分理化性质预测 |
| 2.2.3 BmAChE2二级结构预测 |
| 2.2.4 BmAChE2三级结构预测 |
| 2.2.5 同源比对分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 核酸序列分析 |
| 2.3.2 BmAChE2一级结构分析及部分理化性质预测 |
| 2.3.3 BmAChE2二级结构预测 |
| 2.3.4 BmAChE2三级结构预测 |
| 2.3.5 同源比对分析 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 BmAChE2在大肠杆菌中的表达 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 菌株与质粒 |
| 3.2.2 主要试剂 |
| 3.2.3 主要仪器设备 |
| 3.2.4 常用溶液的配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 目的片段Bmace2的扩增 |
| 3.3.2 4种原核表达载体的构建 |
| 3.3.3 表达载体与宿主组合优化 |
| 3.3.4 重组蛋白的小量诱导表达 |
| 3.3.5 SDS-PAGE分析及Western Blot验证 |
| 3.3.6 表达条件优化 |
| 3.3.7 胞内可溶性BmAChE2的Ni亲和层析 |
| 3.3.8 包涵体变性与复性 |
| 3.3.9 BmAChE2的活性验证 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 目的片段的扩增 |
| 3.4.2 原核表达载体的构建 |
| 3.4.3 表达载体与宿主组合优化 |
| 3.4.4 表达条件的优化 |
| 3.4.5 胞内可溶性BmAChE2的Ni亲和层析纯化及活性分析 |
| 3.4.6 BmAChE2包涵体变性与复性 |
| 3.5 讨论 |
| 3.5.1 信号肽和疏水肽对目的片段表达的影响 |
| 3.5.2 真核蛋白在大肠杆菌中的表达影响因素分析 |
| 3.6 本章小结 |
| 第4章 BmAChE2在毕赤酵母中的表达 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 菌株与质粒 |
| 4.2.2 主要试剂 |
| 4.2.3 主要仪器设备 |
| 4.2.4 常用溶液的配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 BmAChE2的诱导表达 |
| 4.3.2 BmAChE2的Ni亲和层析 |
| 4.3.3 BmAChE2的阴离子交换层析 |
| 4.3.4 BmAChE2的分子排阻层析(SEC) |
| 4.3.5 肽N-糖苷酶F对BmAChE2的处理 |
| 4.3.6 目的片段(ace-opt-M_(23))的扩增 |
| 4.3.7 重组载体pPIC9K-ace-opt-M_(23)的构建 |
| 4.3.8 重组菌株pPIC9K-ace-opt-M_(23)-GS115的构建 |
| 4.3.9 突变后BmAChE2(BmAChE2/M_(23))的表达 |
| 4.3.10 BmAChE2/M_(23)的纯化及活性鉴定 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 BmAChE2的Ni亲和层析 |
| 4.4.2 BmAChE2的阴离子交换层析 |
| 4.4.3 BmAChE2的分子排阻层析(SEC) |
| 4.4.4 肽N-糖苷酶F对BmAChE2的处理 |
| 4.4.5 目的片段(Bmace2-opt-M_(23))的扩增 |
| 4.4.6 重组载体pPIC9K-ace-opt-M_(23)的构建 |
| 4.4.7 重组菌株pPIC9K-ace-opt-M_(23)-GS115的构建 |
| 4.4.8 BmAChE2/M_(23)的表达纯化及活性分析 |
| 4.5 讨论 |
| 4.5.1 不同分离柱子对重组BmAChE2的纯化效果 |
| 4.5.2 糖基化对重组酶表达纯化的影响 |
| 4.6 本章小结 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 A 作者攻读硕士学位期间发表论文情况 |
| 附录 B 测序结果比对 |
（4）银环蛇L-氨基酸氧化酶的分离纯化与鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略对照表 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 中药动物药之蛇类入药 |
