导读:本文包含了异源蛋白论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:TGase,鸡肉蛋白,芸豆蛋白,姜黄素
异源蛋白论文文献综述
何庆燕,陈秋妹,洪永祥,汪少芸[1]（2018）在《鸡肉-芸豆异源蛋白交联包埋姜黄素的研究》一文中研究指出目的:以TGase交联鸡肉蛋白与芸豆蛋白后的混合蛋白为包埋壁材,包埋姜黄素,探究酶的作用条件、不同蛋白比例和壁/芯材比例对姜黄素包埋率的影响。方法:采用双相法制备混合蛋白-姜黄素微球,以姜黄素的包埋率为指标,通过单因素试验和正交优化试验探讨酶的作用条件对包埋率的影响;利用环境扫描电镜对比观察混合蛋白包埋姜黄素的包埋效果。结果:TGase酶联时间、酶联温度、添加量对包埋率的影响极显着,各因素的最优水平为TGase酶联时间6 h,酶联温度45℃,TGase添加量为蛋白与TGase质量比80∶1;不同蛋白比例和壁/芯材比对包埋率均有一定的影响;姜黄素颗粒较大,混合蛋白对其有包裹作用。结论:TGase的作用条件、不同蛋白比例以及壁/芯材比例对包埋率均有影响;混合蛋白对姜黄素有包裹作用。(本文来源于《中国食品学报》期刊2018年08期）
杨笑[2]（2018）在《共表达辅助蛋白促进酿酒酵母异源蛋白分泌》一文中研究指出酿酒酵母是食品级安全性真菌,广泛应用于食品工业和生物医药领域。酿酒酵母细胞具有完善的蛋白质加工体系,确保蛋白质的折迭、翻译后修饰,目前已有多种药物蛋白由酿酒酵母生产。然而,酿酒酵母对异源蛋白的分泌水平普遍较低,严重制约了其的工业化应用。提高酿酒酵母分泌水平的方法主要是优化发酵和从基因层面调节异源蛋白分泌。目前酿酒酵母异源蛋白基因层面上的分泌策略主要以小分子蛋白质为研究对象,对30KDa以上的蛋白质种类研究较少。本文以漆酶(53KDa)为例,尝试寻找一系列适合较大分子的分泌表达策略。本文通过在酿酒酵母中优化漆酶的启动子、信号肽和共表达与异源蛋白合成和分泌相关的蛋白质(简称“辅助蛋白”),使漆酶的胞外分泌水平提高,还发现辅助蛋白组合可提高α-淀粉酶和增强型绿色荧光蛋白EGFP的分泌水平,具有一定的普遍适用性。具体研究如下:1、选择启动子TEF1和GAL1,构建并发酵产胞内酶菌株,以了解漆酶在酿酒酵母胞内的表达情况;在此基础上引入α-因子信号肽,构建产胞外酶菌株,发酵并测定胞内外酶活,纯化蛋白后跑SDS-PAGE,考察各菌株的漆酶表达水平。结果表明:所选漆酶基因能在酿酒酵母胞内表达和胞外分泌。在T=72h,启动子GAL1对应菌株的漆酶胞外酶活高于启动子TEF1对应菌株,分别为 129.73 ±2.57 U/L 和 30.52 ±2.56 U/L。因此,选 GAL1为胞外产酶菌的启动子用于后续实验。2、选取酿酒酵母天然α-因子信号肽、菊粉酶天然信号肽、合成信号肽以及漆酶天然信号肽,比较其介导的漆酶分泌效果。合成信号肽介导的漆酶胞外酶活和分泌率较α-因子信号肽分别提高了 1.39倍和99%,另外两种信号肽对应菌株未检测到胞外酶活。综合考虑胞外酶活和分泌率,确定合成信号肽用于后续实验。3、选取八个辅助蛋白,将其过表达,考察对漆酶分泌的作用。结果表明RPP0、SS02、BIP、PDI四个辅助蛋白使漆酶胞外酶活和分泌率提高,其胞外酶活依次下降。其中RPPO过表达的菌株B/pGSLC-yPRP的胞外酶活为444.24 ±2.82 U/L,分泌率为25.73 ±0.73%,分别较空白对照B/pGSLC-YEplac181 提高了 69%和 46%。4、考察分泌效果较好的PDI、BIP、SS02和RPP0四个辅助蛋白间的协同作用。结果表明RPP0和SS02,RPP0和BIP,RPP0和SecI叁组蛋白存在促进蛋白胞内表达和胞外分泌的协同作用。其中,RPP0和SS02的协同作用对漆酶分泌最显着,其胞外酶活为585.21 ±1.28 U/L,分泌率为30.36±0.71%,较过表达RPP0的菌株B/pGSLC-yPRP分别提高了 31%和18%,较空白对照B/pGSLC-YEplac181分别提高了 1.23倍和73.19%。5、考察辅助蛋白RPP0和SS02共表达对提高其他异源蛋白分泌水平的普遍适用性。结果表明RPP0和SS02共表达使得菌株的α-淀粉酶的胞外酶活较空白对照提高了 73%,EGFP发酵液上清的荧光强度较空白对照提高8%,RPPO和SS02共表达对于大分子蛋白质α-淀粉酶表现出更明显的促进分泌效果。最终,通过优化启动子、信号肽和过表达辅助蛋白,漆酶的胞外酶活从 30.52 ± 2.56 U/L 提高到 585.21 ± 1.28 U/L,提高了 18.17 倍。本课题的研究意义在于:运用基因层面上的调控策略,不仅提高了大分子蛋白质-漆酶在酿酒酵母中的分泌量,而且首次发现了辅助蛋白RPP0和SS02在提高异源蛋白分泌水平上具有较强的协同作用和普遍适用性,对提高其他异源蛋白在酿酒酵母的分泌水平具有一定的指导意义。(本文来源于《北京化工大学》期刊2018-06-01）
