一、基因枪介导转化水稻花粉获得转基因植株（论文文献综述）
周静[1]（2020）在《抗虫彩叶基因聚合表达载体构建及在毛白杨中的转化研究》文中指出毛白杨生长迅速,树干通直挺拔,是我国重要的速生用材树种和园林绿化树种,在我国林业经济、生态建设和城乡绿化中发挥着重要的作用。但病虫危害严重影响毛白杨的正常生长,而叶色单一在一定程度上影响了毛白杨的观赏度。随着生物技术的发展,利用多基因聚合转化技术创制同时具有抗虫和彩叶特性的毛白杨新材料,对于毛白杨种质创新具有重要意义。Btcry Ⅱ基因编码的毒蛋白和丝氨酸蛋白酶抑制剂Bbi基因对鳞翅目害虫具有高毒力,CmOr基因可调控类胡萝卜素含量以改变叶色,本实验采用IRES元件构建了多基因聚合表达载体p CAMBIA1304-Btcry Ⅱ-IRES-CmOrIRES-Luc;利用农杆菌介导法将其和抗虫基因表达载体p CAMBIA1304-Bbi分别转入毛白杨TC1521无性系中,通过抗性筛选、PCR鉴定获得一批转基因阳性植株;进一步通过RT-PCR、qRT-PCR对外源基因的表达情况进行了分析,为后续进行抗虫试验、叶片色素测试等生理生化指标分析奠定了工作基础。本研究主要结果如下:1.以pCAMBIA1304质粒为骨架,构建了基于IRES元件的多基因聚合表达载体p CAMBIA1304-Btcry Ⅱ-IRES-CmOr-IRES-Luc,通过PCR检测,证明外源基因Btcry Ⅱ和CmOr已经成功整合到表达载体上。2.利用冻融法将多基因表达载体p CAMBIA1304-Btcry Ⅱ-IRES-CmOr-IRES-Luc和抗虫基因表达载体p CAMBIA1304-Bbi导入农杆菌GV3101中,通过农杆菌介导法将其分别转入毛白杨TC1521,经过植物组织培养和潮霉素（Hyg）筛选,得到40株转抗虫、彩叶双价基因的生根抗性苗和18株转Bbi基因的生根抗性苗。经PCR鉴定,获得双价基因阳性植株8株和抗虫基因Bbi阳性植株7株。3.采用RT-PCR和qRT-PCR技术,对8个转双价基因的阳性植株进行外源基因的表达分析,检测结果表明,在其中7个转基因株系中都能够检测到Btcry Ⅱ和CmOr基因,且相对表达量明显高于野生型植株（WT）;对7个转Bbi基因阳性植株进行RT-PCR检测,在2个转基因株系中检测到该基因的转录本,说明Bbi基因不仅已经整合到毛白杨TC1521的基因组中,而且能够正常转录。4.对上述7个转Btcry Ⅱ、CmOr双价基因株系和2个转Bbi抗虫基因株系进行扩繁,共获得转双价基因植株24株,转Bbi抗虫基因植株16株,并移栽到温室进行培养。这些工作为后续抗虫测试和叶片色素分析奠定了工作基础。
苏佩佩[2]（2019）在《小麦组织特异性启动子的筛选、功能分析及应用研究》文中研究指明小麦（Triticum aestivum L.）是世界第二大粮食作物,小麦籽粒作为人类重要的主食之一,是全球超过35%的人类每日所需蛋白质和热量的主要来源。植物组织特异性表达基因和启动子研究一方面有助于预测基因的功能,深入了解植物生长发育过程中基因的表达调控规律,另一方面启动子更是植物基因工程研究的重要工具。但单子叶植物特别是小麦中组织特异性基因和启动子的研究远远落后于其他禾本科作物,比如水稻。本文对小麦组织特异性基因及启动子进行了筛选和分析,利用组织特异性启动子构建了雄性不育系,并尝试利用小麦组织特异性启动子创建小麦无损伤可视化筛选方法;另外还在水稻中分离鉴定了小麦花粉特异性表达基因Ta PSG076的同源基因Os PSG076的启动子,构建了用于Os PSG076基因功能验证的植物表达载体并得到了转基因水稻株系。主要研究结果如下:（1）分析了NCBI公共数据库中小麦胚芽鞘、根、叶、雌蕊、雄蕊、胚、和胚乳七个组织中基因表达的芯片数据,共发现了604个探针代表的基因表现出组织特异性特征。进一步将其中的330个基因进行了小麦染色体定位,发现具有相同组织特异性的基因往往成簇分布在染色体上,并且有些基因的序列被定位在不同的染色体上呈现多拷贝现象。（2）为了验证芯片数据分析结果的可靠性,利用RT-sq PCR和RT-q PCR方法证实了其中36个候选基因表达的组织特异性,实验结果与芯片数据表现出高度一致性。在此基础上,构建了p Col1::GUS,p Root2::GUS和p Leaf1::GUS的植物表达载体,通过农杆菌介导的转化技术,瞬时侵染小麦胚芽鞘,证明Ta Col1启动子可以驱动gus基因在小麦胚芽鞘中瞬时表达。同样采用农杆菌转化技术,获得了p Root2::GUS和p Leaf1::GUS的转基因拟南芥植株。经GUS组织化学检测,证明Ta Root2启动子在拟南芥中表现为根特异性调控模式,而Ta Leaf1启动子在拟南芥叶片中优势表达。（3）利用候选的小麦根特异性启动子Ta Root7和已报道的1Dx5胚乳特异性启动子,分别构建p Root7::Ds Red和1Dx5::Ds Red表达载体,利用基因枪转化,获得了转基因小麦株系,并建立了小麦无损伤可视化筛选方法。（4）利用本实验室克隆鉴定的小麦花粉特异性启动子Ta PSG076构建了Ta PSG076::Barnase（p14B）表达载体,利用基因枪转化,获得了转基因小麦株系,用以创制小麦雄性不育系。（5）基于本实验室分离鉴定的小麦花粉特异性启动子Ta PSG076,分离鉴定了水稻中的同源基因Os PSG076的上游启动子,构建了987 bp该启动子序列的表达载体Os PSG076::GUSplus,利用农杆菌介导的转化技术进行水稻的遗传转化,获得了转基因水稻株系。经过GUS组织化学染色发现,Os PSG076启动子在水稻的花粉中特异表达,且表达强度很高,证实Os PSG076启动子是水稻花粉特异性启动子。（6）构建了Os PSG076基因的过表达（OE）、RNA干扰（RNAi）、基因编辑（CRISPR/Cas9）植物表达载体并获得了水稻转基因株系。综上所述,本文通过高通量分析鉴定了小麦中七个组织的特异性基因,这些结果有助于了解相关未知基因的功能,为小麦组织特异性启动子的挖掘提供了新的资源。对其中三个启动子进行了功能验证,并进行了小麦组织特异性启动子的应用研究。此外,还分离鉴定了一个水稻花粉特异性基因启动子Os PSG076,并获得了可对Os PSG076基因进行功能验证的水稻转基因材料。这些结果证实了本文中组织特异性启动子筛选方法的可行性,及组织特异性启动子的潜在应用价值。
姜明珠[3]（2019）在《小麦光温敏雄性不育系337S不育相关基因的遗传转化及功能分析》文中认为雄性不育是自花和常异花授粉作物利用杂种优势的最重要、最有效途径,小麦杂种优势能否广泛利用在很大程度上取决于人们对小麦不同类型雄性不育的认识与理解。小麦雄性不育类型很多,有核不育、核质互作不育、光温敏不育等。我国小麦生产上小有利用的是光温敏雄性不育,研究小麦光温敏雄性不育的遗传及调控机制将拓展人们对小麦雄性不育的认识与理解,扩大小麦杂种优势利用。本研究对小麦光温敏雄性不育系337S短日低温不育条件下显着上调表达的几个基因进行了克隆,利用Gateway技术构建了其中三个候选基因Ta MS337S-3、Ta MS337S-4、Ta MS337S-5的超表达载体,利用基因枪介导法和农杆菌介导法对小麦不同品种幼胚进行了遗传转化,对转基因阳性苗进行了表型差异分析,同时将三个候选基因在拟南芥中进行了遗传转化和基因功能分析,主要结果如下:1.基因枪介导的小麦幼胚遗传转化:华麦2152为受体材料转Ta MS337S-3基因共获得了59株抗性苗,PCR检测其中有13株阳性苗;华麦2566为受体材料转Ta MS337S-5基因共获得了46株抗性苗,PCR检测其中有9株阳性苗;科农199受体材料转Ta MS337S-5基因共获得了39株抗性苗,PCR检测其中有2株阳性苗。2.农杆菌介导小麦幼胚的遗传转化:华麦2152为受体材料转Ta MS337S-3基因共获得了49株抗性苗,PCR检测其中有2株阳性苗;华麦2566为受体材料转Ta MS337S-4基因共获得了14株抗性苗,PCR检测其中有2株阳性苗;科农199受体材料转Ta MS337S-5基因共获得了49株抗性苗,PCR检测其中有5株阳性苗。3.转基因阳性苗的表型差异:与对应的受体亲本材料相比,转Ta MS337S-3基因的阳性苗分蘖数明显增多,生长势更旺,并且营养生长期明显延长,表明Ta MS337S-3基因是控制营养生长向生殖生长转化的关键基因之一,据此推测Ta MS337S-3基因可能与337S育性有关;转Ta MS337S-4基因的阳性苗植株相比受体亲本矮小瘦弱,小穗明显变小,并且部分小花的雄蕊短小,没有花粉散出,不能正常灌浆而形成种子,表明Ta MS337S-4基因对小麦的生长、小穗、小花发育,有负向作用,据此推测Ta MS337S-4基因应该与337S的不育性有关;转Ta MS337S-5基因的阳性苗植株在表型上与受体材料无明显差异,暂不能确定Ta MS337S-5基因与育性是否有关。4.以转Ta MS337S-3、Ta MS337S-5基因的T3代拟南芥株系,转Ta MS337S-4基因T2代单拷贝拟南芥株系为材料,研究三个候选基因对拟南芥生长发育的影响。结果表明,转Ta MS337S-3基因拟南芥其中两个株系发现分枝数明显增多,与野生型差异显着,并且开花时间比野生型晚了一周左右,与转基因小麦的表型趋向相似;Ta MS337S-4基因明显延缓了拟南芥的发育进程,与野生型相比,其抽苔开花时间迟了近20 d,且植株相对弱小,荚果长度、荚果数、株高、种子质量等性状表型值显着小于野生材料,亦与转基因小麦的表型趋向相似;转Ta MS337S-5基因的拟南芥5个株系性状与野生型差异较小,也与转基因小麦的表型趋向相似;基于转基因小麦、转基因拟南芥阳性苗的表型差异分析结果,可以认为,Ta MS337S-3、Ta MS337S-4基因与小麦光温敏雄性不育系337S的育性关联,Ta MS337S-5基因对337S的育性影响不大。
