导读:本文包含了隐秘机制论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:木犀草素,化脓隐秘杆菌,抗菌机制
隐秘机制论文文献综述
郭玉茹,王如霞,裘鹏,张德显,汉丽梅[1]（2019）在《木犀草素对化脓隐秘杆菌的抗菌机制研究》一文中研究指出[目的]本研究旨在探究木犀草素对化脓隐秘杆菌的抗菌机制。[方法]通过测定亚抑菌浓度(1/2MIC)木犀草素作用化脓隐秘杆菌前后,胞外碱性磷酸酶(AKP)含量变化、邻-硝基苯酚(ONP)含量和N-苯基-1-萘胺(NPN)荧光强度变化、碘化丙啶(PI)染色观察、透射电镜观察细菌超微结构等,分析木犀草素对细菌细胞膜通透性及细胞壁完整性的影响;利用BCA法测定菌体总蛋白,结合SDS-PAGE,初步分析木犀草素对细菌总蛋白的影响;通过4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色后的荧光显微镜观察,以及拓扑异构酶活性测定结果,分析木犀草素对化脓隐秘杆菌核酸的影响。[结果]亚抑菌浓度木犀草素作用化脓隐秘杆菌后,细胞外AKP含量显着增加,ONP含量和NPN荧光强度均显着增加,木犀草素作用后细胞能被PI红染,透射电镜观察到细胞表面粗糙不平,细胞壁部分缺失,细胞失去正常形态并且有胞内物质泄露;细菌总蛋白含量显着降低,且由SDS-PAGE图谱可以看出绝大数蛋白质表达量发生下调,个别蛋白质表达量发生上调;木犀草素作用后细胞的DAPI染色荧光微弱,木犀草素能够抑制化脓隐秘杆菌拓扑异构酶Ⅰ和Ⅱ的活性。[结论]木犀草素可通过破坏化脓隐秘杆菌细胞膜和细胞壁的完整性、影响蛋白质的合成、抑制核酸的合成等机制而发挥强大的抗化脓隐秘杆菌作用。(本文来源于《中国畜牧兽医学会兽医药理毒理学分会第十五次学术讨论会论文集》期刊2019-10-13）
王冰[2]（2019）在《化脓隐秘杆菌溶血素激活巨噬细胞NF-κB系统机制的研究》一文中研究指出化脓隐秘杆菌(Trueperella pyogenes,T.pyogenes)是一种常见于动物呼吸道、消化道黏膜和乳房的共生性细菌。同时,T.pyogenes也是一种条件性致病菌。当动物处于应激性状态下时,T.pyogenes能引起动物发生多种炎症疾病。化脓隐秘杆菌溶血素(Pyolysin,PLO)是T.pyogenes分泌的唯一一种溶血素,是一种胆固醇依赖性溶细胞素(Cholesterol-dependent cytolysin,CDCs),也是一种成孔毒素(Pore-forming toxin,PFT)。已有研究表明,PLO接种小鼠可以引发炎症。但是,PLO导致炎症的机制仍不明确,而阐明其引发炎症的机制对于全面揭示T.pyogenes的致病机制有一定的积极意义。本研究表达纯化了重组PLO(Recombinant PLO,rPLO)、突变体蛋白rPLO W497F和rPLO D238R,以及截短蛋白rPLO D123、rPLO D4和rPLO D4 W497F,并对它们的溶血活性进行分析。结果表明rPLO的溶血活性最强,其次为rPLO D238R,rPLO W497F及截短蛋白rPLO D123、rPLO D4和rPLO D4 W497F几乎没有溶血活性。用不同浓度的重组蛋白处理J774A.1细胞检测细胞毒性结果表明,rPLO蛋白在30-60 ng/mL浓度范围内细胞毒性较低,而随着浓度的增加细胞毒性逐渐增强;突变体蛋白rPLO W497F及rPLO D238R几乎不表现细胞毒性。重组蛋白处理与钙离子(Calcium,Ca~(2+))荧光探针孵育的J774A.1细胞,结果表明亚裂解剂量rPLO处理的细胞内Ca~(2+)浓度下降,rPLO D238R和rPLO W497F处理的细胞中Ca~(2+)浓度显着高于rPLO处理的细胞。