导读:本文包含了遗传修饰小鼠模型论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:CRISPR,Cas9,基因敲除,荧光报告基因,雪貂模型
遗传修饰小鼠模型论文文献综述
于淼[1]（2019）在《CRISPR/Cas9介导基因编辑制备FoxJ1缺失小鼠气道上皮细胞和遗传修饰雪貂模型》一文中研究指出基因编辑是指借助细胞自身的基因组损伤修复机制对目标基因的核苷酸序列进行碱基删除、插入、定点突变和组合编辑等基因操作技术。近年出现的CRISPR/Cas9定点基因编辑技术极大提高了基因编辑效率、推进了基因功能的研究,并在构建人类疾病模型、推动基因治疗、加快农作物和动物的遗传改良等领域有着巨大的应用潜力。在传统的呼吸道干细胞功能研究中,需要使用基因型相同的细胞群作为研究对象。如何运用CRISPR技术对呼吸道干细胞群进行基因编辑,并高效的筛选阳性编辑的细胞成为了一个急需攻克的难题。本研究首次将荧光报告基因的优势与CRISPR/Cas9介导的基因敲除技术的特点相结合,建立了有效的基因编辑细胞富集平台,突破了 CRISPR技术在干细胞研究领域的应用瓶颈。首先,采用经体外酶切筛选出高效靶向Loxp位点的sgRNA(LoxP-sgRNA)转染表达Cas9的ROSA26-LoxP-tdTomato-stop-LoxP-EGFP(ROSA-TG)报告基因小鼠气道上皮细胞,结果发现CRISPR/Cas9高效介导LoxP位点中间的tdTomato基因剪切,红色荧光细胞向绿色和无色荧光的转变率达到72.7%。扩增并亚克隆转染细胞基因组内2个Loxp中间的序列,测序分析证实绝大部分克隆发生了双酶切(96.6%)。其次,使用该LoxP-sgRNA同2条靶向小鼠FoxJl基因2号外显子的sgRNA共转染上述ROSA-TG细胞,用流式细胞术筛选绿色荧光转换细胞作为FoxJl基因敲除富集细胞。对亚克隆绿色细胞FoxJl基因两个识别位点内的序列分析来评估该平台的富集效果,发现所有来自绿色荧光细胞的克隆子在FoxJl基因内100%发生了靶向双位点酶切(26/26),而红色细胞内只有25%发生了双酶切(7/28)。基因表达分析进一步证实绿色荧光细胞内未检测到FoxJl的mRNA转录。上皮细胞分化试验结果显示,绿色荧光细胞分化的气道上皮中纤毛细胞占4.32%,而红色细胞中的纤毛细胞占38.5%。对囊性纤维化跨膜转运调节体(CFTR)介导的上皮细胞电生理功能分析进一步表明,无Loxp剪切的红色荧光细胞来源上皮中CFTR介导的诱导微电流和抑制微电流分别为33.6μA/cm3和64.5μA/cm3,分别是绿色荧光细胞诱导微电流7.21μA/cm3和抑制微电流13.4μA/cm3的4.66倍和4.81倍。说明FoxJl基因的敲除对细胞分化后的CFTR氯离子通道产生了明显的抑制作用。同时,为扩展该基因编辑细胞富集平台的应用,本研究额外筛选了靶向敲除EGFP和tdTomato基因的sgRNA,可用红、绿色荧光的淬灭作为替代筛选标签。与小鼠呼吸道比较,雪貂的呼吸道无论在生理学还是细胞组成与生物学方面都更接近于人类。表达平滑肌肌动蛋白(αSMA)的气道肌上皮细胞最近被确定为气道上皮内的重要干细胞亚群,在气道上皮的损伤修复和维护气道稳态方面发挥主要作用。为深入研究肌上皮干细胞的发育来源和慢性呼吸道疾病的病理发生,本项目在前期建立CRISPR/Cas9基因编辑细胞富集平台工作的基础上,进一步构建了雪貂ROSA-TG和αSMA-CreERT2品系报告基因模型。