宋瑞莲[4]（2019）在《小麦光温敏不育系337S的育性相关基因miR2275及其靶基因CAF1的克隆与遗传转化》文中研究说明MicroRNAs（miRNAs）是目前研究较多的一类存在于真核生物体内的长2024nt的内源性的单链小分子RNA。主要在转录后水平对基因进行表达调控,广泛参与植物生长发育过程。已有研究显示,一些特定的miRNA参与植物花药发育过程,是导致花药发育异常、产生雄性不育的重要原因之一。目前有关miRNA在植物花药发育中的研究报道主要集中于水稻、玉米、棉花、油菜等作物,在小麦上的研究报道不多,研究小麦花药发育过程中起作用的特定miRNA对小麦雄性不育与杂种优势利用研究有重要意义。本实验室前期以小麦光温敏雄性不育系337S在短日低温不育和正常可育条件下的花药为材料,通过RNA测序分析鉴定出了一些在小麦337S花药发育中差异表达显着的miRNAs。本研究以miR1127b、miR9652、miR2275为候选基因,构建出过表达载体在不同小麦愈伤中进行遗传转化。由于前期降解组测序时没有找到miR1127b、miR9652的靶基因,仅miR2275找到了其靶基因CAF1,故对CAF1基因进行了同源克隆,对miR2275基因进行了遗传转化研究,以期初步了解miR2275与靶基因CAF1在小麦生殖发育中作用。主要研究结果如下:1.miR2275、miR9652、miR1127b基因的遗传转化:借助于Gateway技术,构建了miR2275、miR9652、miR1127b基因的过表达载体,并通过农杆菌介导法和基因枪法转化不同小麦品种。转基因植株经初步PCR检测,基因枪介导的小麦幼胚遗传转化,miR2275基因转化共得到阳性苗18株,华麦2566阳性苗10株,Bobwhite7株,337S阳性苗1株,阳性率分别为1.94%、1.51%、0.23%。农杆菌介导小麦幼胚的遗传转化,miR1127b基因转化只有华麦2566得到1株阳性苗,阳性率为0.19%;miR9652基因转化只有Bobwhite得到1株阳性苗,阳性率为0.19%;miR2275基因转化共得到3株阳性苗,受体均为华麦2566,阳性率为0.99%。2.miR2275靶基因CAF1的同源克隆:前期研究对337S花药进行了降解组测序,仅miR2275找到了其靶基因CAF1。利用同源克隆方法克隆出了CAF1的6个同源基因,分别命名为CAF1-3A-1、CAF1-3A-2、CAF1-3B-1、CAF1-3B-2、CAF1-3D-1、CAF1-3D-2。生物信息学分析发现,除了CAF1-3B-2,另外5个基因均含有CAF1家族的高度保守结构域。其中CAF1-3A-1与CAF1-3A-2基因间同源性较高。CAF1-3B-2存在34bp的缺失,产生终止密码子,造成翻译的提前终止。只有CAF1-3D-1蛋白存在一个跨膜区域,CAF1-3B-1与CAF1-3D-2为疏水性蛋白,其余均为亲水性蛋白。3.靶基因CAF1的亚细胞定位与表达:分别构建了GFP与CAF1-3A-1、CAF1-3B-1、CAF1-3D-1、CAF1-3D-2的N端和C端融合的亚细胞定位载体,并在本氏烟草中进行了瞬时表达。定位结果显示,GFP与N端融合的蛋白在烟草细胞核、细胞膜或细胞壁中均出现绿色荧光,表明这4个蛋白均在细胞核、细胞膜或细胞壁中表达。另外构建了CAF1-3A-1、CAF1-3D-1、CAF1-3D-2的原核表达载体,并在BL21（DE3）大肠杆菌菌株中初步确定了适宜的表达条件,即在18℃、0.5mM IPTG下诱导12h均能使这3个蛋白表达。4.靶基因CAF1启动子基因的克隆:克隆了CAF1的6个启动子基因,构建了启动子驱动的GUS融合蛋白表达载体并通过农杆菌介导的花序侵染法转化野生型拟南芥,获得了相应的转基因植株。5.小麦转基因阳性苗的表型:对小麦转基因阳性苗的表型观察发现,与野生型材料华麦2566、华麦2152、Bobwhite、337S相比,转miR2275基因的阳性苗出现不结实和部分结实的现象。其中Bobwhite的1株阳性苗长势较弱,植株矮小,没有结实。337S的1株阳性苗从穗中部开始往上均表现出比野生型植株开颖角度大,雌蕊外露,仅穗基部有少量结实。这进一步显示,miR2275是决定337S不育性的重要因子之一。
段学清[5]（2019）在《玉米Ac/Ds转座体系的构建及二穗短柄草BdSOC1-like基因功能的初步分析》文中提出玉米（Zea mays L.）作为世界上分布最广泛的作物之一,其用途广泛,不仅可以作为人类口粮,还可以作为牲畜饲料及工业生产原料。由于居民饮食结构中肉类的比例逐渐上升,极大地促进了养殖业的发展。随着养殖业的快速发展,对饲料的需求逐年攀升。玉米还可用于工业原料,生产淀粉,氨基酸和乙醇等,这带动了玉米种植面积和总产量的稳步上升。然而在世界范围内玉米需求仍在持续增长,但供给情况并不乐观。因此积极展开玉米的分子遗传学研究,为玉米遗传育种工作提供材料和基因资源,就显得十分必要和迫切。然而玉米的分子遗传学研究离不开转基因和大量的突变体材料。另外玉米的株型较大不适合大规模温室生长,生长周期较长等特点限制了玉米基因功能研究的发展。二穗短柄草（Brachypodium distachyon L.）与大麦,小麦,玉米等禾本科作物亲缘关系较近,它们都是单子叶植物,另外二穗短柄草的基因组小,生长周期短,生长条件也简单及自花授粉等特点使其成为了研究禾本科单子叶植物的模式材料。为了更好地开展玉米功能基因组学研究,本文致力于建立高效,可重复的玉米遗传转化体系和Ac/Ds标签突变体库,创造大量突变体材料,为玉米基因的发掘,功能注释及其分子机理研究奠定基础和提供材料;同时我们也对相关突变体及其相关基因在二穗短柄草中的功能做初步分析,为各物种间基因功能的分子及进化关系研究提供思路。玉米遗传转化体系的建立（1）基因枪介导的玉米遗传转化在玉米遗传转化研究工作中,人们通常使用未成熟胚或其胚性愈伤组织作为转化受体,抗生素或除草剂筛选产生抗性愈伤组织和抗性芽。玉米的抗性愈伤组织和抗性芽中往往会存在比例不等的假阳性现象,显着地增加了组织培养和后期分子鉴定的工作量。利用GFP（Green Fluorescence Protein）绿色荧光蛋白基因作为辅助性筛选标记基因,基因枪法轰击了玉米自交系A188和Qi319未成熟胚的胚性愈伤组织。瞬时表达实验结果表明,轰击后GFP表达可持续近3w,轰击后10d左右表达量仍保持在较高的水平。采用潮霉素筛选,GFP荧光法鉴定,获得了一批玉米转基因植株,转化频率0.3-0.5%。分子鉴定和后代分析的结果表明,外源基因已经整合到了玉米基因组中并能够稳定地表达和遗传。这一工作揭示了GFP作为辅助性筛选标记基因可以直观、快速和有效地消除玉米遗传转化工作中的假阳性现象。（2）农杆菌介导的玉米遗传转化在以未成熟胚为受体,农杆菌介导的玉米遗传转化研究中,MS或N6共培养基（MC）常常被用来培养侵染后的玉米未成熟胚。在这里,我们描述了一种新的共培养方法—干滤纸共培养法（农杆菌侵染后的玉米未成熟胚放置于垫有两张干滤纸的培养皿中培养,DC）,同时我们以来源于Qi319玉米自交系的未成熟胚为受体,通过农杆菌介导玉米的遗传转化。为了检测这两种共培养法（MC和DC）对玉米转化效率的影响,我们设计了三组实验:（1）使用AGL1菌株分别携带两种独立的质粒（pXQD12和pXQD70）侵染玉米9-15d的未成熟胚;（2）使用两个不同菌株（AGL1和EHA105）携带同一载体（pXQD12）分别侵染玉米9-15d的未成熟胚;（3）用携带（pXQD12或pXQD70）质粒的（AGL1或EH105）菌株分别侵染玉米9-15d的未成熟胚,侵染不同时间（5min,10min,15min,20min和25min）。然后,侵染过的未成熟胚分别放置于仅垫有两张滤纸的培养皿或MS共培养基上进行培养,余下转化过程同普通的转化过程一样。结果显示,和MC相比,侵染后8d（3d共培养,5d天恢复培养）对愈伤组织在体视镜下进行GFP观察,%GFP+愈伤组织（GFP+愈伤组织占所侵染的未成熟胚的百分率）增加约2-3倍。另外,与MC相比,DC的平均再生效率（%GFP+再生的愈伤组织占所侵染的未成熟胚的百分率）和稳定转化效率（%GFP+植株占所侵染的未成熟胚的百分率）也显着提高。总之,DC共培养法也许能用于发展一种更为有效的农杆菌介导的玉米遗传转化。玉米Ac/Ds标签突变体库的构建与分析玉米是一个对C4植物进行分子和农艺研究的模式材料。本项研究利用转座子标签载体—激活（Ac）/解离（Ds）-ATagubiGFP在玉米Qi319中产生插入标签和敲除型突变体。该载体携带新霉素磷酸转移酶基因（NPTII）,绿色荧光蛋白（GFP）基因和由35S启动子启动的玉米转座酶（TPase）基因。利用该载体转化玉米产生了4个外源Ds（foreign Ds,fDs）发生转座的T0转基因系。在T0和T1代时,将转基因与野生型杂交,共获得12,514个单株。使用绿色荧光蛋白（GFP）和多重聚合酶链反应（PCR）筛选该群体。通过热不对称交错PCR（TAIL-PCR）或反向PCR（iPCR）鉴定fDs-ATag元件转座位置的边界,并将得到的产物序列与最近报导的玉米基因组进行比对。到目前为止,我们已经获得在10条玉米染色体都有分布的154个独立的仅fDs转座群体。这些群体已经以种子的形式在种子库中保存下来,这样人们可以通过对在线数据库进行访问,为商业玉米品种背景下的基因功能分析和育种提供了独特的资源。二穗短柄草BdSOC1-like基因功能的初步研究在上述Ac/Ds突变体库中,我们发现了一个可能由于fD插入造成的晚花突变体。经过分子及生物信息学分析,该突变体中fDs插入到基因号为NP001105152的玉米基因的第一个外显子上且该基因与二穗短柄草BdSOC1-like基因同源。由于玉米生长周期较长,株型较大不适合温室大规模生长等特点,为了能快速的研究上述基因号为NP001105152的玉米基因的功能,同时也想看看温带禾本科植物中该同源基因的功能,我们使用与小麦和水稻亲缘关系较近且生长周期较短的模式植物二穗短柄草Bd21为研究材料,对BdSOC1-like的功能进行初步分析。