用含有不同浓度Ca~(2+)的细胞外液与rPLO共处理细胞,结果表明当细胞外液中含有1 mmol/L Ca~(2+)时,rPLO处理可以导致细胞中的Ca~(2+)浓度下降;当细胞外液中Ca~(2+)浓度低于正常浓度时,rPLO作用可以导致细胞中的Ca~(2+)浓度上调。用不同浓度的rPLO处理J774A.1细胞0.5 h,检测表明30-60 ng/mL的rPLO对细胞钙蛋白酶(Calpain,CAPN)的活性没有明显的影响,当时间延长至2 h时,细胞内CAPN活性被显着地抑制。用亚裂解剂量的rPLO处理J774A.1细胞,western-blot检测表明rPLO可以显着抑制NF-κB p65的磷酸化及NFATc1的表达,并且处理细胞0.5 h就能表现显着的抑制效果;rPLO D238R和rPLO W497F处理组的细胞中NF-κB p65的磷酸化水平及NFATc1的表达有所上调。用亚裂解剂量的rPLO与不同浓度Ca~(2+)外液共同处理J774A.1细胞,结果表明在含有1 mmol/L CaCl_2的RPMI1640培养基中,由rPLO导致的细胞中NF-κB p65磷酸化水平降低的现象有所缓解,NFATc1的表达水平上调。用亚裂解剂量的rPLO处理J774A.1细胞,检测细胞中非经典NF-κB信号通路中几个关键性蛋白,结果表明在0.5 h时NIK及p52的含量增加,p100与IKKα/β的磷酸化水平提高。用不同重组蛋白处理小鼠骨髓源性巨噬细胞(Bone marrow derived macrophages,BMDMs),检测细胞中钙调神经磷酸酶(Calcineurin,CN)的活性,结果表明所有重组蛋白均不会显着影响细胞中CN活性。用不同蛋白处理BMDMs,结果表明rPLO可以刺激细胞产生大量的IL-1β;rPLO W497F及rPLO D123可以刺激细胞产生大量的IL-10。然后用重组蛋白刺激tlr4基因缺失的BMDMs(BMDMs~(tlr4-)),结果表明rPLO仍可刺激细胞产生大量的IL-1β;而rPLO W497F和rPLO D123对IL-10诱导能力由于tlr4基因的缺失受到完全抑制。用PLO蛋白D123结构域的截短多肽处理BMDMs,结果表明rPLO 95-156可以上调BMDMs中IL-10的大量表达。综上所述,本实验证明了PLO作用巨噬细胞(Macrophages,Mφ)可以通过两种方式影响NF-κB信号通路。当PLO维持完整的结构和功能时,可以通过“成孔活性”激活非经典NF-κB信号通路;而在细胞膜结合功能受损的情况下,PLO表现“PAMPs样活性”通过刺激MφTLR4活化经典NF-κB信号通路,介导细胞因子的表达。本研究为全面理解T.pyogenes导致感染性炎症的机制提供部分理论依据。(本文来源于《东北农业大学》期刊2019-06-01）
陈晓静[3]（2016）在《粘细菌内源性隐秘质粒pMF1存在机制研究》一文中研究指出细菌质粒,在1952年由Joshua Lederberg发现,是一类独立于染色体外,能自主复制的遗传因子。质粒基因组一般包括一系列必需基因,比如负责复制、分配等维持遗传稳定的基因,还包括各种各样的附属基因。质粒对于细菌的进化适应具有重要作用,一是由于其能在不同的遗传距离较远的宿主之间转移,通过重组、转座等实现基因交流；二是其能编码很多对细菌有利的生态学表型,如抗生素、毒素、重金属抗性等。然而,自然界中还存在大量的隐秘质粒,这些质粒并不携带明显的宿主表型优势基因,而且,大范围筛选证实大约一半的质粒不具有可移动性。质粒存在会给宿主带来代谢负担,质粒DNA的维持和修复以及质粒蛋白的合成会消耗宿主细胞的原料,占据细胞的器官,如核糖体,破坏细胞的内环境。所以质粒存在的前提是对质粒上有益附属性状的阳性筛选超过质粒带给宿主的负担,但是,对有益性状的持续选择最终会使这些基因被整合到宿主染色体上。许多长时间细菌-质粒共培养的实验进化研究表明尽管会给宿主带来生理学负担,即使是在没有正选择的情况下,质粒也不会很容易的从细菌种群中丢失。