在技术上,为探索一种利用CRISPR技术快速、高效构建雪貂模型的新方法,本研究在构建这些转基因雪貂模型时分别尝试利用细胞内的两种不同的DNA损伤修复机制——非同源末端连接(NHEJ)和同源重组修复(HDR)来介导敲入。在雪貂ROSA-TG品系构建过程中,首先在雪貂基因组中设计了 3条靶向ROSA基因的sgRNA,并用体外酶切法筛选出最优的1条用于试验。将克隆构建好的供体质粒消化为单链DNA后与sgRNA共同显微注射到179枚雪貂受精卵中。将151枚发育到2细胞阶段的受精卵移植到5只假孕受体雪貂体内,产生了 23只雪貂幼崽。经PCR基因分型、测序分析及Southern blot验证,获得了 4只健康的ROSA位点敲入荧光报告系统TG的转基因杂合体雪貂。使用表达Cre重组酶的腺病毒感染转基因雪貂的纤维细胞的试验和Southern印迹法均证实了敲入的Cre/LoxP荧光报告系统的有效性和准确性。同样,在αSMA-CreERT2品系雪貂构建中,使用设计并筛选出的最佳的1条靶向雪貂基因组ACTA2基因的sgRNA,与构建好的单链DNA供体质粒共同显微注射到155枚雪貂受精卵内。将得到的110枚发育到2细胞阶段的受精卵移植到5只假孕受体雪貂体内,共产生16只雪貂幼崽。经PCR基因分型、测序分析及Southern印迹法验证,共获得4只健康的具有转基因靶向敲入的杂合体雪貂。通过对αSMA-CreERT2转基因雪貂纤维细胞的Cre报告基因慢病毒感染、TGFβ激活αSMA的表达和他莫昔芬协助Cre入核转运试验,证实了基因组整合的各个功能元件均具有完全功能。综上所述,本论文充分利用了 CRISPR/Cas9技术的无种属限制、特异性强和高效快捷的优势,将试验内容从小鼠原代细胞基因敲除株的建立逐步深入到转基因雪貂模型的构建,研究对象从体外小鼠气道上皮基底干细胞逐步扩展到体内雪貂受精卵和组织特异性的肌上皮干细胞,研究方式从荧光基因敲除延伸到分别利用NHEJ和HDR通路进行报告基因敲入。为CRISPR技术以及转基因雪貂模型在干细胞研究领域的广泛应用打下基础。本项目建立的雪貂模型可用于针对肌上皮干细胞的谱系追踪研究,以揭示呼吸道干细胞功能、修复再生以及细胞异常增生的发生机制。本研究内容将为利用CRISPR/Cas9技术制备基因修饰原代细胞模型,以及利用雪貂模型研究呼吸道干细胞生物学提供技术方法和有效可靠的模型。(本文来源于《宁夏大学》期刊2019-03-01）
肖怡青[2]（2017）在《GDM小鼠模型构建及宫内高糖环境对其子代小鼠胰腺表观遗传修饰的影响》一文中研究指出背景与目的:妊娠糖尿病(gestational diabetes mellitus,GDM):是指妊娠期首次发现或发生的不同程度的糖代谢异常,是妊娠期常见的并发症之一。GDM不仅对孕妇产生许多不良影响,对其子代的近期、远期也有一定的不良影响。越来越多的流行病学研究发现,暴露于宫内高血糖环境的子代罹患肥胖、2型糖尿病、心血管疾病的风险增加,但目前国内对GDM子代疾病易感性作用机制的相关性研究较少,了解仍不深入。因此,本研究旨在构建稳定、可靠的妊娠糖尿病小鼠模型,取其子代胰腺组织进行简化表观亚硫酸盐测序,与健康小鼠子代进行对比,探讨高糖环境对其子代小鼠胰腺表观遗传修饰的影响,进而从分子水平上进一步揭示GDM子代罹患2型糖尿病风险增加的相关机制,为临床对GDM患者的干预以及减轻、避免宫内高血糖环境对子代近期、远期代谢的影响提供新的思路。方法:1.构建动物模型:选取90只SPF级健康C57BL/6J小鼠,雌鼠60只,雄鼠30只,将60只雌鼠随机分为6组:对照组、A组、B组、C组、D组和E组。