| 第二章 蛇类毒素的研究概况 |
| 2.1 蛇类毒素的转录组研究 |
| 2.2 蛇类毒素的蛋白组研究 |
| 第三章 蛇毒L-氨基酸氧化酶的研究进展 |
| 3.1 蛇毒L-氨基酸氧化酶的组成和结构功能 |
| 3.2 蛇毒L-氨基酸氧化酶的药理学活性与应用价值 |
| 3.2.1 细胞毒性作用 |
| 3.2.2 诱导细胞凋亡作用 |
| 3.2.3 对血小板聚集功能的影响 |
| 3.2.4 抑菌作用 |
| 3.2.5 抗肿瘤作用 |
| 3.2.6 其他作用 |
| 3.3 蛇毒L-氨基酸氧化酶分离、纯化与异源表达 |
| 3.3.1 粗毒中LAAO的分离、纯化 |
| 3.3.2 异源重组表达 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第四章 银环蛇毒腺高通量测序转录组文库的构建及分析 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 毒蛇 |
| 4.1.2 主要试剂与耗材 |
| 4.1.3 主要实验仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 转录组文库构建及测序流程 |
| 4.2.2 毒腺的分离 |
| 4.2.3 总RNA的提取 |
| 4.2.4 总RNA的纯化 |
| 4.2.5 mRNA碎片化 |
| 4.2.6 转录组文库的构建与库检 |
| 4.2.7 上机测序 |
| 4.2.8 测序数据预处理 |
| 4.2.9 De novo拼接 |
| 4.2.10 生物信息学分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 总RNA的制备与分析 |
| 4.3.2 测序数据过滤处理 |
| 4.3.3 拼接转录本分析 |
| 4.3.4 基因功能注释 |
| 4.4 分析与讨论 |
| 第五章 银环蛇L-氨基酸氧化酶的分离纯化与结构鉴定 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 蛇毒、菌种 |
| 5.1.2 层析柱和主要试剂 |
| 5.1.3 主要实验仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 Sephadex G-75分离柱的安装 |
| 5.2.2 银环蛇粗毒的分离 |
| 5.2.3 Bm-LAAO的分离纯化及鉴定 |
| 5.2.4 Bm-LAAO的理化性质 |
| 5.2.5 酶学性质 |
| 5.2.6 酶促动力学 |
| 5.2.7 去糖基化 |
| 5.2.8 储存温度 |
| 5.2.9 Bm-LAAO的基因克隆 |
| 5.2.10 基因序列分析 |
| 5.2.11 三维空间结构建模 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 银环蛇粗毒分离 |
| 5.3.2 Bm-LAAO的分离纯化及肽质量指纹图谱分析 |
| 5.3.3 Bm-LAAO的理化性质分析 |
| 5.3.4 Bm-LAAO的纯化效率 |
| 5.3.5 酶学性质鉴定 |
| 5.3.6 酶促动力学分析 |
| 5.3.7 糖基化及储存温度对Bm-LAAO活性的影响 |
| 5.3.8 Bm-LAAO基因及蛋白序列分析 |
| 5.3.9 Bm-LAAO的三维结构 |
| 5.4 分析与讨论 |
| 5.4.1 银环蛇粗毒的分离 |
| 5.4.2 Bm-LAAO的分离纯化 |
| 5.4.3 Bm-LAAO的理化性质 |
| 5.4.4 Bm-LAAO的酶学性质 |
| 5.4.5 Bm-LAAO的序列及结构分析 |
| 5.4.6 Bm-LAAO的原核表达 |
| 第六章 银环蛇L-氨基酸氧化酶的抗肿瘤活性分析 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.1.1 细胞株 |
| 6.1.2 主要试剂 |
| 6.1.3 主要实验仪器 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 银环蛇组分的细胞增殖抑制率检测 |
| 6.2.2 Bm-LAAO对细胞生长的半抑制浓度(IC50)测定 |
| 6.2.3 Bm-LAAO对细胞凋亡作用的检测 |
| 6.2.4 H_20_2对细胞的增殖和凋亡作用的检测 |
| 6.3 实验结果 |
| 6.3.1 银环蛇组分的细胞活力检测 |
| 6.3.2 Bm-LAAO抑制细胞的增殖 |
