导读:本文包含了中国野生葡萄基因论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:中国野生葡萄,芪合成酶基因,表达调控,白藜芦醇
中国野生葡萄基因论文文献综述
马福利[1]（2018）在《中国野生葡萄芪合成酶基因表达与抗白粉病功能研究》一文中研究指出葡萄是世界性栽培的主要果树之一,不仅用途广泛,还具有良好的经济效益。生产上主栽品种欧洲葡萄高产优质风味佳,但其突出缺点是易感病,尤其是葡萄白粉病。葡萄中的白藜芦醇及其衍生物,在葡萄体内具有植保素的抗病功能,人食用后对身体健康具有抗癌、抗氧化和抗衰老等保健功能。因此,研究葡萄芪合成酶基因及其表达产物白藜芦醇的作用,是近年来研究者提高与改良酿酒和鲜食品种抗病性与品质的重要科学问题之一。本研究以中国野生葡萄种质为材料进一步分析了自然条件下芪合成酶组织水平和亚细胞水平表达特点;分析调控葡萄芪合成酶基因表达的信号途径和关键节点基因功能;研究诱导条件下芪合成酶及其产物合成、转运、降解和作用方式;研究芪类物质抗葡萄白粉病的作用,为利用中国野生葡萄的抗病性与芪合成酶基因改良欧洲葡萄抗病性提供依据,主要研究与结果如下:(1)中国野生华东葡萄芪合成酶基因VpSTS29及芪类物质呈现组织特异性表达。芪合成酶基因STS29在华东葡萄‘白河-35-1’和欧洲葡萄无核白的成熟叶片、毛葡萄‘丹凤-2’成熟果实中高表达。芪合成酶VpSTS29在转基因葡萄株系的根和成熟叶片中积累。芪合成酶表达的产物白藜芦醇及白藜芦醇苷主要分布在根、茎和成熟叶片中。在转基因拟南芥株系中芪合成酶VpSTS29及白藜芦醇苷积累在成熟的叶片中,并在发育进程维持较高水平的叶绿素含量和光化学效率以延迟植株衰老。(2)芪合成酶基因VpSTS29受生物与非生物胁迫诱导表达。中国野生华东葡萄‘白河35-1’在接种白粉菌后48 h至72 h和144 h,芪合成酶基因VpSTS29表达量较高。在其他生物小分子SA、ABA、MeJA和Ethylene、非生物类因子高盐、干旱、创伤、低温和UV-C光等胁迫处理条件下,VpSTS29基因均上调表达。此外,UV-C光处理诱导芪合成酶基因VpSTS29显着表达。进一步研究表明UV-C辐射诱导VpSTS29蛋白表达和芪类物质合成,且发现从细胞质向叶绿体迁移的现象。表型观察表明转基因无核白增强了对UV-C辐射的敏感性:叶片表现出干枯和烧焦状且降低H_2O_2的含量。定量RT-PCR分析表明VpSTS29转基因无核白改变了响应氧化还原、芪类物质合成和光胁迫相关基因的表达。拟南芥原生质体瞬时转化实验表明过表达芪合成酶基因VpSTS29也能降低细胞内部H_2O_2的含量。这些结果说明芪合成酶受环境胁迫诱导与表达,在细胞器间存在动态分布,并促进芪类物质的积累。综上芪合成酶基因VpSTS29既受生物胁迫诱导表达,又受非生物胁迫诱导表达。因此,该基因在葡萄生长发育过程中起到抗病与积极适应逆境胁迫的作用。(3)交叉嫁接实验结果表明芪合成酶VpSTS29蛋白不存在组织间的运输;在砧木过表达芪合成酶基因VpSTS29能显着提高接穗芪类物质含量。原位荧光观察结果表明VpSTS29蛋白主要分布在根尖分生区、茎的维管组织以及叶片的叶肉组织。亚细胞定位分析表明芪合成酶VpSTS29定位于细胞质以及球状体胞器。尼罗红染色、胞器标记基因共定位以及免疫组化分析证实该球状体为油体,且在特定发育阶段这些油体游离在细胞质和液泡中。蛋白表达模式分析证实定位于细胞质、油体和液泡中的绿色荧光为VpSTS29-GFP融合蛋白。共定位和抑制试验结果表明油体定位的VpSTS29是通过自噬途径转运至液泡的。综上在葡萄体内芪合成酶VpSTS29经内质网衍生的油体通过自噬途径转运至液泡中。芪合成酶及其产物在合成后存在动态再分配,以满足植物生长发育的需要。