目前关于质粒保存机制有多种解释,比如位点特异性重组、翻译后自杀系统、低拷贝质粒的主动分配系统、接合质粒的高接合率、非移动性质粒的阳性选择和代偿性适应等等。但是,隐秘质粒在细菌宿主内的保存机制及其给宿主带来的影响仍然不清楚。粘细菌是一类特殊的细菌类群,具有复杂的细胞间协同行为和庞大的基因组。粘细菌基因组的典型特点是存在大量的基因复制和水平基因转移现象,比如Sorangium cellulosum So0157-2(14.78Mb)的基因组中近40%的基因可能来自水平转移,暗示了粘细菌基因组易于整合外源DNA并进行染色体自我重组。整合外源DNA需要移动工具,比如质粒、噬菌体,但是,与其明显的基因组扩张相反的是,在粘细菌中并未发现普遍的质粒存在现象。pMF1,来自于Myxococcusfulvus 124B02,是目前发现的唯一能在粘细菌细胞中自主复制的内源质粒。pMF1对于研究为何M.fulvus 124B02能够包含内源质粒、质粒给M.fulvus124B02宿主带来的影响以及粘细菌基因组的进化具有重要意义。论文围绕粘细菌内源质粒pMF1的存在机制展开,主要研究内容与研究结果如下：1、pMF1复制和分配遗传稳定区域功能模式分析。采用PEG6000沉淀法提取了M. xanthus DZ1 pZJY41的复制中间体,确定了pMF1的复制方式为theta型,这种方式是大部分革兰氏阴性细菌中质粒的复制方式。但是,与经典的repABC质粒的复制和分配方式不同,pMF1的复制和分配功能是由两个单独的操纵子负责(pMF1.13-pMF1.16, pMF1.21-pMF1.23),基因结构、调控网络更复杂,我们对维持低拷贝质粒稳定存在的主动分配系统进行了更为深入的研究。pMF1质粒的par loci除了包含其他低拷贝质粒都含有的编码ATPase (pMF1.22, parA)、DNA-binding protein (pMF1.23, parB)的基因以及parS位点以外,还包含一个额外的基因(pMFl.21),我们命名为parC。这与其他低拷贝质粒的主动分配系统有明显不同,暗示了pMF1质粒在完成复制进行分配时采用了一种新颖的方式。在论文的第二部分,我们对该基因进行了研究。parC位于promoter和parA之间,并且与parA在序列上有4个碱基的重迭。这种序列上的组合方式暗示了parC可能具有某种功能。将parC进行全基因敲除后,重组质粒的稳定性下降到与pZJY41相似,对粘球菌宿主M.xanthus DZ1最大生长量的影响也显着下降,表明parC参与了par loci精确分配质粒和影响宿主生长的过程。融合荧光报告基因结果显示parC在粘球菌宿主中能正常表达成蛋白,是以蛋白质的形式发挥作用。通过与数据库进行比对并没有找到ParC在序列和结构上的同源蛋白。对其二级结构进行预测发现ParC含有大量的a螺旋,大约80%的氨基酸都形成了a螺旋。同源模建结果发现ParC形成一个发卡样的长螺旋,该长螺旋逆时针旋转成一个类似DNA超螺旋结构的右手螺旋。表面电势分析显示在长螺旋的顶端(N-端)广泛分布着一些带正电荷的氨基酸,而底部(C-端)则富含带负电荷的氨基酸。结合ParC形成叁聚体的实验结果,我们可以总结出ParC螺旋利用半胱氨酸形成二硫键,组装成3个螺旋贴在一起的N-端带正电,C-端带负电的“棒状”结构。pMF1的DNA-binding protein ParB是一个碱性蛋白,带正电荷,而细胞内的DNA是带负电荷的,ParC这种电荷的不均匀分布是否是为了与这两者相互作用呢?实验表明ParC确实能增强ParB与ItA(parS位点)的结合作用,但其本身与ItA并不结合。而且ParC与ori(10953-13980)及par loci (17242-50)区均没有结合作用。体内和体外实验表明ParC与ParB之间也没有相互作用。在低拷贝质粒的分配过程中,第一步便是大量的ParB蛋白与parS结合,形成分配复合物,而我们的结果表明ParC不参与质粒分配的第一步。