| 6.3.3 Bm-LAAO诱导细胞的形态学发生改变 |
| 6.3.4 Bm-LAAO可能通过产生H_20_2影响细胞的增殖和凋亡 |
| 6.4 分析与讨论 |
| 6.4.1 LAAO对多种肿瘤细胞具有杀伤作用 |
| 6.4.2 LAAO对细胞凋亡的诱导作用 |
| 6.4.3 Bm-LAAO诱导肿瘤细胞凋亡的机理分析 |
| 全文总结 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 硕士期间发表的学术论文及研究成果 |
| 致谢 |
（5）眼镜蛇毒酶解后所得镇痛小肽的分离纯化及鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 疼痛疾病 |
| 1.2 疼痛产生的机制 |
| 1.3 镇痛药 |
| 1.4 镇痛毒素 |
| 1.4.1 蛇毒(Snake venom,SV) |
| 1.4.1.1 蛇毒的镇痛机制 |
| 1.4.1.2 蛇毒类药物的应用 |
| 1.4.2 芋螺毒素(Conotoxin,CTX) |
| 1.4.3 河豚毒素(Tetrodotoxin, TTX) |
| 1.4.4 蜘蛛毒素(Spider toxin, ST) |
| 1.4.5 蝎毒素(Scorpion venom,SV) |
| 1.5 蛇毒三指蛋白(three-finger protein) |
| 1.5.1 蛇毒三指蛋白的结构多样性 |
| 1.5.1.1 额外的二硫键 |
| 1.5.1.2 N末端以及C末端的延伸 |
| 1.5.1.3 Bulongin以及相关毒素 |
| 1.5.1.4 三指蛋白的糖基化 |
| 1.5.1.5 非共价二聚物 |
| 1.5.1.6 共价二聚体 |
| 1.5.1.7 协同毒素 |
| 1.5.2 蛇毒三指蛋白的分类 |
| 1.5.3 蛇毒三指蛋白的功能位点 |
| 1.5.4 蛇毒三指蛋白的理化性质 |
| 1.5.5 蛇毒三指蛋白的应用 |
| 1.5.5.1 在镇痛方面的应用 |
| 1.5.5.2 在其他领域的应用 |
| 1.6 三指蛋白研究的目的及意义 |
| 1.7 研究的主要内容 |
| 1.8 本研究的技术路线 |
| 第二章 眼镜蛇毒酶解后所得镇痛小肽的分离纯化 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与仪器 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 主要仪器 |
| 2.2.3 实验动物 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 获取蛇毒三指蛋白 |
| 2.3.2 胃蛋白酶水解 |
| 2.3.3 给药方式 |
| 2.3.4 镇痛活性测定 |
| 2.3.5 HPLC法分离纯化 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 蛇毒酶解液对小鼠进行腹腔注射及灌胃给药的影响 |
| 2.4.2 镇痛小肽的分离纯化 |
| 2.4.3 收集组分的镇痛活性 |
| 2.4.4 有效组分的纯化 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 第三章 活性肽的鉴定与合成 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与仪器 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 主要仪器 |
| 3.2.3 实验动物 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 活性肽的鉴定 |
| 3.3.1.1 肽段纯化 |
| 3.3.1.2 质谱检测 |
| 3.3.1.3 查询条件 |
| 3.3.2 活性肽的合成 |
| 3.3.3 合成肽的镇痛活性测定 |
| 3.3.4 合成肽的HPLC |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 活性肽的分子量及氨基酸序列 |
| 3.4.2 活性肽的合成 |
| 3.4.3 合成肽的镇痛活性 |
| 3.4.4 合成肽与活性肽的液相色谱对比 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 结论与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录A 攻读硕士期间发表论文目录 |