高佳[3]（2018）在《里氏木霉内质网蛋白折迭途径改造与异源蛋白BGLA和Lcc1的表达研究》一文中研究指出里氏木霉是纤维素酶生产的主要工业菌株,其胞外蛋白分泌量可达40g/L以上;同时,其也是异源蛋白表达的良好宿主。然而,里氏木霉表达异源蛋白的产量往往低于内源蛋白,该问题的瓶颈可能发生在蛋白翻译后的折迭分泌过程中。内质网是分泌蛋白合成和成熟的重要场所。分泌蛋白进入内质网后,分子伴侣Bip1协助蛋白折迭,二硫键异构酶Pdi1和氧化还原酶Ero1帮助形成二硫键;此外,其糖基化状态也是检测蛋白折迭和分选的重要信号。糖苷酶Gls2切除糖链A分支的葡糖残基,如蛋白正确折迭,则继续分泌;若折迭错误,则甘露糖苷酶Mns1切除B分支最末端的甘露糖残基,激活内质网关联降解途径(ERAD),运出内质网,在细胞质内被降解;或者由UDP-葡糖基转移酶Gpt1在A分支上重新添加葡糖残基,促进蛋白继续循环折迭。对内质网蛋白折迭途径相关基因进行遗传改造,可有助于促进里氏木霉蛋白折迭和分泌,从而构建高效生产纤维素酶菌株。β-葡萄糖苷酶(BGL)能够将纤维二糖水解成两分子葡萄糖,BGL不足是影响纤维素降解酶系高效水解纤维素的一个瓶颈。研究表明,黑曲霉BGLA的底物特异性和比酶活均比里氏木霉Bgl1高,且对木质素的吸附程度较低,从而间接促进纤维素的酶解。漆酶是一种能够氧化酚类和芳香胺类底物的多铜氧化酶。其主要用于木质素降解、污染物脱毒、生物电极等。漆酶主要存在于担子菌中,因宿主菌难培养、需有毒物质诱导、难分离纯化等局限,阻碍其商业化应用。其异源表达是获得大量优质漆酶的重要途径。本论文构建了bip1、pdi1、ero1、gpt1和gls2基因过表达菌株以及mns1基因敲除菌株,对里氏木霉内质网蛋白折迭途径进行初步改造;此外,利用里氏木霉作为宿主对黑曲霉BGLA和毛栓菌漆酶Lcc1进行了表达研究。具体研究内容如下:(一)里氏木霉内质网蛋白折迭途径改造初步完成。构建了内质网蛋白折迭分子伴侣过表达菌株OEbip1、二硫键异构酶过表达菌株OEpdi1、氧化还原酶过表达菌株OEero1以及蛋白折迭循环关键蛋白葡萄糖基转移酶过表达菌株OEgpt1、糖苷酶过表达菌株OEgls2和甘露糖苷酶敲除菌株△mns1。荧光定量PCR表明,过表达bip1、pdi1及ero1 一定程度上引起内质网非折迭蛋白响应(UPR),但没有激活ERAD途径;过表达gpt1和gls2以及敲除mns1一定程度上引起UPR响应,激活ERAD途径。在DTT处理时,突变菌株的BGL活力要明显高于出发菌株。在内质网蛋白折迭压力条件下,突变菌株的胞外BGL分泌能力要强于出发菌株。此外,相较于出发菌株,内质网蛋白折迭途径改造菌株OEgpt1、OEero1、OEbip1及△mns1的滤纸酶活和BGL酶活得到明显提升。发酵培养第7天,过表达pdi1和bip1菌株的滤纸酶活分别提高43.0%和49.6%;BGL酶活分别提高112.3%和41.7%。OEgpt1、OEero1、OEbip1的内切葡聚糖酶酶活略高于出发菌株QP4,△mns1、OEgls2及OEpdi1的内切葡聚糖酶(EG)酶活略低于出发菌株QP4。所有突变菌株的外切葡糖酶(CBH)活力,没有发生较为显着的变化。(二)里氏木霉成功表达黑曲霉BGLA。利用里氏木霉自身诱导型强启动子pcbh1对黑曲霉BGLA进行表达,成功构建工程菌株SCB18。发酵培养第7天,SCB18菌株的BGL酶活为103.9 IU/mL,较对照菌株提高51.3倍;其滤纸酶活为4.6 IU/mL,较对照菌株提升29.8%。黑曲霉BGLA的过表达在一定程度上引起了 UPR响应,但没有明显激活ERAD途径。黑曲霉BGLA在里氏木霉中表达需要更多的分子伴侣Bip1和二硫键异构酶Pdi1协助完成。另外,木糖渣底物糖化结果表明,SCB18菌株所分泌纤维素酶的纤维素转化率明显高于出发菌株SDC11。其中,以脱木素木糖渣为底物,酶解反应96h时SCB18菌株的纤维素转化率为96.6%;以未脱木素木糖渣为底物,酶解反应96h时SCB18菌株的纤维素转化率为53.1%。SCB18菌株所分泌酶液的转糖基能力较强,以60%葡萄糖作为底物,65℃反应2天,葡萄糖转化率实现最大(17.6%);转糖基产物主要为槐糖、龙胆二糖以及纤维二糖。此外,转糖基产物具有较强的诱导生产纤维素酶的能力,其诱导能力强于乳糖但弱于纤维素,转糖基产物是具有较强经济价值的可替代的可溶性诱导型碳源。(叁)里氏木霉表达高氧化还原电势毛栓菌漆酶Lcc1的研究。利用里氏木霉组成型强启动子pcdna1过表达毛栓菌漆酶lcc1基因,共获得7株转化子。毛栓菌漆酶lcc1基因在里氏木霉中成功转录,但发酵培养和ABTS平板显色结果表明过表达菌株漆酶活力均没有被检测到。里氏木霉表达漆酶Lcc1引起了较强的UPR响应,激活了 ERAD途径。漆酶Lcc1可能在里氏木霉中没有完成正确折迭,进而从内质网中运出,在细胞质中被降解。(四)毕赤酵母GS115成功表达毛栓菌漆酶Lcc1及其糖基化突变体蛋白。对漆酶Lcc1的54位和433位两个糖基化位点进行未突变、单突变和双突变,获得未突变Lcc1菌株、单突变N54Q菌株、单突变N433Q菌株以及双突变NDQ菌株。ABTS平板显色结果表明,漆酶活力大小为未突变Lcc1菌株>单突变N54Q菌株>单突变N433Q菌株>双突变NDQ菌株。漆酶纯化和活性检测表明433位天冬酰胺糖基化对漆酶Lcc1保持活性至关重要。未突变Lcc1利用ABTS和2,6-DMP的最适pH均为5.0;且利用ABTS和2,6-DMP最适温度分别为60℃和55℃。(本文来源于《山东大学》期刊2018-05-28）