pMF1质粒的复制和分配方式不同于其他低拷贝质粒,对其机制我们在做进一步研究。对于隐秘质粒来说,仅有完整的复制和分配功能不能保证其在宿主漫长进化过程中的稳定存在。接下来我们将研究目标扩展到整个质粒和宿主,从基因组学的角度研究质粒-宿主的进化历史。2、pMF1质粒和宿主M.fulvus 124B02基因组组学研究暗示了两者的共进化。我们对pMF1质粒上的23个基因所编码的蛋白分别进行功能来源预测,并归为四类。其中14个蛋白与粘细菌密切相关,质粒上约1/3(8个)的编码蛋白只能与Mstipitatus DSM14675比对到同源蛋白,另外,1个来自于Stigmatella aurantiaca,1个来自于Anaeromyxobacter,1个来自于Chondromyces crocatus和Sorangium cellulosum,3个来自于粘细菌众多种属。9个pMF1蛋白在数据库中比对不到任何的同源蛋白,属于pMF1特有。但是,很多蛋白的功能仍然未知。转录组数据表明在23个基因中,转录水平最高的是pMF1.17,pMF1.18,其次是pMF1.12。链特异性转录组和RT-PCR结果表明pMF1包含6个操纵子,占全部基因比例的87%(20/23)。接下来我们对宿主M. fulvus 124B02进行了基因组全测序,结果表明M. fulvus 124B02包含一个环形染色体,大小为11,048,835 bp,以及一个环形质粒,也就是pMF1。染色体和质粒基因组的GC含量相似,分别为69.96%和68.7%。全基因组进化树和共线性比对表明M.fulvus 124B02与M.stipitatus DSM14675同源性最高,二者在基因组大小上也最接近。与其他粘球菌相比,M.fulvus 124B02的基因组有1-2 Mb的扩张,但其在直系同源和旁系同源基因比例上并没有明显差异。限制修饰系统和CRISPR-Cas系统比较分析发现,M.fulvus 124B02的防御系统更加薄弱,其Cas蛋白操纵子比其他粘球菌要少1/2-2/3,记录外源DNA的spacers也少于其他同种或同属的粘细菌,限制修饰系统类型和修饰酶种类也较少。同源比对结果显示pMF1上的某些基因来自于其他粘细菌,暗示了pMF1曾经在不同粘细菌之间水平转移,而且与M.stipitatus DSM14675的同源基因最多。粘球菌属产生于47-51百万年前,而M.fulvus 124B02与M.stipitatus DSM14675在大约41百万年前时由共同祖先分化而来,相对薄弱的免疫系统解释了为什么pMF1最终在M.fulvus 124B02中保存下来,并与M.fulvus 124B02共同进化,稳定存在。3、pMFl在宿主M.fulvus 124B02中发挥维持宿主基因组稳定的作用为了探明pMF1稳定存在于M.fulvus 124B02中的机制,我们构建了质粒消除菌株,在实验室条件下模拟pMF1与宿主M.fulvus 124B02的进化。利用质粒不相容原理可以将pMF1自M.fulvus 124B02中消除,而且pMF1的消除没有显着影响宿主的生长、运动、发育等表型,说明pMF1对宿主的影响并不是短时间的表型影响。在进行实验室传代时,我们设定了叁种培养条件,分别以丰富的CYE、贫瘠的dead cells和捕食性的living cells为食物来源。结果发现只有在以贫瘠的dead cells为营养时,pMF1能稳定存在,而在其他两种条件下传代的菌株中,pMF1在7-8周时便检测不到。为了找到影响pMF1稳定存在的相关基因,我们对叁种条件传代的菌株进行测序,对筛选出的基因进行敲除,重复传代实验,最终确定了可能相关的一些基因。我们筛选到了pMF1稳定存在的实验室条件,在该条件下,对经过较长时间共进化的菌株进行表型分析时发现不携带质粒的菌株其发育能力下降程度要明显高于携带质粒的菌株,CYE平板上的124B02/free菌株甚至由聚团生长变成分散生长,暗示了pMF1对宿主的影响可能是经过长时间的逐渐积累。