（6）蛇毒神经毒素的研究进展（论文提纲范文）
| 1 神经毒素概述 |
| 2 神经毒素的分类和结构 |
| 2.1 突触前神经毒素 |
| 2.1.1 β-银环蛇毒素 |
| 2.1.2 单链β-神经毒素 |
| 2.1.3 多链β-神经毒素 |
| 2.2 突触后神经毒素 |
| 2.2.1 短链神经毒素 |
| 2.2.2 长链神经毒素 |
| 2.2.3 κ-神经毒素 (κ-neurotoxins) |
| 2.2.4 非传统的神经毒素 (Unconventional neurotoxins) |
| 2.3 离子通道型神经毒素 |
| 2.4 抗胆碱酯酶神经毒素 |
| 3 神经毒素的毒性机制与作用机制 |
（7）广西眼镜蛇CT和PLA2基因的真核表达和镇痛活性检测（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1 眼镜蛇神经毒素 |
| 1.1 眼镜蛇神经毒素的种类 |
| 1.2 眼镜蛇神经毒素的结构 |
| 1.3 眼镜蛇神经毒素的作用 |
| 1.4 眼镜蛇神经毒素分离纯化概述 |
| 2 眼镜蛇蛇毒蛋白 |
| 2.1 眼镜蛇毒蛋白的发现 |
| 2.2 眼镜蛇毒蛋白的结构 |
| 2.3 眼镜蛇毒蛋白的功能 |
| 3 凝脂酶A_2 |
| 3.1 蛇毒凝脂酶A_2的作用原理和结构 |
| 3.2 蛇毒凝脂酶A_2的作用 |
| 4 广西眼镜蛇概述 |
| 5 昆虫杆状病毒表达载体研究进展 |
| 5.1 昆虫杆状病毒转移载体和原理 |
| 5.2 昆虫杆状病毒表达系统的优越性 |
| 6 研究目的和意义 |
| 第二章 广西眼镜蛇CT和PLA_2基因的克隆和序列分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 广西眼镜蛇血液的DNA提取 |
| 2.2 广西眼镜蛇毒腺RNA提取 |
| 2.3 广西眼镜蛇毒腺cDNA的内参基因(GAPDH)PCR检测 |
| 2.4 CT目的基因成熟肽序列的获得 |
| 2.5 PLA_2目的基因成熟肽序列的获得 |
| 2.6 两种基因四种pMD质粒的鉴定 |
| 2.7 测序结果 |
| 2.8 同源性分析 |
| 3 讨论与小结 |
| 3.1 神经毒素基因来源的选择 |
| 3.2 成熟肽序列克隆方法的比较 |
| 3.3 神经毒素的保守性 |
| 3.5 小结 |
| 第三章 CT和PLA_2昆虫表达载体的构建和体外表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 单基因真核穿梭载体构建 |
| 2.2 双基因共表达真核穿梭载体构建 |
| 2.3 重组Bacmid的筛选与鉴定 |
| 2.4 重组BacMid质粒提取 |
| 2.5 质粒浓度测定 |
| 2.6 Sf9细胞的培养 |
| 2.7 细胞病变情况观察 |
| 2.8 重组杆状病毒的DNA鉴定 |
| 2.9 目的蛋白表达的位置检测 |
| 3 讨论与小结 |
| 3.1 转座过程中筛选效率 |
| 3.2 昆虫Sf9细胞培养 |
| 3.3 Sf9细胞的转染效率分析 |
| 3.4 眼镜蛇CT蛋白的分子大小分析 |
| 3.5 目的蛋白的表达量分析 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 CT和PLA_2蛋白的纯化和镇痛活性的检测 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果和分析 |
| 2.1 纯化蛋白的SDS-PAGE电泳 |
| 2.2 蛋白定量 |
| 2.3 各组的扭体次数 |
| 3 讨论和小结 |
| 3.1 讨论 |
| 3.2 小结 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（8）广东舟山眼镜蛇（Naja naja atra）抗肿瘤活性成分的分离鉴定及其作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩率词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 蛇毒的成分及概述 |
| 1.2.1 神经毒素( neurotoxin ) |
| 1.2.2 心脏毒素（ cardiotoxin，CTX ） |
| 1.2.3 神经生长因子（ nerve growth factor，NGF ） |
| 1.2.4 磷脂酶 A2（ Phospholipase A2 ） |
| 1.3 蛋白质浓缩技术 |
| 1.3.1 透析袋浓缩法 |