何鹏辉[4]（2018）在《通过调节D-丙氨酸代谢节点促地衣芽胞杆菌异源蛋白高效表达和聚γ-谷氨酸高产》一文中研究指出D-丙氨酸(D-alanine,D-Ala)是细菌细胞壁肽聚糖中四肽尾的重要组成部分之一,其对于细菌的正常生长起着不可或缺的作用。但是目前针对于D-丙氨酸的研究主要集中在食品级表达系统的构建方面,对于D-丙氨酸与菌体生长之间的关系鲜有研究。本研究在地衣芽胞杆菌的基础上,首先成功构建了基于丙氨酸消旋酶的食品级表达体系,并通过调节丙氨酸消旋酶的表达水平实现了 α-淀粉酶的高产。另外,通过敲除乳酸脱氢酶基因ldh,过表达丙氨酸脱氢酶基因ald、天冬氨酸脱羧酶基因panD、丙氨酸消旋酶基因dal和丙氨酸连接酶基因ddl,实现了聚γ-谷氨酸的高产;并且针对D-丙氨酸与菌体生长和产物合成之间的关系进行了初步探究,阐述了 D-丙氨酸代谢节点的改造促菌体生长和产物合成的初步机制,为地衣芽胞杆菌代谢产物高产奠定基础。一方面,本文首先研究了地衣芽胞杆菌中外源质粒的遗传稳定性,在未添加抗生素的条件下,质粒丢失率高达90%,对外源蛋白表达量影响较大。其次,对丙氨酸消旋酶的功能基因进行了鉴定,研究结果显示基因dal发挥着丙氨酸消旋酶的主要功能。随后,以丙氨酸消旋酶为选择标记在地衣芽胞杆菌中成功构建了食品级表达体系(BL10D/pP43Dal),外源质粒的遗传稳定性达到100%,并将α-淀粉酶克隆到该表达体系中构建工程菌BL10D/pP43SAT-P43Dal,验证该体系表达外源蛋白的能力。结果显示,工程菌BL10D/pP43SAT-P43Dal表达的α-淀粉酶酶活为62.52 U/mL,相比于对照菌BL10/pP43SAT的酶活(122.80 U/mL)降低了 49.09%。最后,以基因dal自身启动子Pdal和四环素编码基因的启动子Ptet替换原质粒上丙氨酸消旋酶基因dal所用的P43启动子,成功构建了另外两株工程菌 BL10D/pP43SAT-PdalDal 和 BL10D/pP43SAT-PtetDal。发酵结果显示工程菌株BL10D/pP43SAT-PtetDal的α-淀粉酶表达量最高,酶活高达155.45 U/mL,相比于对照菌BL10/pP43SAT的酶活提高了 26.59%,其次是BL10/pP43SAT、BL10D/pP43SAT-PdalDal 和 BL10D/pP43SAT-P43Dal。同时,经 SDS-PAGE 检测发现丙氨酸消旋酶的合成量发生改变,工程菌BL10D/pP43SAT-P43Dal合成丙氨酸消旋酶的量最多,其次是 BL10D/pP43SAT-PdalDal、BL10D/pP43SAT-PtetDal 和 BL10/pP43SAT。此结果表明,D-丙氨酸的合成量与外源蛋白产量具有紧密的关系,适量D-丙氨酸的合成有助于外源蛋白的表达。另一方面,本研究首先在发酵过程中添加了不同浓度的D-丙氨酸,发现低浓度D-丙氨酸(在0.2%)的添加可以提高菌体生物量及目的产物的合成水平,而高浓度的D-丙氨酸(>0.2%)则不利于菌体生长和目的产物的合成。其次,以地衣芽胞杆菌WX-02为宿主菌,分别强化丙氨酸代谢途径的关键基因ald、panD、dal和ddl,缺失溢流代谢途径中的乳酸脱氢酶基因ldh,构建了一系列工程菌株,考察其对聚Y-谷氨酸(γ-PGA)合成的影响。发酵结果显示,基因ald、panD、dal和ddl的过表达和基因ldh的缺失分别将γ-PGA产量提高19.72%、42.97%、15.91%、60.90%和4.79%,并分别将菌体生物量提高15.58%、12.06%、18.34%、49.85%和13.96%。在此基础上,进一步考察D-丙氨酸代谢节点的调节对地衣芽胞杆菌其他代谢产物合成的影响,例如外源蛋白——纳豆激酶、抗生素类代谢物——杆菌肽、色素类代谢物——普切明和生物表面活性素类代谢物——地衣素等,结果显示丙氨酸合成的加强均能使这些代谢产物产量提高18%以上。此结果表明,加强D-丙氨酸途径的合成有助于菌体的生长和代谢产物的高产。(本文来源于《湖北大学》期刊2018-05-28）
宋晓菲,刘全力,毛吉魏,吴玉珍,李园子[5]（2017）在《POT1介导的δ整合方法实现异源蛋白在酿酒酵母中的高拷贝、稳定表达》一文中研究指出酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)具有非常好的后翻译系统,遗传背景清晰,基因操作简便,真核生物酿酒酵母作为一种表达宿主被广泛应用于具有医药、工业价值的异源蛋白的表达。选择合适的表达载体是异源蛋白在酿酒酵母中表达时首先需要考虑的问题,纵观酿酒酵母整合方法发展史,整合位点的选取以及筛选标记的选择是研究者普遍关注的方向。在酿酒酵母中,2μ游离质粒在细胞中可存在大约5-30个质粒,虽然2μ高拷贝质粒有利于异源基因的高效表达,但在长期无筛选压力培养条件下往往存在易丢失、不稳定的弊端。而基于rDNA和δ位点的整合表达方法是异源蛋白在酿酒酵母中表达的另一策略。rDNA在酿酒酵母染色体XII上存在140个随机重复序列,δ位点则分布于不同的染色体上,存在425个随机重复序列。筛选标记从最初的营养筛选标记发展到以抗性基因kan作为新的筛选标记,并通过不同抗性浓度梯度筛选更高拷贝数。Kan作为筛选标记的δ整合方式是目前大家普遍利用的整合方法,但这一方法却存在明显弊端,即假阳性严重,高浓度kan会对细胞造成毒性,且kan的外源添加不适合酿酒酵母进行工程发酵。综上可知,基于δ位点的整合方法已在酿酒酵母中广泛应用,但同时实现异源基因的高拷贝整合和稳定表达仍然面临挑战。