(4)RT-PCR分析表明在白粉菌接种后24 h至48 h转基因葡萄芪合成酶基因表达强度显着高于非转基因葡萄,芪合成酶基因VpSTS29改变了感病葡萄无核白内源芪合成酶基因及病程相关蛋白基因对白粉菌入侵的应答时间以及表达强度。通过大麦凝集素染色、基因枪轰击、原位荧光观察以及免疫印迹分析证明了转基因葡萄中芪合成酶VpSTS29是通过增强叶肉组织的表达以及合成有活性的葡萄素积累在侵入位点,进一步抑制病原菌入侵。在不含有芪合成酶基因的模式植物拟南芥中转入VpSTS29基因,转基因拟南芥积累VpSTS29蛋白和白藜芦醇苷,表现出抑制菌丝生长、局部发生过敏反应以及降低病原菌侵入率。外源施加水杨酸SA和白藜芦醇均能促进VpSTS29蛋白的表达和trans-piceid的累积。SA信号途径与白藜芦醇合成途径在病原菌防御中密不可分。这些结果表明,芪合成酶基因表达及芪类物质积累增强转基因VpSTS29欧洲葡萄无核白和拟南芥对白粉病抗性。(5)R2R3类型转录因子MYB14和MYB15在中国野生葡萄和欧洲葡萄中氨基酸序列较为保守,且直接结合芪合成酶基因VpSTS29的启动子。此外,通过中国野生毛葡萄‘丹凤-2’果实发育转录组数据鉴定了调控芪合成酶基因表达的bHLH类型的转录因子基因VqICE1。共表达分析表明VqICE1与26个芪合成酶基因存在表达相关性。酵母单杂交实验表明VqICE1能结合group-B亚家族的芪合成酶基因VqSTS15、VqSTS27和VqSTS48启动子区域,且降低这些芪合成酶基因启动子的转录活性。而VqMYB14和VqMYB15正调控这些芪合成酶基因启动子活性。VqICE1可与VqMYB14和VqMYB15在细胞核中相互作用,并直接结合VqMYB14启动子,降低VqMYB14的表达和trans-piceid的积累。白粉菌诱导条件下,野生型无核白葡萄中芪合成酶基因整体水平、MYB14和MYB15受诱导表达;过表达VqICE1降低了白粉菌侵染后期芪合成酶基因整体水平和MYB14的表达。这些结果表明VqICE1负调控芪合成酶基因的表达,以维持抗病作用后芪类物质含量恢复到正常水平。综上所述,芪合成酶基因VpSTS29及芪类物质呈现组织特异性,且受生物与非生物逆境胁迫诱导表达;芪合成酶及其产物在植物特定生长发育阶段通过自噬途径转运至液泡储藏;芪类物质在白粉菌诱导条件下迅速合成与积累,在病菌侵入位点参与抗病;此外,芪合成酶基因行使抗病功能后受转录因子基因调控。所以,芪合成酶基因VpSTS29具有增强葡萄中芪类物质积累与抗病性的作用。(本文来源于《西北农林科技大学》期刊2018-12-01）
焦韵桐[2]（2017）在《中国野生葡萄芪合成酶基因表达调控研究》一文中研究指出葡萄是世界性重要的经济类作物之一,特别是欧洲葡萄品种,其品质优良,具有很高的经济地位,但抗病性较差。中国是葡萄属植物的起源地之一,拥有丰富的抗性野生葡萄种质资源,这些资源具有良好的抗病性。其中,中国野生华东葡萄株系‘白河-35-1’具有高抗葡萄白粉病的特性;中国野生毛葡萄‘丹凤-2’的白藜芦醇含量较高。白藜芦醇属于芪类化合物,不仅是一类重要的植保素可以增强植物的抗病性,而且还具有清除活性氧、抗肿瘤、预防心血管疾病等医疗保健功能。本研究以高抗葡萄白粉病的中国野生华东葡萄‘白河-35-1’、高含量白藜芦醇的中国野生毛葡萄‘丹凤-2’为试材,通过生物和非生物胁迫处理,研究获得了调控芪合成酶基因的相关信号物质水杨酸,揭示葡萄中水杨酸信号物质调节芪合成酶基因表达产物抗白粉病的分子过程,也探究了MAPK级联途径对毛葡萄芪类物质积累的作用。取得的主要研究结果如下:1.从中国野生华东葡萄‘白河-35-1’和欧洲葡萄‘佳利酿’基因组DNA中分别克隆获得了一对芪合成酶等位基因及其启动子序列。