| 1.3.2 冷冻干燥浓缩 |
| 1.3.3 吹干浓缩法 |
| 1.3.4 超滤膜浓缩法 |
| 1.3.5 凝胶浓缩法 |
| 1.3.6 浓缩胶浓缩法 |
| 1.4 蛋白质层析技术 |
| 1.4.1 层析蛋白的预处理技术 |
| 1.4.2 蛋白质层析方法 |
| 1.4.3 层析蛋白洗脱技术 |
| 1.5 细胞凋亡的研究 |
| 1.5.1 细胞凋亡 |
| 1.5.2 细胞凋亡的分子机理 |
| 1.6 本课题研究的目的和意义 |
| 1.7 本课题研究的内容 |
| 第二章 蛇毒活性成分的分离纯化 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验药品 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 实验主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 舟山眼镜蛇蛇毒的预处理 |
| 2.2.2 蛇毒蛋白质的分离-阳离子交换层析 |
| 2.2.3 冷冻干燥 |
| 2.2.4 分离纯化方法适用性考察 |
| 2.2.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 离子交换层析 |
| 2.3.2 SDS-PAGE |
| 2.3.3 HPLC |
| 2.3.4 不同产地蛇毒分离方法的应用 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 活性成分 SVI3 对人肺癌细胞的毒性效应 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 细胞株 |
| 3.1.2 实验药品 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 细胞培养 |
| 3.2.2 MTT 法测定对肿瘤细胞的细胞毒性作用 |
| 3.2.3 细胞形态学观察 SVI3 对 A549 细胞的抑制作用 |
| 3.2.4 统计学分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 MTT 法测定 SVI3 对肿瘤细胞的细胞毒性作用 |
| 3.3.2 MTT 法测定蛇毒不同组分对肺癌 A549 细胞的作用 |
| 3.3.3 细胞形态学观察药物对人肺癌 A549 细胞的抑制作用 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 SVI3 对人肺癌 A549 细胞的凋亡作用 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 细胞株 |
| 4.1.2 实验药品 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 主要仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 细胞培养 |
| 4.2.2 吉姆萨染色法观察 SVI3 对 A549 细胞的抑制作用 |
| 4.2.3 Hoechst 33258 染色观察法观察 SVI3 对 A549 细胞的影响 |
| 4.2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡率 |
| 4.2.5 统计学分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 吉姆萨染色法观察 SVI3 对 A549 细胞的抑制作用 |
| 4.3.2 Hoechst 33258 染色法观察 SVI3 对 A549 细胞的影响 |
| 4.3.3 流式细胞仪检测对 A549 细胞的凋亡率 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 SVI3 对人肺癌 A549 细胞的作用机制的研究 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 细胞株 |
| 5.1.2 实验药品 |
| 5.1.3 主要试剂 |
| 5.1.4 主要仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 细胞培养 |
| 5.2.2 检测 SVI3 对 A549 细胞的线粒体膜电位的影响 |
| 5.2.3 检测 SVI3 对 A549 细胞 Caspase-3 活性的影响 |
| 5.2.4 检测 SVI3 对 A549 细胞 Caspase-9 活性的影响 |