为了验证这一猜想,我们对进化菌株进行基因组测序,结果表明124B02/free菌株的基因组突变率要明显高于124B02/4111和124B02/pMF1菌株,pMF1或者pZJY4111质粒的存在能降低基因组突变率,而且这些突变的发生是随机的,没有基因组位置和基因功能的偏好性。pMF1和pZJY4111的共同部分是质粒的ori和par loci,而pZJY4111质粒在进化传代过程中ori被宿主剪切,只剩下par loci的现象表明可能是par loci发挥了稳定基因组,防止基因组发生突变的作用。综上所述,pMF1的发现,不仅成功解决了粘细菌的遗传操作问题,同时为我们了解粘细菌基因组进化提供了指导。据此,我们推测了pMF1隐秘质粒稳定存在的机制模型。在粘细菌的进化历史过程中,做为基因移动的载体,pMF1曾经在粘细菌之间水平转移。由于结构简单、拷贝数高,质粒被认为是快速的基因进化器,可以加速宿主基因组的进化。由于具有相对较弱的免疫防御系统,pMF1更容易进入M.fulvus 124B02宿主细胞内。pMF1通过参与宿主基因组的错配修复过程,最终被M.fulvus 124B02需要而保存下来。(本文来源于《山东大学》期刊2016-05-15）
何雪莲[4]（2013）在《“这是为你好”——论教育规训的隐秘机制》一文中研究指出教育意味着规训,教师必须就尽可能多的事情做出价值判断,但大部分价值判断既武断又片面,而这些价值判断之所以仍然生效则有赖于"这是为你好"机制。"这是为你好"机制实质上是一种回报收益机制,其巧妙之处在于迎合了学生本能的自我中心主义,其残酷性在于无法立刻证实,也无法立刻证伪。价值教育在此相当于一种隐秘的刑罚,它征用了青春,使思想瘫痪,让独立自由的人格无法建立起来。悖论在于,压制明显错误的东西有可能同时压制它里面正确的东西;自由若没有被滥用的权利,就不配称作自由。因此,价值教育有必要采用另一种让我们耳目一新的伟大的言说方式。(本文来源于《教育发展研究》期刊2013年24期）
周荣祥[5]（2011）在《涨快跌慢 成品油定价机制太隐秘》一文中研究指出现行成品油定价机制运行过程中的复杂性和隐秘性，无疑可以很好地遮掩国内成品油“涨快跌慢”这一事实。 早在2009年7月15日，针对市场普遍存在的“国内油价追涨快、追跌慢”这一疑问，发改委有关负责人就出面解释称，这一观点是误解，事实上国内油价在较长(本文来源于《证券时报》期刊2011-08-24）
王青云[6]（2011）在《探讨生命体内的隐秘机制》一文中研究指出千年的种子会发芽已被无数的考古发现给证明,如以色列发现了两千年前的海枣树的树种结果发芽长出小的海枣树来,在我国2006年河北省河间市龙华乡发现一座汉代古墓在一个器皿内发现了38颗种子,结果也发芽了;辽宁普兰店泥碳层出土了1000年前的莲子种子,经培养长成了一座莲花,目前中国科学院植物园用古莲子培养的太子莲,每年都会绽放,已成为一个景点。不仅植物如此,人类也是如此,前苏联在冰山上发现了一位100多年前死亡的战士的尸体,结成了冻尸,结果用他的精子使一位女科学家怀孕,并且生下一个健康的宝宝。(本文来源于《内蒙古中医药》期刊2011年09期）
孙琼欢[7]（2008）在《派系竞争：村庄治理的隐秘机制》一文中研究指出自从1980年,《中华人民共和国村民委员会组织法(试行)》颁布以来,许多学者立足于村民自治,试图从国家实现对民土政治的推进的宏观背景中去理解村庄治理,从国家与社会框架及国家政权建设等宏观层面把握村庄政治。也有学者致力于从微观层面,研究村庄政治运作的实态及机制,并由此获得对农村基层政治生活的某种理解。而本文则以一个市(县级市)域区域之内的派系竞争,这一独特的政治现象作为契入点,来把握村庄权力运作的实态,以及各行为主体的政治心理的嬗变,乃至整体政治文化变迁和地方政治的发展。在文中,笔者首先明确揭示了派系及派系竞争的概念。