两个芪合成酶基因组序列结构分析表明:两条序列的STS基因序列部分高度保守(碱基序列相似度98.63%),均为1538bp,包含一个内含子和两个外显子;外显子1的核苷酸长度为178 bp,内含子长度为360 bp,外显子2的长度为1000 bp;可编码392个氨基酸的蛋白(氨基酸序列相似度99.49%)。而各自的芪合成酶基因上游调控启动子序列同源性差异较大,主要表现为缺失;克隆获得的华东葡萄VpSTS启动子片段核苷酸长度为2264 bp,克隆获得的欧洲葡萄‘佳利酿’VvSTS启动子片段核苷酸长度为2021 bp;序列比对显示VpSTS启动子有一段18 bp的缺失,而VvSTS启动子有两段缺失,分别为13 bp和244 bp。2.构建了野生华东葡萄‘白河-35-1’和欧洲葡萄‘佳利酿’芪合成酶基因启动子与GUS报告基因融合载体,稳定整合转化模式植物拟南芥中,应用Real-time quantitative PCR(qRT-PCR)分析了两个转基因植株中GUS基因的表达模式。结果表明,‘白河-35-1’芪合成酶基因(VpSTS)启动子驱动的GUS基因在根、茎、叶片、花芽和果荚中均表达,而‘佳利酿’芪合成酶基因(VvSTS)启动子驱动的GUS基因仅在叶片中表达。用拟南芥白粉菌(Golovinomyces cichoracearum strain UCSC1)侵染转基因拟南芥植株,结果表明:二者均为病原菌诱导型启动子,并且VpSTS基因启动子的活性显着高于VvSTS启动子。同时,构建了2个芪合成酶基因启动子与各自芪合成酶基因融合的植物表达载体,稳定整合转入模式植物拟南芥中。在接种拟南芥白粉菌情况下,转VpSTS::STS基因植株的抗病性明显强于野生型和转VvSTS::STS基因拟南芥,且其叶片中芪类物质含量明显高于转VvSTS::STS基因的植株。3.构建了芪合成酶基因启动子与双荧光素酶报告基因融合载体,通过基因枪法瞬时转入欧洲葡萄‘黑比诺’悬浮细胞中,对启动子活性进行分析。结果表明,‘白河-35-1’VpSTS启动子能够响应细菌鞭毛蛋白flg22的诱导,而‘佳利酿’VvSTS启动子对flg22则没有响应;两种启动子对紫外诱导和植物过敏性致病蛋白harpin诱导均无响应。在外源水杨酸(Salicylic acid,SA)和茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate,MeJA)处理下,VpSTS启动子对水杨酸诱导的表达活性显着高于VvSTS启动子;两种启动子对MeJA的响应均相对较弱而且差异不显着。通过对水杨酸激活芪合成酶基因启动子过程中的信号通路分析,认为VpSTS启动子响应水杨酸时依赖于钙离子通道的打开、活性氧爆发、MAPK级联途径的激活以及茉莉酸的合成。4.从中国野生毛葡萄‘丹凤-2’中克隆了促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶基因VqMAPKKK38,开放阅读框全长为1419 bp,定位于葡萄第5号染色体上,属于MAPKKK基因家族中的RAF类亚家族。该序列编码472个氨基酸,含有Gln~(203)到Leu~(450)的蛋白激酶催化结构域,其中包含一个Ser/Thr催化位点(VIHCDLKPKNILL)。应用qRT-PCR技术分析了VqMAPKKK38在生物和非生物胁迫下的表达模式,结果表明VqMAPKKK38响应葡萄白粉菌的侵染、高盐胁迫和低温胁迫,而不受高温胁迫和机械损伤的诱导表达。外源激素SA、MeJA、脱落酸(ABA)和乙烯(Ethylene)处理均能诱导VqMAPKKK38表达,其中VqMAPKKK38受SA诱导表达量最高。5.分别构建了中国野生毛葡萄‘丹凤-2’VqMAPKKK38基因过量表达和干扰表达的植物表达载体,通过农杆菌介导瞬时转化‘丹凤-2’叶片,结合qRT-PCR和HPLC技术,检测了上述两个表达载体转化的葡萄叶片中芪合成酶基因表达水平和芪类物质的含量。