| 5.2.5 Western blotting 测定 |
| 5.2.6 统计学分析 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 JC-1 法检测 SVI3 诱导 A549 细胞线粒体膜电位的影响 |
| 5.3.2 SVI3 诱导 A549 细胞中 Caspase-3 活性的影响 |
| 5.3.3 SVI3 诱导 A549 细胞中 Caspase-9 活性的影响 |
| 5.3.4 Western blotting 实验结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 SVI3 对小鼠 S180 肉瘤的抗肿瘤作用 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.1.1 细胞株及动物 |
| 6.1.2 主要药品 |
| 6.1.3 主要试剂 |
| 6.1.4 主要仪器和设备 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 细胞培养 |
| 6.2.2 腹水瘤 S180 小鼠肿瘤模型的制备 |
| 6.2.3 体内肿瘤抑制试验 |
| 6.3 实验结果 |
| 6.3.1 S180 肿瘤细胞的形态观察 |
| 6.3.2 体内肿瘤抑制试验 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（9）广西眼镜蛇毒磷脂酶A2的分离纯化及对肝癌细胞SMMC-7721生长的影响（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 1、广西眼镜蛇毒磷脂酶A_2的分离纯化及理化性质究 |
| (1) 材料与方法 |
| (2) 结果 |
| (3) 讨论 |
| 2、蛇毒PLA_2对肝癌细胞生长的影响 |
| (1) 材料与方法 |
| (2) 结果 |
| (3) 讨论 |
| 3、结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
（10）莽山烙铁头蛇粗毒活性分析及蛋白质组学研究（论文提纲范文）
| 缩写表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 动物毒素组学研究进展 |
| 1.1 动物毒素研究概况 |
| 1.2 蛇毒的种类及功能概况 |
| 1.3 蛇毒的多肽组学及蛋白质组学研究 |
| 1.4 本课题的研究背景和意义 |
| 第二章 莽山烙铁头蛇粗毒的神经毒活性鉴定 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 莽山烙铁头蛇毒的分离纯化及活性鉴定 |
| 3.1 材料与试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 第四章 莽山烙铁头蛇毒蛋白质组学研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.3 实验结果与讨论 |
| 4.4 小结 |
| 参考文献 |
| 硕士期间发表文章 |
| 致谢 |
四、广东金环蛇细胞毒素ⅩⅢ的化学组成和部分一级结构（论文参考文献）
- [1]717解毒合剂治疗蝮蛇咬伤的临床及实验研究[D]. 陈俊. 江西中医药大学, 2021(01)
- [2]毒蛇咬伤后心肌酶和肝功能指标动态变化用于预后判断的价值评估[D]. 盛欢. 安徽中医药大学, 2019(02)
- [3]高纯度重组家蚕Ⅱ型乙酰胆碱酯酶蛋白制备研究[D]. 李家冬. 华南农业大学, 2018(08)
- [4]银环蛇L-氨基酸氧化酶的分离纯化与鉴定[D]. 胡玲玲. 南京师范大学, 2017(01)
- [5]眼镜蛇毒酶解后所得镇痛小肽的分离纯化及鉴定[D]. 贺宜龙. 昆明理工大学, 2014(06)
- [6]蛇毒神经毒素的研究进展[J]. 李凤君,韩丽萍,蒋琳兰,李玉华. 药物生物技术, 2013(06)
- [7]广西眼镜蛇CT和PLA2基因的真核表达和镇痛活性检测[D]. 鄢航. 广西大学, 2013(03)
- [8]广东舟山眼镜蛇（Naja naja atra）抗肿瘤活性成分的分离鉴定及其作用[D]. 李凤君. 华南理工大学, 2013(01)
- [9]广西眼镜蛇毒磷脂酶A2的分离纯化及对肝癌细胞SMMC-7721生长的影响[D]. 乔玉莉. 广西医科大学, 2012(09)
- [10]莽山烙铁头蛇粗毒活性分析及蛋白质组学研究[D]. 王小娟. 湖南师范大学, 2011(12)