磷酸丙糖异构酶(TPI1),催化叁磷酸甘油醛和磷酸二羟丙酮之间的互换异构,TPI1缺失菌株tpi△无法正常进行糖酵解途径,产生足量乙酰辅酶A进行叁羧酸循环,为细胞正常生长供能,故无法在以葡萄糖作为唯一碳源的培养基上进行正常生长,可在以葡萄糖、乙醇作为碳源的培养基上正常生长。来自于粟酒裂殖酵母中的磷酸丙糖异构酶(POT1),其相比于酿酒酵母中的TPI1在功能上存在明显缺陷,本研究利用P0T1这一必需基因作为δ整合方法中的新型筛选标记,利用POT1的功能缺陷,筛选多拷贝整合的异源基因。在这一整合方法中,选取TP1启动了、TPI1终止子用于异源基因的表达,以期促进基因的转录后调节,提高蛋白的表达量。为突出POT1介导的δ整合方法的优势,我们将此方法与传统URA3介导的δ整合方法进行了比较,发现新型整合方法可获得更高拷贝数及蛋白表达量。POT1介导的δ整合方法轻松获得了32个拷贝的绿色荧光蛋白表达菌株,且该菌株在丰富培养基中传代100代后基因拷贝数及蛋白表达量仍然保持稳定。酿酒酵母作为传统的乙醇生产菌株,是极具潜力的CBP底盘细胞,目前已广泛应用于纤维素产醇的研究。纤维素的降解通常采用纤维素酶酶解的方法,主要需要包括内切葡聚糖酶(Endoglucanase,简称EG)、纤维二糖水解酶(Cellobiohydrolase,又称外切葡聚糖酶,简称CBH)和β-葡萄糖苷酶(β-Glucosidase,简称BGL)在内的多种纤维素酶的协同作用才能将纤维素转化成葡萄糖。其中外切葡聚糖酶在酿酒酵母中的高效表达是纤维素产醇研究中的瓶颈。利用POT1介导的δ整合方法,本研究成功实现了棘孢曲霉来源的外切葡聚糖酶的稳定、高拷贝表达,最高酶活达238 mU g-1,为目前报道中的最高酶活。本研究将δ序列作为整合位点,将POT1这一必需基因作为筛选标记成功实现了异源基因在酿酒酵母中的稳定、高效表达。P0T1介导的δ整合方法将会是一种异源蛋白在酿酒酵母中稳定高效表达的有力工具,具有极大的医药、工业应用价值。(本文来源于《2017第七届泛环渤海生物化学与分子生物学会学术交流会论文集》期刊2017-08-21）
李春艳[6]（2017）在《里氏木霉异源蛋白表达及高产纤维素酶菌株的遗传改造》一文中研究指出丝状真菌里氏木霉(Trichoderma reesei)在纤维素底物存在条件下,能够大量合成分泌包括内切酶、外切酶以及β-葡萄糖苷酶在内的纤维素酶系,实现对底物的高效降解。里氏木霉强大的蛋白合成分泌能力也使其成为异源蛋白表达的良好宿主,对一些需要进行翻译后修饰的蛋白具有突出优势。但里氏木霉中以主要纤维素酶基因cel7a(cbh1)强启动子驱动的蛋白表达依赖于纤维素诱导条件,而此条件下其自身分泌的大量的纤维素酶不利于异源蛋白的后续分离纯化。另一方面,虽然里氏木霉所产纤维素酶目前已实现了规模化生产和应用,但是在生物基燃料如乙醇生产中,纤维素酶的使用成本仍然是一个主要限制因素。因此进一步提升工业菌株的纤维素酶产量对降低转化成本具有重要意义。本论文主要在以下两方面对里氏木霉进行了遗传改造:一是通过对主要的纤维素酶编码基因进行敲除以及对转录因子Xyr1进行过表达,以降低其作为蛋白表达宿主菌株的本底分泌蛋白背景,并且使cbh1启动子驱动的蛋白表达不再依赖于诱导碳源纤维素;二是在里氏木霉高产菌株C10中分别过表达了转录因子Xyr1和β-葡萄糖苷酶Bgl1,进一步提升了 C10的纤维素酶产量。主要研究工作总结如下:一、成功构建了主要纤维素酶(Cel5a、Cel7b、Cel6a以及Cel7a)缺失及转录因子Xyr1过表达的两株里氏木霉菌株△5a7b6aOExyr1和△5a7b6a7aOExyr1,其内源分泌蛋白背景低,且纤维素酶合成不依赖于诱导碳源纤维素,是用于以cbh1启动子驱动异源蛋白表达及纯化的理想菌株。我们以里氏木霉QM9414作为出发菌株,采用基于同源重组原理的基因敲除技术,构建了一株内切酶Cel5a和Ce17b以及外切酶Cel6a同时缺失的菌株A5a7b6a,SDS-PAGE分析表明该菌株培养基中分泌蛋白含量明显下降。我们在该菌株中进一步对纤维素酶基因转录正调控因子Xyr1进行了过表达,构建了△5a7b6aOExyr1菌株。在非诱导碳源葡萄糖下,该菌株内切酶Cel7a(Cbh1)的合成分泌量与野生型诱导碳源纤维素下相当。这表明,以低背景的△5a7b6aOExyr1菌株为表达宿主,可应用于分别在纤维素与葡萄糖条件下以cel7a(cbh1)启动子驱动的异源蛋白表达。我们继而又在该菌株中对cel7a基因进行了敲除,构建了△5a7b6a7aOExyrl菌株,在该菌株中可采用随机整合的方式对异源表达基因盒进行较为方便的操作。虽然该菌株由于cel7a的缺失不能利用纤维素作为碳源,但是其可应用于葡萄糖条件下cel7a启动子驱动的异源蛋白表达,并且Ce17a的缺失进一步大幅降低了内源分泌蛋白的背景,能够极大便利目标蛋白的分离纯化。二、以△5a7b6aOExyr1作为宿主菌株,成功地表达了来源于特异腐质霉(Humicoloinsolens)的内切葡聚糖酶NCE5,CMC酶谱电泳显示该酶的最适pH为6,属于偏中性内切酶。NCE5为来源于H.insolens 的内切葡聚糖酶,理论分子量为23 kDa。我们根据里氏木霉密码子使用频率对NCE5的编码序列进行优化,并构建了以cel7a(cbh1)启动子驱动的基因表达盒,将其定点整合于△5a7b6aOExyr1菌株的cel7a(cbh1)基因位点。