将各组小鼠按雌雄比例2:1进行雌雄合笼,确定受孕成功之日后,A组、B组、C组、D组和E组孕鼠分别按照100mg/kg、120 mg/kg、150 mg/kg、180 mg/kg、200 mg/kg剂量一次性腹腔注射STZ溶液,对照组给予同体积的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。分别于妊娠第2.5、3.5、4.5、10.5、17.5天测随机血糖,分别于妊娠第5.5、11.5、18.5天测空腹血糖和体重,每日测摄食量和饮水量,观察尿量变化。2.简化型表观亚硫酸盐测序:分别取3周龄GDM和正常对照组子代小鼠胰腺组织,进行简化型表观亚硫酸盐测序,比较两组样本的平均甲基化水平,进行差异甲基化分析以及差异甲基化相关的GO聚类分析。结果:1.动物模型的构建:C组、D组和E组小鼠给药后空腹血糖及随机血糖较对照组明显升高饮水量及尿量较对照组也明显增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。A组、B组孕鼠给药后,空腹血糖和随机血糖未见明显升高,妊娠期饮水量和尿量较对照组未见明显差异。随着周龄及妊娠天数增加,A组、B组和对照组小鼠体重逐渐增加,增加幅度较一致,C组、D组和E组小鼠妊娠初期体重增加,而妊娠晚期由于血糖过高、或出现流产现象导致体重减轻。A组、B组及对照组产仔数量无明显差异,C组、D组、E组产仔数量较对照组明显减少,且D组和E组孕鼠流产率及死亡率远也高于其它组。整个妊娠期,A组和B组孕鼠没有一只达到成模标准;C组孕鼠在妊娠初期、中期、晚期造模成功率分别为70%、70%、90%;D组孕鼠在妊娠初期、中期、晚期造模成功率分别为70%、80%、60%;E组孕鼠在妊娠初期、中期、晚期造模成功率分别为80%、70%、50%。2.简化型表观亚硫酸盐测序:两组样本启动子区域和CGI的CG位点的甲基胞嘧啶所占的比例最大。经对比发现,GDM子代组位于启动子区域的叁种类型的平均甲基化水平均高于正常子代组,位于CGI区域的m CG甲基化水平GDM子代组明显高于正常子代组。关于差异甲基化,GDM子代组与正常子代组两两进行比较(con1与test1,con2与test2,con4与test3),合计MDR数目分别为53、49、97,且参与了生物学过程中的生物调节、组织或生物起源细胞组件、细胞过程、发育过程、代谢过程、生物过程的调控等;细胞组分中的细胞、细胞部分、膜、细胞器、细胞器部分等;以及分子功能中的缠绕、催化活性、分子传感器活性、核酸绑定转录因子的活性、信号传感器活性等过程。总结:1.C组孕鼠给药后血糖升高明显,且整个妊娠期均可维持血糖在较高水平,成模率较高,死亡率及流产率低,因此按照STZ 150mg/kg剂量构建的GDM小鼠模型最稳定。2.宫内高血糖的子代小鼠胰腺发生了DNA甲基化模式的改变,可能是造成其子代对肥胖、糖尿病、心血管疾病等易感的原因之一。(本文来源于《福建医科大学》期刊2017-05-01）