所谓的派系是指人们通过特定的关系为纽带联结起来的,具有共同利益和现实功能的非正式组织。而派系竞争则是以派系为组织依托,旨在改变现存的权力和利益分配格局的集团性竞争行为。在文中,笔者把派系和派系竞争定位为,主导村庄治理运作的隐秘机制。而本文的目的也就在于揭示这种隐秘机制。笔者在考察C市(县级市)市域内的各村庄形态各异的派系和派系竞争的基础之上。依据不同的分类标准。对派系及派系竞争进行类型划分,并以个案描述为基础,比较了各种类型的派系竞争对村庄治理的影响。在文中,笔者围绕派系竞争与乡村治理这一主题。对以下问题进行了相关思考。派系的内部运作以及对外竞争的策略;派系及其以此为依托的派系竞争在转型时期中国农村基层凸现的特殊性;派系竞争作为契入村庄治理的变量,其对乡村治理的影响;分化社会中非均衡的派系参与;派系竞争其独特的运作机制及与乡村治理的互动,对于精英民主理论和协商民主理论的贡献;各政治主体对派系和派系竞争的价值评判及产生这种评判的原因;在现有的村庄政治生态环境下,派系竞争呈现的发展趋势;规范和引导派系竞争的对策分析。笔者认为,对于这些问题的把握和思考,有利于借助村庄派系竞争这一契入点,达到对农村基层政治生活的理解。(本文来源于《华中师范大学》期刊2008-04-01）
马凤森[8]（1987）在《隐秘切接位点与珠蛋白前体mRNA的切接—地中海贫血病的分子缺陷机制之一(综述)》一文中研究指出RNA 分子内的切接现象(splicing)最早是在腺病毒 DNA 编码的 RNA 中发现的。现在知道,切接更主要的是真核基因转录产物的一种加工特性。多数真核基因的编码顺序(外显子(?)xon)都被一些插入顺序(内含子,intron)隔开,因此,刚转录下来的信息 RNA(前体 mRNA)必须在核内经过(?)接加工后,才能进入细胞质中作为蛋白质合成的模板。人类的珠蛋白基因(包括β珠蛋白基因家族的β、γ、ε、δ基因和α珠蛋白基因家族的α、ξ基因等)都有两个内含子和三个外显子,其前体 mRNA 长约1800nt(nucleotide(s)),成熟的珠蛋白 mRNA 长约650～700nt。最近几年来,由于限制性内切酶谱技术、分子杂交技术、重组(本文来源于《浙江医科大学学报》期刊1987年04期）
隐秘机制论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
化脓隐秘杆菌(Trueperella pyogenes,T.pyogenes)是一种常见于动物呼吸道、消化道黏膜和乳房的共生性细菌。同时,T.pyogenes也是一种条件性致病菌。当动物处于应激性状态下时,T.pyogenes能引起动物发生多种炎症疾病。化脓隐秘杆菌溶血素(Pyolysin,PLO)是T.pyogenes分泌的唯一一种溶血素,是一种胆固醇依赖性溶细胞素(Cholesterol-dependent cytolysin,CDCs),也是一种成孔毒素(Pore-forming toxin,PFT)。已有研究表明,PLO接种小鼠可以引发炎症。但是,PLO导致炎症的机制仍不明确,而阐明其引发炎症的机制对于全面揭示T.pyogenes的致病机制有一定的积极意义。本研究表达纯化了重组PLO(Recombinant PLO,rPLO)、突变体蛋白rPLO W497F和rPLO D238R,以及截短蛋白rPLO D123、rPLO D4和rPLO D4 W497F,并对它们的溶血活性进行分析。结果表明rPLO的溶血活性最强,其次为rPLO D238R,rPLO W497F及截短蛋白rPLO D123、rPLO D4和rPLO D4 W497F几乎没有溶血活性。用不同浓度的重组蛋白处理J774A.1细胞检测细胞毒性结果表明,rPLO蛋白在30-60 ng/mL浓度范围内细胞毒性较低,而随着浓度的增加细胞毒性逐渐增强;突变体蛋白rPLO W497F及rPLO D238R几乎不表现细胞毒性。