生物信息学分析显示该BdSOC1-like具有SOC1家族所特有的MADS-box和kerati（k）结构域。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）结果暗示了,BdSOC1-like基因在植物根、茎、幼叶、老叶、顶端分生组织和花中都有表达,在长日照（LD,18h light/6h dark）或短日照（SD,10h light/14h dark）条件下,BdSOC1-like的mRNA积累并没有昼夜节律性以及BdSOC1-like的表达也对持续的冷处理没有记忆性。另外在二穗短柄草中超表达BdSOC1-like不但引起了植物提前开花,也导致了较弱的种子表型。总的来说,以上结果暗示了,在二穗短柄草中,BdSOC1-like在植物的成花转变中也许扮演着重要的角色。总之,本研究改进了玉米遗传转化方法,建立了Ac/Ds转座体系,并对玉米在短柄草中的一个与花期相关的同源基因进行了功能分析,获得了3方面的创新性结果:（1）在基因枪转化中建立了一种GFP标签鉴定方法,使转基因后代鉴定更快速便捷。在农杆菌转化中建立了干滤纸共培养法,使转化效率大幅度提高;（2）建立了玉米Ac/Ds转座系统,获得了转座位点分布在10条染色体上的154个fDs转座系;（3）发现一个晚花突变体,分析了突变基因,进而在短柄草基因组中找到了同源基因BdSOC1-like,并利用转基因方法进行了功能验证。
肖婷婷[6]（2019）在《黄瓜Tril基因转化及再生体系优化》文中进行了进一步梳理黄瓜（Cucumis sativus L.）组织培养和遗传转化虽然经过几十年的发展,但仍存在再生体系不成熟、转化效率低等问题。因此,优化黄瓜离体再生体系,提高遗传转化效率是黄瓜品种选育和种质资源创新所迫切需要的。本研究选用黄瓜品种‘新泰密刺’为材料,采用实验室前期已有的方法,通过构建表皮毛（果刺）发育相关基因的载体、获取外植体、共培养、侵染和植株再生等过程获取转化株。同时针对黄瓜离体再生体系不成熟、遗传转化效率低等问题进行了优化,通过对分化培养基中6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）浓度及生根培养基中卡那霉素（Kan）浓度的优化,进一步提高了出芽率、生根率和转化率,为黄瓜遗传转化体系奠定基础。主要结果如下:1.通过构建含pBI121-9930TrilPro-TrilCDS-3xflag的植物表达载体和根瘤农杆菌介导法对黄瓜‘新泰密刺’品种进行转化,成功获得11棵苗,经PCR鉴定、qRT-PCR检测以及P1单株后代的鉴定确定有1株为阳性苗,转化率为0.33%。2.针对得到的阳性苗转化率低的现象,对芽诱导阶段6-BA浓度进行筛选。结果表明,6-BA浓度为0.5 mg/L时出芽率达到76%以上,出芽效果最好。对根诱导阶段Kan浓度进行筛选。发现Kan最适浓度为60 mg/L时,能够起到最低浓度的有效筛选,即在此浓度下阳性株能生根,非阳性株不能生根。3.在0.5 mg/L 6-BA和60 mg/L Kan浓度下,研究了三种不同Kan筛选方式对转化周期和阳性苗率的影响。结果表明,仅在生根培养基中添加60 mg/L的Kan时,转化周期最短（45 d）,出芽率（62.6%）、生根率（22.5%）和转化率（1.33%）相对较高。
李姝璇[7]（2018）在《农杆菌介导的大豆遗传转化方法优化及KN1和GID1基因对大豆再生和遗传转化效率的影响》文中研究指明近年来我国大豆进口量日益增加,而进口大豆多为转基因品种,在产量和价格上比国产大豆具有一定优势。因此,我国亟待开展大豆转基因技术研究,希望通过生物技术直接向大豆中导入一些优良性状基因,以提高产量、改良品质、获得抗病虫、抗除草剂等抗性,提高我国大豆的生产能力和国际竞争能力,缓解大豆市场的供需矛盾。高效遗传转化体系是进行基因功能研究和分子育种的先决条件。农杆菌介导的遗传转化方法是许多植物转化的优选方法。但是,相对于水稻、小麦等作物,大豆转化效率仍然较低。因此,如何提高大豆的遗传转化效率是目前亟待解决的问题。本研究通过对影响农杆菌侵染效率和大豆再生效率的因素进行优化,以提高大豆遗传转化效率;并通过构建含植物激素相关基因的表达载体探索了 ZmKN1（玉米Knotted 1基因）和GmGID1s（大豆GA Insensitive Dwarf1基因）对大豆再生和遗传转化效率及植株表型的影响。本研究获得的主要结果如下:1.通过提高农杆菌的侵染效率（侵染时菌液的浓度、重悬液成分、获取外植体方式、共培养时间、大豆品种等）和大豆外植体再生效率来优化农杆菌介导的大豆转化效率。本试验所用载体为pTF102,农杆菌菌株为EHA101。结果表明在农杆菌生长至浓度为OD650=0.6收菌,并在重悬液中添加154.2 mg/L的DTT（Dithiothreitol）侵染用浸泡过夜方式获取的外植体（大豆品种为Jack Purple和天隆1号）,共培养5天后外植体的侵染效率达到96%以上。另一方面,比较在芽伸长培养基中使用不同浓度组合的赤霉素 GA3（Gibberellin）和生长素 IAA（Indole-3-acetic acid）,发现使用 1.0 mg/L GA3和0.1 mg/L IAA的浓度组合时,Jack Purple和天隆1号这两个品种的伸长效率分别为34%和26%,比其他5组的高,比使用原始培养基（浓度组合为0.5 mg/L GA3和0.1 mg/L IAA）的伸长效率分别增加了 18%和11%。在这个优化后的激素浓度组合下,Jack Purple和天隆1号这两个品种的转化效率分别为7%和10%,与原始培养基相比分别增加了 2%和6%。2.细胞分裂素是重要的植物激素之一,能够促进植物细胞的分裂及增殖、诱导芽分化、解除顶端优势。其中KN1基因在拟南芥、烟草、水稻等植物中均可促进植物体内细胞分裂素含量增加,诱导不定芽生成,提高转化效率,因此本研究希望探索KN1基因是否能提高大豆再生和转化效率。首先构建pCAMBIA3301-35S-ZmKN1-NOS载体,然后转入农杆菌EHA105并进行大豆转化。结果发现ZmKN1基因可能促进大豆丛生芽伸长,但假阳性（非转基因）的丛生芽也得以伸长。获得过表达ZmKN1基因的大豆阳性植株并观察其后代表型,发现与正常植株相比,过表达ZmKN1基因的大豆植株叶片发生卷曲,叶柄发生旋转;叶脉出现不规则凸起;叶柄与主茎夹角近乎平行;开花提前;植株较小;平均每荚粒数（少于2粒）显着少于对照受体植株的平均每荚粒数（大于2粒）。以上结果表明过表达KN1基因可能促进大豆丛生芽伸长率,但存在假阳性高、影响其他表型性状等问题,尚需通过构建诱导性启动子调控KN1基因的表达。3.在上述1中的研究表明,培养基中外源GA的浓度影响大豆的伸长率和转化效率。因此,我们希望通过构建含与GA相关基因的载体转化大豆,以期通过在组织培养过程中增加外植体对GA的敏感性来提高丛生芽伸长率,从而提高转化效率。GA受体蛋白GID1能够直接与GA结合,并和抑制植株生长的DELLA相关蛋白产生三联复合体,通过SCF识别后被E3泛素化,将DELLA降解,从而解除对植株生长的抑制,促进植株的生长。通过BLAST检索,发现大豆中有5条与拟南芥AtGID1同源的基因,其编码蛋白具有与活性GA结合、感知GA信号的保守结构域HGG和GDSSGG,根据染色体位置分别命名为GmGID1-1～GmGID1-5。GmGID1s基因的开放阅读框（Open Reading Frame,ORF）为 1029～1041 bp,氨基酸数目为 342～346,分子质量为38.67～39.39 KDa。用100 mg/L的GA喷施叶片后取叶片和茎进行荧光定量,结果表明GmGID1s基因的表达受外源GA的诱导上调,且在GA处理12 h时,大豆叶片中的GmGID1s表达量除GmGID1-1基因外比0 h对照都显着增高,大豆茎中的GmGID1s表达量除GmGID1-3基因外都显着增高（P<0.05）。4.构建pCAMBIA3301-35S-GID1s-NOS等分别含GmGID1-1～GmGID1-5基因的5个载体,转入农杆菌EHA105并进行大豆转化。转GmGID1-1、GmGID1-2基因的大豆丛生芽伸长效率分别为36.13%、30.84%,高于其他三个基因;转GmGID1-2基因所获得的转化效率最高,达到6.68%,其次是GmGID1-3,为3.77%。通过比较5个GmGID1s基因对大豆再生和转化效率的影响,发现GmGID1-2基因在促进大豆丛生芽伸长方面具有一定作用,但实验尚需多次重复以验证该结论。此外,过表达GmGID1-2基因的大豆后代植株平均高度为109.6 cm,显着（P<0.05,t检验）高于对照的平均株高20.5 cm,后期尚需观察过表达GmGID1-2基因对大豆其他农艺性状的影响。