兰雨,李专,李芳菲,王友亮,贺文艳[3]（2012）在《利用遗传修饰小鼠模型揭示造血干细胞发育的新位点》一文中研究指出组织特异性Cre重组酶转基因小鼠一方面为研究基因在特定细胞类型的生理功能提供了重要的工具小鼠,另一方面可以实现细胞命运的体内示踪,近年来成为发育生物学研究的一把利器。本研究利用SP-A启动子创建了国际上首例脑血管内皮细胞特异性Cre重组酶转基因小鼠。我们首先利用该小鼠建立了首例脑血管内皮细胞特异性基因敲除小鼠,发现脑血管内皮特异性Smad4基因敲除导致小鼠因颅内出血死于围产期,建立了一种新型的新生儿颅内出血的遗传修饰小鼠模型。机制研究发现Smad4通过与Notch的胞内段共同结合在N-cadherin启动子的RBP-J结合位点发挥对N-cadherin的转录调节作用,进而稳定脑血管内皮细胞-周细胞的相互作用并维持脑血管的完整性,阐明了一种围产期脑血管完整性维持的全新机制。进一步,利用该Cre重组酶转基因小鼠结合ROSA报告小鼠的研究显示,胚胎发育中期的脑血管内皮细胞可以原位产生造血细胞,并且贡献了成体的造血干细胞以及造血各系的终末分化细胞。这是首次利用位点特异性表达Cre重组酶的示踪小鼠模型揭示成体造血细胞胚胎起源的研究。我们同时应用另外一种Cre重组酶转基冈小鼠——可诱导性VE-Cadherin-Cre转基冈小鼠的示踪系统,研究同样显示胚胎发育中的头部血管具有内皮生血的特性。上述研究揭示小鼠胚胎头部是造血干细胞发育的新位点。(本文来源于《遗传学进步促进粮食安全与人口健康高峰论坛论文集》期刊2012-08-14）
谢菲,陈晗,李建明,丁彦青[4]（2009）在《遗传修饰小鼠肿瘤模型的进展》一文中研究指出小鼠肿瘤模型在揭示肿瘤病因、探索发病机制和评估治疗措施中发挥着不可替代的重要作用,已经被广泛地应用于肿瘤的基础和临床研究。转基因和基因敲除等新技术的发展及其在小鼠肿瘤模型中的应用为我们建立了各种模拟人类相应肿瘤的模型,深化了我们对肿瘤和肿瘤相关基因功能的认识,再现了肿瘤发生发展的过程。(本文来源于《中国热带医学》期刊2009年02期）
崔芳,王友亮,杨晓[5]（2004）在《遗传修饰小鼠模型在功能蛋白质组学研究中的应用》一文中研究指出功能蛋白质组学是蛋白质组学研究的重要分支 ,其研究与发展对获得蛋白质的功能信息具有重要作用。各种遗传修饰小鼠模型是研究功能基因组学的有力工具 ,在功能蛋白质组学的研究中 ,这项技术的应用也日益广泛。本文综述了利用肝脏、神经系统、心脏疾病的小鼠模型进行蛋白质组学研究取得的有意义的结果。(本文来源于《军事医学科学院院刊》期刊2004年05期）
遗传修饰小鼠模型论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
背景与目的:妊娠糖尿病(gestational diabetes mellitus,GDM):是指妊娠期首次发现或发生的不同程度的糖代谢异常,是妊娠期常见的并发症之一。GDM不仅对孕妇产生许多不良影响,对其子代的近期、远期也有一定的不良影响。越来越多的流行病学研究发现,暴露于宫内高血糖环境的子代罹患肥胖、2型糖尿病、心血管疾病的风险增加,但目前国内对GDM子代疾病易感性作用机制的相关性研究较少,了解仍不深入。因此,本研究旨在构建稳定、可靠的妊娠糖尿病小鼠模型,取其子代胰腺组织进行简化表观亚硫酸盐测序,与健康小鼠子代进行对比,探讨高糖环境对其子代小鼠胰腺表观遗传修饰的影响,进而从分子水平上进一步揭示GDM子代罹患2型糖尿病风险增加的相关机制,为临床对GDM患者的干预以及减轻、避免宫内高血糖环境对子代近期、远期代谢的影响提供新的思路。方法:1.构建动物模型:选取90只SPF级健康C57BL/6J小鼠,雌鼠60只,雄鼠30只,将60只雌鼠随机分为6组:对照组、A组、B组、C组、D组和E组。将各组小鼠按雌雄比例2:1进行雌雄合笼,确定受孕成功之日后,A组、B组、C组、D组和E组孕鼠分别按照100mg/kg、120 mg/kg、150 mg/kg、180 mg/kg、200 mg/kg剂量一次性腹腔注射STZ溶液,对照组给予同体积的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。