CMC酶谱电泳分析表明,该酶成功表达并分泌到胞外,在pH 6时CMC酶活最高,属于偏中性内切酶。叁、在里氏木霉高产菌株C10中分别过表达了转录正调控因子Xyr1和β-葡萄糖苷酶Bgl1,分析发现发酵液的滤纸酶活分别提升了 25%和30%。里氏木霉C10菌株为实验室保藏的纤维素酶高产菌株,在葡萄糖条件下可以低水平地解除碳代谢阻遏。我们在C10中采用tcu-1强启动子对转录正调控因子Xyr1进行过表达,获得C10-OExyr1菌株。该菌株与C10相比,不仅发酵液的滤纸酶活提升了约25%,并且纤维素酶分泌时间提前12h。在C10中以cel7a启动子过表达β-葡萄糖昔酶基因bgl1,获得C10-bgl1菌株,该菌株发酵液的滤纸酶活比野生型提升约30%。(本文来源于《山东大学》期刊2017-05-24）
汤红婷[7]（2016）在《酿酒酵母异源蛋白高效分泌适配元件的发掘及人造纤维小体的构制》一文中研究指出酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是食品级安全性的模式真菌,具有良好的产业化生产性能,是极具潜力的细胞工厂底盘细胞。虽然其具备完善的蛋白分泌途径及翻译后修饰系统,但异源蛋白分泌表达的活性普遍较低。而蛋白质的高效分泌表达,应用于生物技术方面的意义不言而喻。通过分泌途径,在酿酒酵母中高活性表达纤维素酶,是实现纤维素乙醇的统合生物加工过程(Consolidated bioprocess, CBP)的有效方式。CBP是将纤维素降解酶类的生产、纤维素底物的水解和糖份的乙醇发酵等几个过程的整合,通过一种微生物完成的生物加工过程。同时,厌氧细菌产生的纤维小体具有高效降解木质纤维素的特性,使其成为CBP构制的一种新尝试。本文以此为出发点,针对分泌途径的各个关键节点,进行改造,提高纤维素酶等蛋白的分泌效率,以发掘不同异源蛋白高效分泌适配元件。在此基础上,进行酿酒酵母人造纤维小体的设计和构建。本论文主要研究工作有：1、酿酒酵母高活性分泌p-葡萄糖苷酶促进同步糖化发酵产生乙醇纤维素水解的中间产物纤维二糖对纤维素酶的水解活性具有强烈的反馈抑制作用,从而降低纤维素的降解效率,限制乙醇转化率。而及时转化纤维二糖为葡萄糖并发酵为乙醇,可解除这种抑制。但许多真菌天然纤维素酶系中,水解纤维二糖的p-葡萄糖苷酶的活性较低。因此,将β-葡萄糖苷酶在酿酒酵母中高效表达,是促进木质纤维素同步糖化发酵产生乙醇的有效策略之一。本研究首先比较了叁种来源的p-葡萄糖苷酶在酿酒酵母中异源表达的胞外活性,选择了具有最高分泌活性的扣囊覆膜胞酵母(Saccharomycopsis fibuligera)β-葡萄糖苷酶SF-BGL1。然后通过多种信号肽的比较,发现克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)菊粉酶(Inulp)的信号肽进一步促进了SF-BGL1胞外分泌,酶活达到了6.22 U/mL。SF-BGL1的高活性表达,使酿酒酵母高效代谢纤维二糖,且纤维二糖的发酵特性与葡萄糖基本相似。缺乏β-葡萄糖苷酶活性的瑞氏木霉(Trichoderma reesei)纤维素酶系,与高效分泌SF-BGL1的酵母菌株进行同步糖化发酵微晶纤维素时,解除了纤维二糖的积累,使乙醇的产量比对照菌株(表达空质粒)提高了105%。更为重要的是,以酸预处理的玉米芯为同步糖化发酵底物,高效分泌SF-BGL1的菌株发酵产生的乙醇产量达到了21.5g/L,与对照菌株相比,提高了89%,并且,其发酵液中剩余总糖量下降了71%。本研究获得的高效BGL1分泌菌株,回补了瑞氏木霉纤维素酶系的不足,对提高木质纤维素同步糖化发酵产生乙醇的得率具有重要的应用价值。2、改造蛋白折迭和蛋白易位途径提高异源蛋白在酿酒酵母中的表达异源蛋白β-葡萄糖苷酶BGL1、内切葡聚糖酶CelA和α-淀粉酶在酿酒酵母中分泌表达时,造成了内质网非正确折迭蛋白响应,降低了蛋白的胞外分泌效率,因此增加蛋白正确折迭是提高蛋白分泌量的有效措施之一。我们超表达内质网分子伴侣Kar2p及Pdilp,发现协助蛋白折迭的分子伴侣Kar2p超表达后,只提高了BGL1的胞外活性,而促进二硫键正确形成的二硫键异构酶Pdilp超表达后,使叁种异源蛋白的胞外活性均增加,其中包括不含二硫键的CelA。 BGL1、CelA和α-淀粉酶分泌量分别提高53%、17%和90%,说明Pdilp可有效促进上述叁种异源蛋白的分泌。新生肽链正确易位到内质网中参与蛋白折迭,对蛋白的高效分泌也具有重要作用。新生肽链正确易位有蛋白翻译后易位和翻译共易位两种形式。超表达协助蛋白翻译共易位过程的信号识别颗粒关键组分Srp54p和Srp14p,明显提高了叁种异源蛋白的胞外分泌量。Srp54p的超表达使BGL1、CelA和α-淀粉酶的酶活分别提高了56%、16%和52%,Srp14的超表达使其分别提高了44%、18%和38%。协助新生肽链正确折迭并参与其翻译后易位过程的胞质分子伴侣Ssalp,超表达后增加了BGL1的胞外活性。此外,蛋白的信号肽是蛋白易位过程中的重要影响因素。我们发现,不同信号肽对于Srp54p、Srp14p和Kar2p、 Pdilp超表达菌株中的胞外分泌增加趋势没有太大影响。但在Ssalp超表达菌中,信号肽SF和Yap3引导分泌的BGL1胞外活性均被提高,而Suc2并没有。同时,Ssalp能提高信号肽Yap3引导的BGL1胞外活性,却不适用于其引导的α-淀粉酶高效分泌。