重组蛋白处理与钙离子(Calcium,Ca~(2+))荧光探针孵育的J774A.1细胞,结果表明亚裂解剂量rPLO处理的细胞内Ca~(2+)浓度下降,rPLO D238R和rPLO W497F处理的细胞中Ca~(2+)浓度显着高于rPLO处理的细胞。用含有不同浓度Ca~(2+)的细胞外液与rPLO共处理细胞,结果表明当细胞外液中含有1 mmol/L Ca~(2+)时,rPLO处理可以导致细胞中的Ca~(2+)浓度下降;当细胞外液中Ca~(2+)浓度低于正常浓度时,rPLO作用可以导致细胞中的Ca~(2+)浓度上调。用不同浓度的rPLO处理J774A.1细胞0.5 h,检测表明30-60 ng/mL的rPLO对细胞钙蛋白酶(Calpain,CAPN)的活性没有明显的影响,当时间延长至2 h时,细胞内CAPN活性被显着地抑制。用亚裂解剂量的rPLO处理J774A.1细胞,western-blot检测表明rPLO可以显着抑制NF-κB p65的磷酸化及NFATc1的表达,并且处理细胞0.5 h就能表现显着的抑制效果;rPLO D238R和rPLO W497F处理组的细胞中NF-κB p65的磷酸化水平及NFATc1的表达有所上调。用亚裂解剂量的rPLO与不同浓度Ca~(2+)外液共同处理J774A.1细胞,结果表明在含有1 mmol/L CaCl_2的RPMI1640培养基中,由rPLO导致的细胞中NF-κB p65磷酸化水平降低的现象有所缓解,NFATc1的表达水平上调。用亚裂解剂量的rPLO处理J774A.1细胞,检测细胞中非经典NF-κB信号通路中几个关键性蛋白,结果表明在0.5 h时NIK及p52的含量增加,p100与IKKα/β的磷酸化水平提高。用不同重组蛋白处理小鼠骨髓源性巨噬细胞(Bone marrow derived macrophages,BMDMs),检测细胞中钙调神经磷酸酶(Calcineurin,CN)的活性,结果表明所有重组蛋白均不会显着影响细胞中CN活性。用不同蛋白处理BMDMs,结果表明rPLO可以刺激细胞产生大量的IL-1β;rPLO W497F及rPLO D123可以刺激细胞产生大量的IL-10。然后用重组蛋白刺激tlr4基因缺失的BMDMs(BMDMs~(tlr4-)),结果表明rPLO仍可刺激细胞产生大量的IL-1β;而rPLO W497F和rPLO D123对IL-10诱导能力由于tlr4基因的缺失受到完全抑制。用PLO蛋白D123结构域的截短多肽处理BMDMs,结果表明rPLO 95-156可以上调BMDMs中IL-10的大量表达。综上所述,本实验证明了PLO作用巨噬细胞(Macrophages,Mφ)可以通过两种方式影响NF-κB信号通路。当PLO维持完整的结构和功能时,可以通过“成孔活性”激活非经典NF-κB信号通路;而在细胞膜结合功能受损的情况下,PLO表现“PAMPs样活性”通过刺激MφTLR4活化经典NF-κB信号通路,介导细胞因子的表达。本研究为全面理解T.pyogenes导致感染性炎症的机制提供部分理论依据。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
隐秘机制论文参考文献
[1].郭玉茹,王如霞,裘鹏,张德显,汉丽梅.木犀草素对化脓隐秘杆菌的抗菌机制研究[C].中国畜牧兽医学会兽医药理毒理学分会第十五次学术讨论会论文集.2019
[2].王冰.化脓隐秘杆菌溶血素激活巨噬细胞NF-κB系统机制的研究[D].东北农业大学.2019
[3].陈晓静.粘细菌内源性隐秘质粒pMF1存在机制研究[D].山东大学.2016
[4].何雪莲.“这是为你好”——论教育规训的隐秘机制[J].教育发展研究.2013
[5].周荣祥.涨快跌慢成品油定价机制太隐秘[N].证券时报.2011
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