滕慧娟[8]（2017）在《水稻OsWDRP3基因功能的初步探究》文中研究指明WD40-repeat蛋白广泛分布于真核生物中,参与形成多种生物大分子复合体,在植物生命活动中起着关键的作用,如参与调控配子体发育、胚胎发育、表皮毛形成、光形态建成、非生物胁迫等。本研究选取水稻中的一个WD40-repeat蛋白基因OsWDRP3,对其功能进行初步的探究。得到如下结果:（1）利用CRISPR/Cas9技术,获得了对OsWDRP3基因进行修饰的转基因植株,并对其表型进行观察,结果显示转基因植株具有矮化、开花延迟、叶片夹角变小、株型紧凑等表型。（2）通过实时荧光定量PCR对OsWDRP3-RNAi植株中OsWDRPW的表达量进行检测。结果显示:相比野生型,RNAi植株中OsWDRPW基因的表达量下调了一倍。RNAi株系出现矮化、开花延迟、结实率低等表型。（3）利用实时荧光定量PCR,对OsWDRP3基因在野生型水稻中的表达模式进行分析。结果显示:OsWDRP3基因在水稻生长发育不同时期的各个组织结构中均有表达,其中在10天的叶片中表达量最高,随着植株的生长在叶片中的表达量下降;在花穗中的表达量最低;在根、茎、花序轴中的表达量适中。（4）利用mRNA原位杂交技术分析了OsWDRP3基因的时空表达模式。结果显示:OsWDRP3在根的表皮细胞中有较高的表达,在花序轴的表皮细胞、维管束中的韧皮部和髓中OsWDRP3也有较高的表达。在不同时期的颖壳中都有较高表达。在花药和成熟花粉中的表达量很低。（5）研究了 OsWDRP3在细胞内的定位。构建OsWDRP3-GFP融合表达载体,利用基因枪将载体微弹直接转入活力旺盛的洋葱表皮细胞中,在细胞内瞬时表达融合蛋白,激光共聚焦显微镜观察结果显示,OsWDRP3定位在细胞核和靠近细胞膜的胞质中。（6）分析了 OsWDRP3和OsBAK1-ICD（OsBAK1的胞内激酶区）的互作情况。利用BIFC技术,在小叶烟草叶片中共表达OsWDRP3-YFPN和OsBAK1-ICD-YFPC,在叶片下表皮细胞中观察到完整的YFP荧光信号。对照组 OsWDRP3-YFPN/YFPC 和 OsBAK1-ICD-YFPC/YFPN 没有检测到 YFP荧光信号。（7）利用ABA、NaCl、PEG处理野生型水稻幼苗24 h,模拟植物激素、高盐、干旱胁迫,检测OsWDRP3基因的表达情况。结果显示:在100 μmol/LABA处理下OsWDRP3的表达量逐渐升高。在150 mmol/L NaCl处理下OsWDRP3的表达量先逐渐升高,6 h后降低。在15%PEG-8000处理下,前三个小时的表达量下降,随后升高,6 h后又开始降低。（8）构建了 OsWDRP3蛋白表达载体,转入大肠杆菌DE3菌株中,诱导表达了OsWDRP3蛋白,并对蛋白进行纯化。OsWDRP3-CRISPR/Cas9突变体和RNAi转基因植株矮化、叶夹角变小,开花延迟、结实率低,结合OsWDRP3的表达模式,我们认为OsWDRP3可能参与调控水稻叶片发育和株高的调控。OsWDRP3-CRISPR/Cas9突变体和RNAi转基因植株的表型与水稻BR不敏感突变体类似,并且OsWDRP3能与OsBAK1相互作用。根据以上结果推测OsWDRP3可能与BR相关,参与BR信号途径,具体的机制还需要进一步研究。ABA、NaCl、PEG处理下,野生型水稻中OsWDRP3的表达量变化说明OsWDRP3可能对非生物胁迫有一定的响应,具体机制需进一步研究。以上结果为OsWDRP3基因的后续研究打下了基础。
叶兴国,徐惠君,杜丽璞,何光源,王轲,林志珊[9]（2014）在《小麦规模化转基因技术体系构建及其应用》文中提出在主要农作物中,小麦属于遗传转化比较困难的作物,转化效率较低,重复性较差,转化规模较小,优良转基因材料较少,基因工程育种进程明显落后于大豆、玉米、棉花、水稻等作物。目前,应用于小麦中的转基因技术主要包括基因枪介导法和农杆菌介导法,有些实验室也采用花粉管通道、离子束注入、激光微束穿刺、PEG、花粉介导和农杆菌浸花等方法。在外植体利用方面,多数研究主要利用小麦幼胚及其愈伤组织作为起始转化材料,以成熟胚、幼穗、花药愈伤组织为材料转化成功的报道还比较少,需要进一步探索。在转化效率方面,基因枪报道为0.1%—16.7%,农杆菌报道为0.7%—44.8%,变化幅度较大。在目标基因转化方面,除了nptⅡ、bar、hpt、GUS、GOX、pmi、ALS等筛选基因和报告基因外,转化的功能基因主要涉及小麦品质、抗病性、耐旱性、抗蚜虫和抗除草剂等性状改良。农杆菌介导和基因枪介导转化小麦幼胚的转化效率除与受体基因型有关外,还与受体材料的生理状态有关,供体植株生长期间的温度条件、光照条件、营养条件和水分条件对转化效率有至关重要的影响,开花到幼胚取样期间适宜的昼夜温度有利于转化后胚性愈伤组织诱导和候选转基因植株的获得。从整体水平看,中国小麦转基因技术研究虽然取得了较大进展,如建立了小麦成熟胚高频率再生体系并应用于小麦转化,改进了小麦幼胚再生体系和转化体系,将一批抗病、耐旱和品质改良相关基因转入小麦,初步建立了小麦规模化转基因技术体系,但与国际先进水平相比,尤其与一些跨国生物技术公司相比,在转化规模和转化效率方面仍然存在较大差距。认为转化效率较低、基因型依赖性强、人工气候条件不够先进、转化队伍不稳定是限制中国小麦规模化转基因技术发展的瓶颈;建立主栽品种转化体系、提高转化效率、开展多基因转化、开发安全型转化技术、避免载体骨架序列插入、减少基因沉默、实现定点整合等是小麦转基因技术研究的发展趋势;通过对组织培养技术、植株再生和转化相关基因的研究,以及优良受体基因型筛选、培养基改良和各个转化影响因素的优化、集成等,克服农杆菌转化小麦的瓶颈,提高小麦转化效率,扩大转化规模。文章重点综述了基因枪和农杆菌转化技术在小麦中的应用和发展,回顾了近5年中国小麦规模化转基因技术研究进展,对于促进转基因小麦新品种培育和小麦功能基因组学研究具有一定参考价值。
肖小君,王辉,齐泽民,黄作喜[10]（2011）在《转基因技术及其在水稻育种中的研究进展》文中指出以载体介导、基因直接导入和种质系统3类基因转化体系分别介绍了常用的几种转基因技术—农杆菌转化法、基因枪法、PEG介导法、电击法、花粉管通道法和浸泡转化法的原理及其在水稻育种上的最新研究进展,比较了各种技术的特点。最后对转基因技术在水稻育种上的前景作了展望。
二、基因枪介导转化水稻花粉获得转基因植株（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、基因枪介导转化水稻花粉获得转基因植株（论文提纲范文）
（1）抗虫彩叶基因聚合表达载体构建及在毛白杨中的转化研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 抗虫转基因研究进展 |
| 1.2.1 Bt毒蛋白分类和杀虫机理 |
| 1.2.2 国内外Bt毒蛋白抗虫转基因研究进展 |
| 1.2.3 蛋白酶抑制剂基因杀虫机理 |
| 1.2.4 国内外蛋白酶抑制剂抗虫转基因研究进展 |
| 1.3 彩叶转基因研究进展 |
| 1.3.1 橙基因CmOr变色机理 |
| 1.3.2 国内外彩叶转基因研究进展 |
| 1.4 多基因聚合的研究进展 |
| 1.4.1 杂交聚合转化法 |
| 1.4.2 多次转化法 |
| 1.4.3 多载体共转化 |
| 1.4.4 多基因单载体共转化 |
| 1.5 基因工程在杨树上的研究进展 |
| 1.5.1 抗虫转基因 |
| 1.5.2 抗病转基因 |
| 1.5.3 抗除草剂转基因 |
| 1.5.4 抗逆转基因 |
| 1.6 常用转基因方法 |
| 1.6.1 农杆菌介导法 |
| 1.6.2 花粉管通道法 |
| 1.6.3 基因枪法 |
| 1.6.4 低能离子束介导法 |
| 1.6.5 超声波诱导植物组织基因转移法 |
| 1.7 转基因筛选和检测方法 |
| 1.7.1 标记基因 |
| 1.7.2 DNA水平分析 |
| 1.7.3 RNA水平分析 |
| 1.7.4 蛋白表达水平分析 |
| 1.8 研究目的与内容 |
| 1.8.1 研究目的 |
| 1.8.2 研究内容 |
| 2 多基因聚合表达载体设计与构建 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 菌株与载体 |
| 2.1.2 酶与试剂盒 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.4 培养基配制 |
| 2.1.5 抗生素配制 |
| 2.1.6 引物序列 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 载体构建 |
| 2.2.2 载体鉴定 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 植物表达载体结构图 |
| 2.3.2 载体的PCR鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 3 根癌农杆菌介导的植物表达载体在毛白杨中的遗传转化 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 遗传转化材料 |
| 3.1.2 载体 |
| 3.1.3 培养基配制 |
| 3.1.4 主要溶液配制 |
| 3.1.5 主要仪器设备 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 工程菌的制备与检测 |
| 3.2.2 毛白杨的遗传转化 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 表达载体转化农杆菌的PCR检测 |
| 3.3.2 毛白杨遗传转化 |
| 3.4 讨论 |
| 4 转基因植株的分子检测 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 检测材料 |
| 4.1.2 试验所需试剂耗材 |
| 4.1.3 主要仪器设备 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 转化植株的PCR检测 |
| 4.2.2 转基因植株的RT-PCR检测 |
| 4.2.3 转基因植株的q RT-PCR检测 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 转化植株的PCR检测 |
| 4.3.2 转基因植株的RT-PCR检测 |
| 4.3.3 转基因植株的q RT-PCR检测 |
| 4.3.4 转基因植株的扩繁与移栽 |
| 4.4 讨论 |
| 5 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 展望 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 导师简介 |
| 获得成果目录 |
| 致谢 |