这说明,翻译共转运相关组分对异源蛋白的高效表达具有普遍的适配作用,并且不受信号肽的影响；而翻译后转运相关系组分Ssalp对异源蛋白具有适配差异性,并且其适配作用受到信号的影响。蛋白折迭和蛋白易位双重改造,具有一定的协同作用,能进一步的促进异源蛋白的分泌,其中Pdilp和Srp54p共同超表达后,使BGL1、CelA和α-淀粉酶的胞外分泌分别提高了72%,60%和103%。本研究首次实现了改造酿酒酵母蛋白易位途径提高异源蛋白胞外分泌的策略,为优化适配于异源蛋白表达的分泌途径提供了价值性的参考思路。3、阻断酿酒酵母高甘露糖糖基化修饰通过上调分泌途径和改变细胞壁完整性增加异源蛋白的产量异源蛋白β-葡萄糖苷酶BGL1、内切葡聚糖酶CelA和外切葡聚糖酶Cel7A在经过酿酒酵母分泌途径加工修饰的过程中,发生了高甘露糖糖链添加的N-糖基化修饰,该糖基化修饰可能或影响蛋白的生物活性,或降低蛋白的胞外分泌量。因此,研究不同糖基化修饰程度对异源蛋白分泌活性的影响对优化分泌途径具有重要的意义。在高尔基体高甘露糖糖链合成过程中,糖基转移酶Ochlp负责添加第一个甘露糖到中心糖链上；Mnn9p参与大约10个α-1,6-甘露糖糖基基链的合成；Mnnlp负责最后甘露糖糖基的添加。敲除OCH1和MNN9,使分泌至胞外的BGL1、CelA和Cel7A的分子量显着降低,大小接近理论分子量,同时,叁种异源蛋白的胞外分泌活性也得到了大幅度增加。在OCH1敲除菌株中,BGL1、CelA和Ce17A胞外酶活分别提高了135%、102%和144%；在MNN9敲除菌株中,分别增加了156%、105%和230%。而敲除MNN1后,蛋白的分子量与野生型菌株基本一致,且只有BGL1的胞外活性提高了25%。这说明阻断酿酒酵母蛋白的高甘露糖修饰,能提高异源蛋白的分泌活性。根据叁种异源蛋白不同修饰程度的N-糖链去除前后的酶活变化,分析得出OCH1和MNN9敲除导致N-糖链截短并不能提高BGL1、CelA和Ce17A的比酶活。BGL1、CelA和Cel7A的胞外产量与酶活相一致的增加幅度,说明OCHl和MNN9敲除增加异源蛋白胞外活性的主要原因是蛋白产量的增加。进一步分析发现,在OCH1和MNN9敲除菌株中,分泌途径中一些关键节点的分泌元件的表达被上调,其中包括参与蛋白折迭的基因KAR2和SSA1、蛋白降解的DERl和HRD3和膜泡运输的BOS1、ERV25、SNC2和SSO1,并且这些基因的上调不依赖于IRE1/HAC1介导的内质网胁迫响应机制的调控。这说明敲除OCH1和MNN9增强了酿酒酵母的分泌能力,从而增加了异源蛋白的胞外分泌量。同时,OCHl和MNN9的敲除造成了细胞壁完整性的损伤,使菌株对刚果红、荧光增白剂以及葡聚糖水解酶的敏感性增强,细胞壁中的甘露糖比例显着下降,并且增加了细胞壁的孔隙度,促进了异源蛋白穿过细胞壁分泌到胞外。敲除OCH1和MNN9减缓了细胞的生长,通过超表达参与细胞完整性损伤响应机制中的关键基因RHO1和PKCl,部分回补了细胞壁的损伤,并且略微恢复细胞的生长。本研究为糖基化改造与异源蛋白高效分泌的兼容性研究提供了新颖的视角。4、优化酿酒酵母膜泡运输提高胞外蛋白和表面展示蛋白的分泌量蛋白增量表达往往由于运输能力的不足,使加工修饰好的蛋白或在内质网中,或在高尔基体中积累,最终导致被降解。增强内质网-高尔基体和高尔基体-质膜的膜泡运输能力,对减少蛋白胞内积累具有重要的作用。参与内质网-高尔基体膜泡运输的元件Secl2p、Secl3p、Erv25p和Boslp超表达后,都能提高CelA的胞外分泌量,而其中,只有Secl3p使BGL1的胞外酶活增加了40%。同时,参与内质网-质膜膜泡运输的元件Ssolp、Snc2p、Seclp、Exo70p、Sec4p和Ypt32p超表达后,都能促进BGL1的分泌活性,其中最为明显的是相关膜泡与质膜融合的SNAREs蛋白Ssolp和Snc2p,使BGL1酶活分别增加了53%和61%。而针对于CelA的胞外分泌,其中只有Snc2p、Sec4p、Ypt32p能略微提高其胞外活性(10%-15%)。实验结果表明,膜泡运输改造能促进异源蛋白的高效分泌,但是不同蛋白在膜泡运输的限制节点不同,CelA的主要限制在内质网-高尔基体的膜泡运输,而BGL1的主要限制在高尔基体-质膜的膜泡运输。此外,表面展示蛋白也需要经过分泌途径的加工修饰。将CelA和BGL1通过酿酒酵母常用的并且已商业化的表面展示系统Aga1p-Aga2p锚定于细胞表面。通过酶活测定和流式细胞仪分析结果显示,内质网-高尔基体和高尔基体-质膜膜泡运输的改造,都能提高CelA的表面展示效率,其中,Bos1p、Exo70p和Sec4最明显,使CelA细胞酶活分别提高了71%、90%和51%。同时,BGL1的细胞酶活也都获得了一定的提高。这说明,无论是内质网-高尔基体还是高尔基体-质膜的膜泡运输改造,都可以提高通过Aga1p-Aga2p展示的异源蛋白分泌。本研究分析了膜泡运输改造对异源蛋白胞外分泌的影响,并首次研究其对细胞表面展示蛋白的影响,发现不同蛋白在运输环节的限制节点不同,对优化分泌途径提供了重要的参考建议。酿酒酵母纤维小体的构建是CBP的研究热点。在酿酒酵母中,纤维小体的构制需要实现支架蛋白和至少叁种酶组分的异源表达。因此,将来源于热线梭菌初级支架蛋白CipA上的叁个粘连模块和底物结合模块(CBM)作为微型支架蛋白ScafCipA3,通过凝集素(Aga1-Aga2p)表面展示系统,成功的展示于酿酒酵母细胞表面,且展示百分率达到40%。