分别于妊娠第2.5、3.5、4.5、10.5、17.5天测随机血糖,分别于妊娠第5.5、11.5、18.5天测空腹血糖和体重,每日测摄食量和饮水量,观察尿量变化。2.简化型表观亚硫酸盐测序:分别取3周龄GDM和正常对照组子代小鼠胰腺组织,进行简化型表观亚硫酸盐测序,比较两组样本的平均甲基化水平,进行差异甲基化分析以及差异甲基化相关的GO聚类分析。结果:1.动物模型的构建:C组、D组和E组小鼠给药后空腹血糖及随机血糖较对照组明显升高饮水量及尿量较对照组也明显增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。A组、B组孕鼠给药后,空腹血糖和随机血糖未见明显升高,妊娠期饮水量和尿量较对照组未见明显差异。随着周龄及妊娠天数增加,A组、B组和对照组小鼠体重逐渐增加,增加幅度较一致,C组、D组和E组小鼠妊娠初期体重增加,而妊娠晚期由于血糖过高、或出现流产现象导致体重减轻。A组、B组及对照组产仔数量无明显差异,C组、D组、E组产仔数量较对照组明显减少,且D组和E组孕鼠流产率及死亡率远也高于其它组。整个妊娠期,A组和B组孕鼠没有一只达到成模标准;C组孕鼠在妊娠初期、中期、晚期造模成功率分别为70%、70%、90%;D组孕鼠在妊娠初期、中期、晚期造模成功率分别为70%、80%、60%;E组孕鼠在妊娠初期、中期、晚期造模成功率分别为80%、70%、50%。2.简化型表观亚硫酸盐测序:两组样本启动子区域和CGI的CG位点的甲基胞嘧啶所占的比例最大。经对比发现,GDM子代组位于启动子区域的叁种类型的平均甲基化水平均高于正常子代组,位于CGI区域的m CG甲基化水平GDM子代组明显高于正常子代组。关于差异甲基化,GDM子代组与正常子代组两两进行比较(con1与test1,con2与test2,con4与test3),合计MDR数目分别为53、49、97,且参与了生物学过程中的生物调节、组织或生物起源细胞组件、细胞过程、发育过程、代谢过程、生物过程的调控等;细胞组分中的细胞、细胞部分、膜、细胞器、细胞器部分等;以及分子功能中的缠绕、催化活性、分子传感器活性、核酸绑定转录因子的活性、信号传感器活性等过程。总结:1.C组孕鼠给药后血糖升高明显,且整个妊娠期均可维持血糖在较高水平,成模率较高,死亡率及流产率低,因此按照STZ 150mg/kg剂量构建的GDM小鼠模型最稳定。2.宫内高血糖的子代小鼠胰腺发生了DNA甲基化模式的改变,可能是造成其子代对肥胖、糖尿病、心血管疾病等易感的原因之一。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
遗传修饰小鼠模型论文参考文献
[1].于淼.CRISPR/Cas9介导基因编辑制备FoxJ1缺失小鼠气道上皮细胞和遗传修饰雪貂模型[D].宁夏大学.2019
[2].肖怡青.GDM小鼠模型构建及宫内高糖环境对其子代小鼠胰腺表观遗传修饰的影响[D].福建医科大学.2017
[3].兰雨,李专,李芳菲,王友亮,贺文艳.利用遗传修饰小鼠模型揭示造血干细胞发育的新位点[C].遗传学进步促进粮食安全与人口健康高峰论坛论文集.2012
[4].谢菲,陈晗,李建明,丁彦青.遗传修饰小鼠肿瘤模型的进展[J].中国热带医学.2009
[5].崔芳,王友亮,杨晓.遗传修饰小鼠模型在功能蛋白质组学研究中的应用[J].军事医学科学院院刊.2004