（2）小麦组织特异性启动子的筛选、功能分析及应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 启动子概述 |
| 1.2 植物启动子的研究现状 |
| 1.3 小麦遗传转化 |
| 1.4 杂种优势与雄性不育 |
| 1.5 本课题研究目的和研究内容 |
| 2 小麦组织特异性基因的全基因组分析与鉴定 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果与分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 小麦组织特异性启动子的分离及在植物体中的遗传转化研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果与分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 利用组织特异性启动子构建的应用表达载体转化小麦的研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果与分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 5 OsPSG076启动子在水稻中的转化研究 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.3 实验结果与分析 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 6 水稻OsPSG076基因分析及其表达载体的遗传转化 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.3 实验结果与分析 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 本章小结 |
| 7 全文总结与展望 |
| 7.1 主要研究结果 |
| 7.2 本文的特色与创新点 |
| 7.3 课题展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录1 攻读学位期间发表的论文 |
| 附录2 主要符号与缩略词(按字母顺序) |
（3）小麦光温敏雄性不育系337S不育相关基因的遗传转化及功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 引言 |
| 2 小麦杂种优势的利用 |
| 3 雄性不育研究进展 |
| 3.1 雄性不育的主要类型 |
| 3.1.1 细胞核雄性不育(GMS) |
| 3.1.2 核质互作雄性不育(CMS) |
| 3.1.3 光温敏雄性不育(PTMS) |
| 3.2 雄性不育机理研究 |
| 3.2.1 绒毡层发育与雄性不育 |
| 3.2.2 蛋白质、糖、氨基酸、酶类、Ca2+等生理生化特征与雄性不育 |
| 3.2.3 线粒体DNA组与雄性不育 |
| 3.2.4 RNA编辑与雄性不育 |
| 4 小麦光温敏雄性不育研究进展 |
| 4.1 小麦光温敏雄性不育的种类 |
| 4.2 小麦光温敏雄性不育机理的研究 |
| 4.2.1 小麦光温敏雄性不育的细胞学特征 |
| 4.2.2 小麦光温敏雄性不育生理生化研究 |
| 4.2.3 小麦光温敏雄性不育的分子研究 |
| 5 相关基因的研究背景 |
| 5.1 植物核苷二磷酸激酶(NDPKs)的研究进展 |
| 5.2 RNA识别基序蛋白家族(orrm)研究进展 |
| 5.3 线粒体内膜转位酶复合体(TIM)的研究进展 |
| 6 小麦转基因研究进展 |
| 6.1 小麦转基因方法 |
| 6.1.1 农杆菌介导法 |
| 6.1.2 基因枪法 |
| 6.1.3 花粉管通道法 |
| 6.2 小麦外植体的选择 |
| 6.2.1 小麦幼胚 |
| 6.2.2 小麦成熟胚 |
| 6.2.3 其他外植体材料 |
| 6.3 转基因技术在小麦育种上的应用 |
| 6.3.1 小麦品质改良 |
| 6.3.2 抗性改良 |
| 7 本文研究目的与意义 |
| 第二章 小麦雄性不育相关基因的遗传转化 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 基因枪介导小麦雄性不育相关基因的遗传转化 |
| 1.1.1 受体材料 |
| 1.1.2 试剂与仪器 |
| 1.1.3 目的基因与载体 |
| 1.1.4 培养基 |
| 1.1.5 统计方法 |
| 1.1.6 小麦幼胚组织培养与基因枪轰击转化 |
| 1.1.7 基因枪轰击 |
| 1.1.7.1 质粒向大肠杆菌转化 |
| 1.1.7.2 质粒的制备 |
| 1.1.7.3 微弹的制备 |
| 1.1.7.4 基因枪轰击操作 |
| 1.1.8 转基因植株T0代PCR检测 |
| 1.1.8.1 抗性苗总DNA的提取 |
| 1.1.8.2 引物设计 |
| 1.1.8.3 PCR检测 |
| 1.2 农杆菌介导的小麦雄性不育相关基因的遗传转化 |
| 1.2.1 受体材料 |
| 1.2.2 试剂与仪器 |
| 1.2.3 目的基因与载体 |
| 1.2.4 培养基 |
| 1.2.5 统计方法 |
| 1.2.6 小麦幼胚组织培养与农杆菌转化 |
| 1.2.7 转基因植株T0代PCR检测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 不同小麦品种幼胚出愈率统计情况与分析 |
| 2.2 基因枪介导小麦幼胚遗传转化结果与分析 |
| 2.2.1 基因枪介导小麦流程 |
| 2.2.2 基因枪介导小麦遗传转化数据统计 |
| 2.2.3 基因枪介导法转化T0 代抗性苗PCR检测结果 |
| 2.3 农杆菌介导小麦幼胚遗传转化结果与分析 |
| 2.3.1 农杆菌介导小麦幼胚遗传转化流程 |
| 2.3.2 农杆菌介导小麦遗传转化数据统计 |
| 2.4 T1 代转基因小麦PCR检测鉴定 |
| 2.5 小麦转基因阳性苗性状差异 |
| 2.5.1 小麦转基因阳性苗性状数据统计 |
| 2.5.2 转基因阳性苗生长发育表型差异 |
| 3 讨论 |
| 3.1 不同基因型愈伤组织出愈情况 |
| 3.2 两种遗传转化法效果比较 |
| 3.3 三个候选基因功能的初步鉴定 |
| 第三章 拟南芥雄性不育基因的遗传转化 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 受体材料 |
| 1.2 试剂与仪器 |
| 1.3 目的基因与载体 |
| 1.3.1 目的基因 |
| 1.3.2 载体 |
| 1.4 培养基 |
| 1.5 试验方法 |
| 1.6 转基因植株PCR检测 |
| 1.6.1 植物DNA提取 |
| 1.6.2 植物RNA提取 |
| 1.7 拟南芥性状统计 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 拟南芥遗传转化实验流程 |
| 2.2 拟南芥T2 代筛选单拷贝数据分析 |
| 2.3 拟南芥RNA检测结果 |
| 2.4 转基因拟南芥表型差异 |
| 2.4.1 转TaMS337S-3 基因T3 代拟南芥植物学性状统计分析 |
| 2.4.2 转TaMS337S-4 基因T2 代拟南芥植物学性状统计分析 |
| 2.4.3 转TaMS337S-5 基因T3 代拟南芥植物学性状统计分析 |
| 3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（4）小麦光温敏不育系337S的育性相关基因miR2275及其靶基因CAF1的克隆与遗传转化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 前言 |
| 1.1 课题研究背景 |
| 1.2 植物雄性不育研究进展 |
| 1.2.1 细胞质雄性不育 |
| 1.2.2 细胞核雄性不育 |
| 1.2.3 光温敏雄性不育 |
| 1.3 植物miRNA的研究进展 |
| 1.3.1 植物miRNA的生物合成和作用机制 |
| 1.3.2 植物miRNA的靶标鉴定方法 |
| 1.3.3 植物miRNA的功能研究 |
| 1.3.4 植物育性相关miRNA的研究进展 |
| 1.4 CAF1蛋白研究进展 |
| 1.4.1 CAF1蛋白结构 |
| 1.4.2 CAF1蛋白功能 |
| 1.4.3 CAF1蛋白亚细胞定位研究 |
| 1.5 小麦转基因技术研究进展 |
| 1.5.1 小麦遗传转化方法 |
| 1.5.2 小麦转基因技术的应用 |
| 1.6 研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物体材料 |
| 2.1.2 质粒与菌株 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.1.4 仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 基因组DNA的提取(CTAB法) |
| 2.2.2 电泳检测 |
| 2.2.3 小麦miRNA前体序列的扩增 |
| 2.2.4 miRNA超表达载体的构建 |
| 2.2.5 小麦幼胚愈伤的遗传转化 |
| 2.2.6 小麦转基因植株的检测 |
| 2.2.7 miR2275靶基因CAF1的克隆 |
| 2.2.8 融合蛋白表达载体的构建 |
| 2.2.9 CAF1蛋白亚细胞定位 |
| 2.2.10 CAF1蛋白的原核表达 |
| 2.2.11 启动子-GUS融合表达载体的构建 |
| 2.2.12 拟南芥的转化筛选 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 小麦候选miRNA的克隆 |