同时,将扣囊覆膜胞酵母的BGL1(具有较高表达活性,见摘要1)融合上热纤梭菌木聚糖酶XynC的对接模块作为纤维小体降解纤维二糖的酶组分。为了获得具有高活性的另外两个酶组分,比较不同来源外切葡聚糖酶和内切葡聚糖酶融合相应对接模块的表达酶活,其中,埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii)的外切葡聚糖酶CBH1中具有最高的分泌活性,同时,热纤梭菌的内切葡聚糖CelA具有较高的分泌活性。这些酶组分通过对接模块与粘连模块的作用,成功的自组装到酿酒酵母细胞表面的支架蛋白上,CBH1、CelA和BGL1的自组装百分率分别3.8%、19.3%和2.5%。当提高酶组分的浓度,降低支架蛋白表达菌浓度后,CBH1、CelA和BGL1的自组装百分率明显增加了,分别达到了7.4%、94.3%和9.0%。微型纤维小体可直接利用磷酸膨胀纤维素(PASC)产生的乙醇,但产量较低。本研究提出了酶组分的表达量不足是纤维小体自组装效率低的限制性因素之一,为优化纤维小体的策略提供了思路。6、酿酒酵母通过二硫键自组装新型纤维小体及其复杂化的构制纤维小体是通过酶组分上的对接模块与支架蛋白上的粘连模块相互作用,自组装形成的蛋白复合物。蛋白与蛋白间的相互作用包括多种方式,例如抗原抗体作用、通过二硫键的相互作用等,是丰富纤维小体自组装方式极具潜力的工具蛋白。酿酒酵母凝集素a是由亚基Aga1p和Aga2p便是通过二硫键相互作用形成的蛋白复合物,其中,Aga1p的1-149氨基酸结构域(命名为AGA)主要负责与Aga2p形成二硫键。基于凝集素a的形成方式,我们将Aga1p的1-149氨基酸结构域作为粘连模块,Aga2p作为对接模块,设计了通过二硫键实现自组装的新型微型纤维小体。由叁个AGA与T. reesei外切葡聚糖酶的CBM融合形成的支架蛋白ScafAGA3,能够成功的通过Agalp的糖磷脂酰肌醇功能结构域展示于酿酒酵母的细胞表面,并且细胞的展示百分率达到了56%,明显高于热纤梭菌源的支架蛋白(约40%,见摘要5)。Aga2p与外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶和p-葡萄糖苷酶融合作为纤维小体酶组分aCBH1、aCelA和aBGL1,都能在酿酒酵母中实现活性表达。利用细胞壁蛋白Sedlp展示AGA,与aCelA共表达后能发生自组装,且自组装的百分率为11.7%,说明AGA能够发挥粘连模块的功能。aCBH1、aCelA和aBGL1分别与支架蛋白ScafAGA3共表达后,在细胞表面的自组装百分比分别是12.1%、28.3%和5.8%。通过二硫键自组装的新型纤维小体,利用PASC限氧发酵,能够产生0.925g/L的乙醇,比对照菌株(不表达支架蛋白)提高了50%。进而,将ScafAGA3作为锚定支架蛋白,热纤梭菌源支架蛋白ScafCipA3作为初级支架蛋白,使初级支架蛋白通过二硫键自组装到锚定支架蛋白上,再将纤维素酶酶组分通过对接模块-粘连模块作用方式自组装到初级支架蛋白上,形成具有双层支架蛋白的纤维小体结构。CBH1、CelA和BGL1能成功的实现与初级支架蛋白的自组装,但是自组装百分率较低,而通过增加酶组分浓度,降低支架蛋白表达菌浓度,可明显增加叁种酶组分的自组装细胞百分率,分别达到8.3%、99%和14.2%。双支架蛋白纤维小体利用PASC产生的乙醇产量为0.5 g/L。本论文通过分泌途径各个环节的改造和优化,包括蛋白折迭、新生肽链易位、蛋白糖基化、膜胞运输等环节的改造,提高纤维素酶等蛋白的分泌,发现蛋白糖基化的改造对于不同的蛋白具有普适性,而蛋白折迭、新生肽链易位、膜胞运输环节的改造具有蛋白特异性,发现了不同蛋白分泌的限制节点的差异,发掘了异源蛋白分泌的适配元件。在此基础上,构建了基于二硫键自组装的酿酒酵母新型纤维小体,克服了传统纤维小体展示效率低的问题。而本论文分泌途径的研究,也为进一步提高纤维小体关键组分的分泌和展示提供了坚实的理论基础。(本文来源于《山东大学》期刊2016-06-27）
郭建军,袁林,曾静,魏国汶,杨一兵[8]（2016）在《多角体包埋异源蛋白杆状病毒表达系统的构建》一文中研究指出[目的]探索多角体病毒的包装特性,构建能形成多角体包裹外源蛋白的polyh+Bac-to-Bac表达系统。[方法]通过酶切连接的方式,将4个元件片段:作为标记的绿色荧光基因EGFP,Bm CPV自身的多角体蛋白基因,用于基因表达的H1信号肽柔性连接肽,插入到质粒Fast Bac Dual中,利用Ac MNPV Bac-to-Bac系统,得到整合表达重组Bacmid:Ac-polyh/EGFP。将其感染Sf9细胞后,检测蛋白表达情况。[结果]利用该系统构建了一种能大量表达绿色荧光蛋白(EGFP)和能在胞质形成多角体的重组病毒v Bm Bac(polyh+)-EGFP。感染的Sf9细胞在荧光显微镜下观察发现EGFP与多角体可以在同一细胞中同时表达;从感染的Sf9细胞中收集纯化多角体,观察到多角体能被激发出绿色荧光,进一步利用Western blot证实多角体中含有EGFP。[结论]该表达系统为解决活性蛋白长期保存提供了新方法,同时拓宽了杆状病毒在开发含有毒素蛋白的新型生物杀虫剂和新型疫苗的转运载体等领域的应用前景。(本文来源于《安徽农业科学》期刊2016年02期）