| 3.1.1 miR2275的系统进化分析 |
| 3.2 小麦幼胚愈伤的遗传转化 |
| 3.2.1 不同小麦品种幼胚出愈率情况统计分析 |
| 3.2.2 基因枪介导的小麦转基因植株的获得 |
| 3.2.3 基因枪介导的miR2275的遗传转化 |
| 3.2.4 农杆菌介导的小麦转基因植株的获得 |
| 3.2.5 农杆菌介导的miRNA的遗传转化 |
| 3.3 转基因抗性苗初步的PCR鉴定 |
| 3.4 miR2275靶基因CAF1的克隆 |
| 3.5 小麦CAF1同源基因的生物信息学分析 |
| 3.5.1 CAF1基因的序列分析 |
| 3.5.2 CAF1蛋白基本理化性质分析 |
| 3.5.3 CAF1蛋白的跨膜区域和信号肽预测 |
| 3.5.4 CAF1蛋白结构预测 |
| 3.5.5 CAF1蛋白同源比对与系统进化 |
| 3.6 CAF1蛋白的亚细胞定位 |
| 3.7 CAF1蛋白的原核表达 |
| 3.7.1 原核表达载体的构建 |
| 3.7.2 目的蛋白的诱导表达 |
| 3.8 启动子-GUS融合表达载体的构建及拟南芥转化筛选 |
| 3.9 拟南芥T_1代植株检测 |
| 3.10 转基因小麦后代表型差异 |
| 4 讨论 |
| 4.1 小麦转化效率的影响因素 |
| 4.2 miR2275可能调控小麦337S的育性 |
| 4.3 小麦CAF1功能的初步分析 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（5）玉米Ac/Ds转座体系的构建及二穗短柄草BdSOC1-like基因功能的初步分析（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 玉米简介 |
| 1.2 玉米遗传转化技术的发展 |
| 1.2.1 原生体法 |
| 1.2.2 基因枪法 |
| 1.2.3 电击法、碳化硅晶体法和气溶胶注射法 |
| 1.2.4 农杆菌法 |
| 1.3 玉米转座子 |
| 1.3.1 玉米转座子的发现 |
| 1.3.2 转座子的类型 |
| 1.3.2.1 Ac/Ds转座子系统 |
| 1.3.2.2 Mu转座子系统 |
| 1.3.2.3 En/Spm转座子系统 |
| 1.4 玉米突变体的发展现状 |
| 1.4.1 理化诱变技术 |
| 1.4.2 CRISPR/Cas9 基因编辑法 |
| 1.4.3 插入诱变 |
| 1.4.3.1 T-DNA插入法 |
| 1.4.3.2 转座子标签法 |
| 1.5 SOC1 基因调控植物开花的研究现状 |
| 1.6 本课题的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料及其生长条件 |
| 2.1.2 质粒与菌株 |
| 2.1.3 酶及生化试剂 |
| 2.1.4 引物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 玉米遗传转化相关表达载体的构建 |
| 2.2.1.1 感受态的制备 |
| 2.2.1.2 植物总RNA的提取 |
| 2.2.1.3 cDNA反转录 |
| 2.2.1.4 Pfu高保真酶PCR扩增 |
| 2.2.1.5 胶回收 |
| 2.2.1.6 TA克隆 |
| 2.2.1.7 转化大肠杆菌 |
| 2.2.1.8 提取质粒 |
| 2.2.1.9 将克隆的DNA目的片段连接到植物表达载体 |
| 2.2.1.10 转化大肠杆菌 |
| 2.2.1.11 提取质粒(试剂盒法) |
| 2.2.1.12 农杆菌AGL1或EHA105 的转化 |
| 2.2.2 基因枪法转化玉米 |
| 2.2.2.1 诱导愈伤 |
| 2.2.2.2 基因枪质粒制备 |
| 2.2.2.3 基因枪微弹的制备 |
| 2.2.2.4 基因枪设备 |
| 2.2.2.5 基因枪轰击玉米愈伤组织 |
| 2.2.2.6 GFP阳性幼苗的再生 |
| 2.2.2.7 GFP阳性植株的分子分析 |
| 2.2.2.8 GFP阳性植株的F1 代分析 |
| 2.2.3 农杆菌介导的玉米遗传转化 |
| 2.2.3.1 农杆菌侵染液的准备 |
| 2.2.3.2 幼胚的处理 |
| 2.2.3.3 侵染与共培养处理 |
| 2.2.3.4 恢复培养 |
| 2.2.3.5 GFP阳性幼苗的再生 |
| 2.2.3.6 GFP阳性植株的PCR和 RT-PCR分析 |
| 2.2.3.7 Southern杂交 |
| 2.2.3.8 GFP阳性植株的F1 代分析 |
| 2.2.4 玉米Ac/Ds突变体库的构建与分析 |
| 2.2.4.1 转基因系T0代Ac转座酶基因的表达分析 |
| 2.2.4.2 玉米DNA的提取(试剂盒法) |
| 2.2.4.3 T-DNA定位 |
| 2.2.4.4 转基因系T0代fDs的体细胞转座分析 |
| 2.2.4.5 fDs插入突变植株的鉴定与富集 |
| 2.2.4.6 fDs新插入位置的定位分析 |
| 2.2.5 二穗短柄草SOC1-like(BdSOC1-like)功能的初步分析 |
| 2.2.5.1 序列比对及进化分析 |
| 2.2.5.2 qRT-PCR分析 |
| 2.2.5.3 BdSOC1-like超表达载体(BdSOC1-like-ox)的构建 |
| 2.2.5.4 二穗短柄草的遗传转化 |
| 2.2.5.5 PCR |
| 2.2.5.6 pXQD17 阳性后代的遗传分析 |
| 2.2.5.7 开花时间分析 |
| 2.2.5.8 种子特点分析 |
| 2.2.6 统计分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 本研究相关表达载体的构建 |
| 3.2 玉米遗传转化 |
| 3.2.1 基因枪法转化玉米 |
| 3.2.1.1 GFP辅助筛选抗性愈伤和抗性芽及植株 |
| 3.2.1.2 基因枪法介导的玉米转化频率 |
| 3.2.1.3 GFP阳性植株的分子鉴定 |
| 3.2.1.4 GFP阳性植株中GFP的拷贝数分析 |
| 3.2.1.5 GFP阳性植株的F1 代分析 |
| 3.2.2 农杆菌介导的玉米转化 |
| 3.2.2.1 两种共培养法(DC和 MC)对玉米瞬时转化效率的影响对比 |
| 3.2.2.2 T0 GFP阳性幼苗的再生及初步分析 |
| 3.2.2.3 两种共培养法(DC和 MC)对玉米再生和稳定转化效率的影响 |
| 3.2.2.4 GFP阳性植株的F1 分析 |
| 3.3 玉米Ac/Ds突变体库的构建与分析 |
| 3.3.1 pXQD70 阳性植株的T0 分析 |
| 3.3.1.1 Ac转座酶基因的表达分析 |
| 3.3.1.2 T0 体细胞fDs转座分析 |
| 3.3.2 pXQD70 阳性株系后代的筛选 |
| 3.3.3 F1 fDs转座印迹分析 |
| 3.3.4 非连锁转座的大规模富集 |
| 3.3.5 fDs插入位置在染色体上的分布 |
| 3.3.6 突变体表型分析 |
| 3.4 BdSOC1-like基因功能的初步分析 |
| 3.4.1 BdSOC1-like基因的生物信息学分析及分子克隆 |
| 3.4.2 BdSOC1-like的空间表达分析 |
| 3.4.3 BdSOC1-like的表达并没有昼夜节律性 |
| 3.4.4 冷处理对BdSOC1-like mRNA水平的影响 |
| 3.4.5 BdSOC1-like超表达(BdSOC1-like-ox)阳性株系T0 的分子分析 |
| 3.4.6 BdSOC1-like-ox阳性株系T1 后代的分离分析 |
| 3.4.7 BdSOC1-like超表达能促进植物的成花转变 |
| 3.4.8 超表达BdSOC1-like产生了多效性表型 |
| 4 讨论 |
| 4.1 在玉米的遗传转化中,GFP荧光是一种可靠的可视化标签 |
| 4.2 干滤纸共培养法能显着提高玉米的转化效率 |
| 4.3 有效的玉米遗传转化系统仍然需要改善 |
| 4.4 Ac/Ds系统的工作情况 |
| 4.5 BdSOC1-like基因功能的初步研究 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（6）黄瓜Tril基因转化及再生体系优化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 植物遗传转化研究进展 |
| 1.1.1 植物遗传转化研究进展 |
| 1.1.2 植物遗传转化方法 |
| 1.2 单子叶植物转化研究进展 |
| 1.2.1 水稻 |
| 1.2.2 玉米 |
| 1.3 双子叶植物转化研究进展 |
| 1.3.1 烟草 |
| 1.3.2 拟南芥 |
| 1.3.3 番茄 |
| 1.4 黄瓜离体再生研究进展 |
| 1.4.1 黄瓜离体再生研究进展 |
| 1.4.2 黄瓜离体再生影响因素 |
| 1.5 黄瓜遗传转化研究进展 |
| 1.5.1 黄瓜遗传转化研究进展 |
| 1.5.2 黄瓜遗传转化影响因素 |
| 1.5.3 转基因结果的鉴定 |
| 1.6 本研究的目的与意义 |
| 第二章 黄瓜表皮毛Tril基因的遗传转化 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要实验器具 |
| 2.1.4 Tril表达载体的构建 |
| 2.1.5 组培培养基配方 |
| 2.1.6 无菌苗以及外植体的获得 |
| 2.1.7 农杆菌介导遗传转化 |
| 2.1.8 转基因植株的移栽驯化和分子检测 |
| 2.1.9 出芽率、生根率和转化率的计算 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 35S-TrilCDS载体遗传转化结果检测 |
| 2.2.2 Pro-TrilCDS载体遗传转化结果检测 |
| 2.3 本章小结 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 黄瓜离体再生体系的优化 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 分化培养基6-BA最适浓度 |
| 3.2.2 生根培养基Kan最适浓度 |
| 3.2.3 三种不同Kan筛选方式的比较 |
| 3.3 本章小结 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 结束语 |
| 4.1 主要工作与创新点 |
| 4.2 后续研究工作 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间已发表或录用的论文 |
（7）农杆菌介导的大豆遗传转化方法优化及KN1和GID1基因对大豆再生和遗传转化效率的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 国内外大豆转基因研究进展 |
| 1.1 大豆转基因转化方法的研究进展 |
| 1.1.1 农杆菌介导法 |
| 1.1.2 花粉管通道法 |
| 1.1.3 基因枪转化法 |
| 1.1.4 电激法 |
| 1.2 农杆菌介导法转化大豆的影响因素 |
| 1.2.1 受体材料 |
| 1.2.2 外植体 |
| 1.2.3 农杆菌菌株侵染能力及菌株活性 |
| 1.2.4 培养基成分 |
| 1.2.5 促进再生的相关基因 |
| 2 细胞分裂素对植株生长的影响 |
| 2.1 细胞分裂素研究进展 |
| 2.1.1 细胞分裂素生物合成和代谢 |
| 2.1.2 细胞分裂素信号传导途径 |
| 2.1.3 细胞分裂素对植株生长发育的影响 |
| 2.2 转录因子KNOX发现 |
| 2.3 转录因子KNOX的调控 |
| 2.3.1 转录因子KNOX的调控网络 |
| 2.3.2 转录因子KNOX与其他激素的相互作用 |
| 2.4 KNOX基因在植物中的作用 |
| 2.5 KNOX基因在植物遗传转化中的作用 |
| 2.5.1 作为内源激素基因 |
| 2.5.2 作为新的筛选标记 |
| 3 赤霉素受体蛋白GID1研究进展 |
| 3.1 赤霉素研究进展 |
| 3.1.1 赤霉素生物合成途径 |
| 3.1.2 赤霉素信号传导途径 |
| 3.1.3 其他激素对赤霉素的调控 |
| 3.2 赤霉素受体蛋白GID1研究进展 |
| 3.2.1 赤霉素受体的发现 |
| 3.2.2 赤霉素受体的研究进展 |
| 4 本研究目的、意义及内容 |
| 4.1 本研究的目的和意义 |
| 4.2 本研究主要内容 |
| 5 本研究技术路线 |
| 5.1 农杆菌介导的大豆转化体系优化 |
| 5.2 细胞分裂素相关基因KN1对大豆再生和转化效率及植株表型的影响 |
| 5.3 赤霉素受体基因GmGID1s对大豆再生和转化效率的影响及功能分析 |
| 第二章 农杆菌介导的大豆转化体系优化 |
| 1 材料及试剂 |
| 1.1 大豆品种 |
| 1.2 载体及菌株 |
| 1.3 主要仪器及试剂 |
| 1.3.1 试验仪器设备 |
| 1.3.2 主要激素和试剂 |
| 1.4 培养基 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 农杆菌介导的大豆遗传转化流程图 |
| 2.2 农杆菌介导的大豆遗传转化步骤 |
| 2.2.1 大豆种子的挑选及消毒 |
| 2.2.2 大豆种子的吸胀 |
| 2.2.3 农杆菌的活化及侵染液的制备 |
| 2.2.4 外植体的制备与农杆菌侵染 |
| 2.2.5 共培养及侵染效率统计 |
| 2.2.6 丛生芽诱导 |
| 2.2.7 不定芽伸长 |
| 2.2.8 幼苗生根 |
| 2.2.9 幼苗的移栽与驯化 |
| 2.2.10 阳性苗和阳性后代的检测方法及阳性后代拷贝数计算方法 |
| 2.2.11 阳性苗收种、繁殖 |
| 3 影响大豆遗传转化效率的因素试验设计 |
| 3.1 影响农杆菌侵染效率的因素试验设计 |
| 3.1.1 农杆菌重悬液中是否添加DTT比较试验 |
| 3.1.2 农杆菌不同收菌浓度比较试验 |
| 3.1.3 外植体不同获取方式比较试验 |
| 3.1.4 不同共培养时间比较试验 |
| 3.1.5 不同大豆品种比较试验 |
| 3.2 影响大豆丛生芽伸长率和转化效率的因素试验设计 |
| 3.2.1 不同浓度赤霉素和生长素组合的比较试验 |
| 3.2.2 是否添加抗氧化剂AgNO_3或Vc的比较试验 |
| 3.3 数据统计分析 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 不同因素对农杆菌侵染效率的影响 |
| 4.1.1 重悬液是否添加DTT对农杆菌侵染效率的影响 |
| 4.1.2 农杆菌不同收菌浓度对农杆菌侵染效率的影响 |
| 4.1.3 不同外植体获取方式对农杆菌侵染效率的影响 |
| 4.1.4 共培养不同时间对农杆菌侵染效率的影响 |
| 4.1.5 不同大豆品种对农杆菌侵染效率的影响 |
| 4.2 不同因素对大豆丛生芽伸长率和转化效率的影响 |
| 4.2.1 不同激素组合对大豆丛生芽伸长率和转化效率的影响 |
| 4.2.2 添加抗氧化剂对大豆丛生芽伸长率和转化效率的影响 |
| 5 转基因后代的检测方法比较及外源基因拷贝数的检测 |
| 5.1 对比不同方法检测转基因阳性苗 |
| 5.2 绝对定量PCR检测转基因植株外源基因的拷贝数 |
| 6 讨论 |
| 6.1 添加抗氧化剂DTT与农杆菌侵染效率的关系 |
| 6.2 农杆菌生长周期与农杆菌侵染效率的关系 |
| 6.3 大豆外植体获取方式的选择 |
| 6.4 共培养时间与农杆菌侵染效率的关系 |
| 6.5 不同大豆品种与农杆菌侵染效率的关系 |
| 6.6 GA_3及IAA与大豆丛生芽伸长率和转化效率的关系 |
| 6.7 抗氧化剂AgNO_3和Vc与大豆丛生芽伸长率和转化效率的关系 |
| 6.8 阳性植株的鉴定方法及外源基因拷贝数检测方法比较 |
| 第三章 KN1基因对大豆再生和遗传转化效率及植株表型的影响 |
| 1 试验材料与试剂 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 大豆受体品种 |
| 1.1.2 菌株和质粒 |
| 1.2 试验试剂 |
| 1.2.1 工具酶和试剂盒 |
| 1.2.2 PCR引物和测序 |
| 1.2.3 常用培养基和配制方法 |
| 1.3 试验仪器设备 |
| 2 试验方法与试验设计 |
| 2.1 载体pCAMBIA3301-35S-NOS的构建 |
| 2.1.1 片段35S-NOS获得 |
| 2.1.2 35S-NOS连入载体pCAMBIA3301 |
| 2.2 植物双元表达载体pCAMBIA3301-35S-KN1-NOS的构建 |
| 2.2.1 目的基因KN1的获得 |
| 2.2.2 重组质粒pCAMBIA3301-35S-KN1-NOS的构建 |
| 2.2.3 重组质粒的筛选和测序验证 |
| 2.2.4 菌种保存 |
| 2.3 转化根癌农杆菌 |
| 2.3.1 根癌农杆菌EHA105感受态细胞的制备 |
| 2.3.2 重组质粒转化EHA105感受态细胞 |
| 2.3.3 重组质粒pCAMBIA3301-35S-KN1-NOS的PCR鉴定 |
| 2.3.4 菌种保存 |
| 2.4 农杆菌介导的大豆子叶节转化 |
| 2.5 过表达KN1对大豆再生和转化效率的影响 |
| 2.5.1 培养基中细胞分裂素类激素添加与否的比较试验 |
| 2.5.2 不同草丁膦筛选浓度下对大豆丛生芽伸长率和转化效率的影响 |
| 2.6 过表达KN1转基因后代表型分析 |
| 2.7 统计学分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 植物表达载体的构建 |
| 3.2 KN1基因对大豆遗传转化的影响 |
| 3.2.1 KN1基因在芽诱导时期(SI)对丛生芽的影响 |
| 3.2.2 KN1基因在芽伸长时期(SE)对芽伸长的影响 |
| 3.2.3 不同草丁膦筛选浓度下KN1基因对丛生芽伸长率和转化率的影响 |
| 3.3 过表达KN1基因大豆阳性后代植株的表型 |
| 3.3.1 T_0代过表达KN1基因阳性苗和转对照载体阳性苗的比较 |
| 3.3.2 T_1代过表达KN1基因阳性苗和转对照载体阳性苗的比较 |
| 3.3.3 T_2代过表达KN1基因阳性苗和转对照载体阳性苗的比较 |
| 3.3.4 T_2代过表达KN1基因植株中KN1的表达量分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 KN1基因对大豆再生和转化效率的影响 |
| 4.2 KN1基因对植株表型的影响 |
| 第四章 大豆赤霉素受体基因GmGID1s对大豆遗传转化效率及植株表型的影响 |
| 1 试验材料、试剂与仪器 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 工具酶和试剂盒 |
| 1.2.1 工具酶和试剂盒 |
| 1.2.2 菌株和质粒 |
| 1.2.3 PCR引物和测序 |
| 1.2.4 常用培养基和配制方法 |
| 1.3 所用试验仪器 |
| 2 试验方法及试验设计 |
| 2.1 GmGID1s基因的筛选 |
| 2.2 GmGID1s基因的序列分析 |
| 2.3 GmGID1s基因的表达分析 |
| 2.4 植物总RNA的提取 |