吴妙鸿,何庆燕,洪永祥,周红,陈明[9]（2015）在《利用TGase交联动植物异源蛋白研制新型鸡肉丸》一文中研究指出目的:探究新型鸡肉丸的最优工艺条件,利用TGase交联鸡肉蛋白与芸豆蛋白,以期获得最优鸡肉丸品质。方法:以硬度为指标,利用单因素试验和响应面法筛选、优化,获得最优工艺条件。结果:TGase添加量、酶联时间、酶联温度对鸡肉丸硬度的影响极度显着,芸豆蛋白的添加量以及芸豆蛋白的加热程度对鸡肉丸硬度影响显着。响应面法优化得到的最优工艺条件:TGase添加量0.24%,交联时间65.62 min,交联温度43.63℃,芸豆蛋白添加量1.5%,在此条件下鸡肉丸的硬度为681.062 g。结论:利用TGase研制的新型鸡肉丸品质明显改善,对于生产应用有一定的实际意义。(本文来源于《中国食品学报》期刊2015年06期）
刘瑞[10]（2015）在《丝状真菌高效表达异源蛋白的研究进展》一文中研究指出丝状真菌是一种具有高效分泌蛋白质潜力的真核表达系统,在工业生产中常被用于生产多种生物酶和有机酸。本文综述了当前国内外对于丝状真菌作为细胞工厂生产异源蛋白的最新探索与进展,其中包括功能基因组学在蛋白表达与分泌研究中的应用,同时探讨了异源蛋白表达和生产的改进策略。(本文来源于《生物技术世界》期刊2015年06期）
异源蛋白论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
酿酒酵母是食品级安全性真菌,广泛应用于食品工业和生物医药领域。酿酒酵母细胞具有完善的蛋白质加工体系,确保蛋白质的折迭、翻译后修饰,目前已有多种药物蛋白由酿酒酵母生产。然而,酿酒酵母对异源蛋白的分泌水平普遍较低,严重制约了其的工业化应用。提高酿酒酵母分泌水平的方法主要是优化发酵和从基因层面调节异源蛋白分泌。目前酿酒酵母异源蛋白基因层面上的分泌策略主要以小分子蛋白质为研究对象,对30KDa以上的蛋白质种类研究较少。本文以漆酶(53KDa)为例,尝试寻找一系列适合较大分子的分泌表达策略。本文通过在酿酒酵母中优化漆酶的启动子、信号肽和共表达与异源蛋白合成和分泌相关的蛋白质(简称“辅助蛋白”),使漆酶的胞外分泌水平提高,还发现辅助蛋白组合可提高α-淀粉酶和增强型绿色荧光蛋白EGFP的分泌水平,具有一定的普遍适用性。具体研究如下:1、选择启动子TEF1和GAL1,构建并发酵产胞内酶菌株,以了解漆酶在酿酒酵母胞内的表达情况;在此基础上引入α-因子信号肽,构建产胞外酶菌株,发酵并测定胞内外酶活,纯化蛋白后跑SDS-PAGE,考察各菌株的漆酶表达水平。结果表明:所选漆酶基因能在酿酒酵母胞内表达和胞外分泌。在T=72h,启动子GAL1对应菌株的漆酶胞外酶活高于启动子TEF1对应菌株,分别为 129.73 ±2.57 U/L 和 30.52 ±2.56 U/L。因此,选 GAL1为胞外产酶菌的启动子用于后续实验。2、选取酿酒酵母天然α-因子信号肽、菊粉酶天然信号肽、合成信号肽以及漆酶天然信号肽,比较其介导的漆酶分泌效果。合成信号肽介导的漆酶胞外酶活和分泌率较α-因子信号肽分别提高了 1.39倍和99%,另外两种信号肽对应菌株未检测到胞外酶活。综合考虑胞外酶活和分泌率,确定合成信号肽用于后续实验。3、选取八个辅助蛋白,将其过表达,考察对漆酶分泌的作用。结果表明RPP0、SS02、BIP、PDI四个辅助蛋白使漆酶胞外酶活和分泌率提高,其胞外酶活依次下降。其中RPPO过表达的菌株B/pGSLC-yPRP的胞外酶活为444.24 ±2.82 U/L,分泌率为25.73 ±0.73%,分别较空白对照B/pGSLC-YEplac181 提高了 69%和 46%。4、考察分泌效果较好的PDI、BIP、SS02和RPP0四个辅助蛋白间的协同作用。结果表明RPP0和SS02,RPP0和BIP,RPP0和SecI叁组蛋白存在促进蛋白胞内表达和胞外分泌的协同作用。其中,RPP0和SS02的协同作用对漆酶分泌最显着,其胞外酶活为585.21 ±1.28 U/L,分泌率为30.36±0.71%,较过表达RPP0的菌株B/pGSLC-yPRP分别提高了 31%和18%,较空白对照B/pGSLC-YEplac181分别提高了 1.23倍和73.19%。5、考察辅助蛋白RPP0和SS02共表达对提高其他异源蛋白分泌水平的普遍适用性。结果表明RPP0和SS02共表达使得菌株的α-淀粉酶的胞外酶活较空白对照提高了 73%,EGFP发酵液上清的荧光强度较空白对照提高8%,RPPO和SS02共表达对于大分子蛋白质α-淀粉酶表现出更明显的促进分泌效果。最终,通过优化启动子、信号肽和过表达辅助蛋白,漆酶的胞外酶活从 30.52 ± 2.56 U/L 提高到 585.21 ± 1.28 U/L,提高了 18.17 倍。本课题的研究意义在于:运用基因层面上的调控策略,不仅提高了大分子蛋白质-漆酶在酿酒酵母中的分泌量,而且首次发现了辅助蛋白RPP0和SS02在提高异源蛋白分泌水平上具有较强的协同作用和普遍适用性,对提高其他异源蛋白在酿酒酵母的分泌水平具有一定的指导意义。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
异源蛋白论文参考文献
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