| 2.5 荧光定量PCR |
| 2.6 数据分析方法 |
| 2.7 植物双元表达载体pCAMBIA3301-35S-GID1-NOS的构建 |
| 2.7.1 目的基因GmGID1s的获得 |
| 2.7.2 重组质粒pCAMBIA3301-35S-GID1-NOS的构建 |
| 2.7.3 重组质粒的筛选和测序验证 |
| 2.7.4 菌种保存 |
| 2.8 转化根癌农杆菌 |
| 2.9 农杆菌介导的大豆子叶节转化 |
| 2.10 GmGID1s对大豆丛生芽伸长率和遗传转化效率的影响试验设计 |
| 2.11 过表达GmGID1s基因对植株表型的影响 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 大豆GmGID1s基因的生物信息学分析 |
| 3.2 赤霉素处理后GmGID1s的表达量分析 |
| 3.3 植物表达载体的构建 |
| 3.4 GmGID1s基因对大豆遗传转化的影响 |
| 3.4.1 GmGID1s对大豆丛生芽伸长率和转化效率的影响 |
| 3.4.2 GmGID1-2在不同草丁膦筛选浓度下对伸长率和转化效率的影响 |
| 3.5 过表达GmGID1-2基因对大豆外植物和后代植株表型的影响 |
| 3.5.1 过表达GmGID1-2基因在转化过程中对外植体表型的影响 |
| 3.5.2 过表达GmGID1-2基因对大豆植株表型的影响 |
| 4 讨论 |
| 全文结论 |
| 本研究创新之处 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 大豆组织培养各培养基成分 |
| 附录2 试验方法 |
| 攻读博士学位期间发表论文和申请专利 |
| 致谢 |
（8）水稻OsWDRP3基因功能的初步探究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 第一章 前言 |
| 1 WD40-repeat蛋白的研究进展 |
| 1.1 WD40-repeat蛋白的分子结构 |
| 1.2 WD40-repeat蛋白的作用机制 |
| 1.3 植物中WD40-repeat蛋白的生物学功能 |
| 2 CRISPR/Cas9系统 |
| 2.1 CRISPR/Cas系统的研究进展 |
| 2.2 CRISPR/Cas系统的结构和类型 |
| 2.3 CRISPR/Cas9系统的作用机制 |
| 2.4 CRISPR/Cas9基因编辑技术在植物中的应用 |
| 3 RNA干扰 |
| 3.1 RNA干扰的发现与作用机制 |
| 3.2 siRNA和miRNA |
| 3.3 amiRNA及其应用 |
| 4 农杆菌介导的植物遗传转化 |
| 4.1 农杆菌介导遗传转化的作用机理 |
| 4.2 农杆菌介导水稻的遗传转化 |
| 5 本课题的研究目的和意义 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 植物材料 |
| 1.2 载体与菌株 |
| 1.3 培养基 |
| 1.4 引物名称与序列 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 重组质粒的构建 |
| 2.1.1 OsWDRP3-CRISPR/Cas9重组质粒的构建 |
| 2.1.2 OsWDRP3过量表达载体的构建 |
| 2.1.3 OsWDRP3- GFP载体构建 |
| 2.1.4 pET-28a-OsWDRP3蛋白表达载体构建 |
| 2.1.5 OsWDRP3启动子分析载体构建 |
| 2.1.6 BIFC载体构建 |
| 2.2 水稻的遗传转化 |
| 2.2.1 水稻胚性愈伤组织的诱导和继代培养 |
| 2.2.2 利用农杆菌转化水稻胚性愈伤组织 |
| 2.3 水稻转基因植株的鉴定 |
| 2.3.1 转基因水稻DNA水平的鉴定 |
| 2.3.2 转基因水稻RNA水平的鉴定 |
| 2.4 水稻花粉活力的检测 |
| 2.4.1 I_2-KI染色法 |
| 2.5 转基因水稻植株表型的观察,统计和拍照 |
| 2.6 OsWDRP3基因的表达模式分析 |
| 2.7 mRNA原位杂交 |
| 2.8 OsWDRP3细胞定位分析 |
| 2.9 双分子荧光互补实验(BIFC) |
| 2.10 原核表达和蛋白纯化 |
| 第三章 实验结果 |
| 1 重组质粒的构建与鉴定 |
| 1.1 OsWDRP3-CRISPR/Cas9载体的构建 |
| 1.2 OsWDRP3-OE载体的构建 |
| 1.3 OsWDRP3-GFP载体构建 |
| 1.4 pET-28a(+)-OsWDRP3蛋白表达载体构建 |
| 1.5 OsWDRP3启动子克隆和载体构建 |
| 1.6 BIFC载体构建 |
| 1.6.1 35S::OsWDRP3-YFP~N载体构建 |
| 1.6.2 35S::OsBAK1-ICD-YFP~C载体构建 |
| 2 水稻的遗传转化 |
| 3 OsWDRP3-CRISPR/Cas9转基因植株的鉴定和表型观察 |
| 3.1 OsWDRP3-1-CRISPR/Cas9转基因植株的鉴定和表型观察 |
| 3.1.1 T0代转基因植株基因组水平鉴定 |
| 3.1.2 T1代转基因植株的鉴定和表型观察 |
| 3.1.3 T2代转基因植株的鉴定和表型观察 |
| 3.2 OsWDRP-2-CRISPR/Cas9转基因植株的鉴定和表型观察 |
| 3.2.1 T0代转基因植株基因组水平鉴定 |
| 3.2.2 T1代转基因植株的鉴定和表型观察 |
| 4 OsWDRP3-RNAi转基因植株的鉴定和表型观察 |
| 4.1 T3代转基因植株的鉴定和表型观察 |
| 5 OsWDRP3基因的表达模式分析 |
| 5.1 相对定量PCR分析OsWDRP3基因的表达 |
| 6 mRNA原位杂交分析OsWDRP3基因的表达 |
| 6.1 pGEMT-OsWDRP3 probe的构建 |
| 6.2 OsWDRP3的时空表达 |
| 7 OsWDRP3的细胞定位 |
| 7.1 基因枪法转化洋葱表皮细胞 |
| 8 BIFC分析OsWDRP3与OsBAK1-ICD的相互作用 |
| 9 ABA、NaCl、PEG处理下OsWDRP3在水稻中的表达 |
| 10 OsWDRP3蛋白的诱导和纯化 |
| 10.1 OsWDRP3蛋白的诱导 |
| 10.2 OsWDRP3蛋白的纯化 |
| 第四章 讨论 |
| 1 OsWDRP3基因可能的生物学功能 |
| 2 OsWDRP3基因功能的进一步研究策略 |
| 参考文献 |
| 攻硕期间发表的论文 |
| 附录 |
| 1 AAM培养基中各成分母液的配制方法 |
| 2 各种培养基的配方 |
| 3 各种抗生素的配方 |
| 4 各种激素母液的配方 |
| 5 转基因水稻植株获得的图版及图版说明 |
| 致谢 |
（9）小麦规模化转基因技术体系构建及其应用（论文提纲范文）
| 1 构建小麦转基因技术体系的必要性 |
| 2 国内外小麦转基因技术体系研究进展 |
| 2.1 小麦遗传转化方法 |
| 2.1.1 基因枪介导法 |
| 2.1.2 农杆菌介导法 |
| 2.1.3 花粉管通道法 |
| 2.2 小麦遗传转化利用的主要外植体 |
| 3 中国近期小麦规模化转基因技术体系构建和应用 |
| 3.1 小麦成熟胚再生体系改进 |
| 3.2 小麦幼胚再生体系及其转化体系改进 |
| 3.3 小麦再生与转化相关基因克隆 |
| 3.4 小麦转基因技术体系应用 |
| 4 小麦规模化转基因技术主要发展趋势 |
| 4.1 多基因转化 |
| 4.2 无标记基因转化 |
| 4.3 提高转化效率 |
| 5 问题与展望 |
（10）转基因技术及其在水稻育种中的研究进展（论文提纲范文）
| 1 载体介导的转基因技术 |
| 1.1 农杆菌介导转化法 |
| 1.1.1 转化原理 |
| 1.1.2 农杆菌介导的转基因技术在水稻育种上的应用 |
| 2 基因直接导入的转基因技术 |
| 2.1 基因枪转化法 |
| 2.2 PEG介导转化法 |
| 2.3 电击导入法 |
| 3 种质系统技术 |
| 3.1 花粉管通道法 |
| 3.2 DNA浸泡转化法 |
| 4 常用水稻转基因方法特点比较 |
| 5 转基因技术在水稻育种上存在的问题及展望 |
四、基因枪介导转化水稻花粉获得转基因植株（论文参考文献）
- [1]抗虫彩叶基因聚合表达载体构建及在毛白杨中的转化研究[D]. 周静. 北京林业大学, 2020
- [2]小麦组织特异性启动子的筛选、功能分析及应用研究[D]. 苏佩佩. 华中科技大学, 2019
- [3]小麦光温敏雄性不育系337S不育相关基因的遗传转化及功能分析[D]. 姜明珠. 华中农业大学, 2019(02)
- [4]小麦光温敏不育系337S的育性相关基因miR2275及其靶基因CAF1的克隆与遗传转化[D]. 宋瑞莲. 华中农业大学, 2019(02)
- [5]玉米Ac/Ds转座体系的构建及二穗短柄草BdSOC1-like基因功能的初步分析[D]. 段学清. 山东农业大学, 2019(01)
- [6]黄瓜Tril基因转化及再生体系优化[D]. 肖婷婷. 上海交通大学, 2019(06)
- [7]农杆菌介导的大豆遗传转化方法优化及KN1和GID1基因对大豆再生和遗传转化效率的影响[D]. 李姝璇. 南京农业大学, 2018(05)
- [8]水稻OsWDRP3基因功能的初步探究[D]. 滕慧娟. 武汉大学, 2017(06)
- [9]小麦规模化转基因技术体系构建及其应用[J]. 叶兴国,徐惠君,杜丽璞,何光源,王轲,林志珊. 中国农业科学, 2014(21)
- [10]转基因技术及其在水稻育种中的研究进展[J]. 肖小君,王辉,齐泽民,黄作喜. 井冈山大学学报(自然科学版), 2011(05)