结果表明:VqMAPKKK38基因通过正向调控芪合成酶基因的表达而提高葡萄芪类物质的积累。而用钙离子通道抑制剂氯化钆和活性氧清除剂二甲基硫脲预处理后,再经氯化钙和过氧化氢处理的‘丹凤-2’叶片,检测其VqMAPKKK38基因表达量显着降低。结果证明钙离子信号和活性氧(ROS)信号位于VqMAPKKK38基因的上游,激活VqMAPKKK38的表达;同时也正调控葡萄芪合成酶基因的激活和芪类物质的积累。综上,中国野生葡萄芪合成酶基因的表达与产物的积累受信号物质水杨酸的调控;并推测中国野生毛葡萄‘丹凤-2’中的MAPKKK38对芪合成酶基因的表达以及芪类物质的积累有着积极的作用。(本文来源于《西北农林科技大学》期刊2017-12-01）
文志丰[3]（2015）在《中国野生葡萄编码NB-ARC结构的抗白粉病基因克隆及功能分析》一文中研究指出葡萄(Vitis spp.)是世界上重要的经济水果,葡萄白粉病是由葡萄白粉菌(Uncinula necator[Schw.]Burr.)引起的危害葡萄生产的主要真菌病害之一,给葡萄生产造成巨大的经济损失。中国野生华东葡萄白河-35-1(Chinese wild Vitis pseudoreticulata‘Baihe-35-1’)和毛葡萄商-24(Vitis quinquangularis‘Shang-24’)对白粉病具有很强的抗性,挖掘中国野生葡萄抗白粉病基因和研究其功能对葡萄抗病育种具有重要的意义。本研究在项目组前期研究基础上,克隆了中国野生葡萄白河-35-1抗白粉病相关基因VpCN和VpTNL1、毛葡萄商-24 VqTNL2及其启动子序列,构建了过表达载体和瞬时表达载体分别转化拟南芥和葡萄,对其抗病功能和启动子活性进行了验证;克隆了中国野生葡萄RPM1类基因,进行了其表达和生物信息学分析,取得以下主要研究结果:1、从前期中国野生华东葡萄白河-35-1转录组数据库中发现一条抗白粉病候选基因,命名为VpCN,其在接种白粉菌后诱导表达,克隆测序后,其开放阅读框(ORF)长1,773bp,编码590个氨基酸。生物信息学分析显示其N端含有一个Rx-CC like结构域,C端含有一个保守的NB-ARC结构域,异源表达VpCN的拟南芥植株出现叁种表型:正常表型、侏儒型和叶片融合表型。正常表型增强了拟南芥对白粉病菌(Golovinomyces cichoracearum)和Pst DC3000的抗性。克隆其启动子,并构建了启动子与GUS报告基因融合载体,在欧洲葡萄“红地球”叶片瞬时表达显示启动子有病原菌诱导活性。进一步对启动子5'端缺失分析并与GUS报告基因融合,在葡萄叶片中瞬时表达显示起始密码子(ATG)上游400 bp序列有可能是响应白粉菌最短片段,TC rich repeats作用元件有可能参与响应葡萄白粉菌。2、从前期中国野生华东葡萄白河-35-1转录组数据库中发现一条抗白粉病候选基因,命名为VpTNL1,其在接种白粉菌后诱导表达,克隆测序后其全长3,903 bp,ORF长2,622bp,推导编码873个氨基酸,3'UTR长1281 bp。其定位在18号染色体上,包含4个外显子和3个内含子。生物信息学分析显示其N端预测有类似动物白介素I受体的TIR结构域和一个NB-ARC结构域,其C端含有4个连续的LRR结构域。异源表达VpTNL1的拟南芥植株出现两种表型:侏儒型和正常表型。正常表型增强了对拟南芥白粉菌(G.cichoracearum)和Pst DC3000的抗性。对其启动子克隆和顺式作用元件预测显示:其启动子序列含有与病原菌及非生物胁迫相关的顺式作用元件。将其与GUS报告基因融合,构建瞬时表达载体后转化欧洲葡萄“红地球”叶片,结果显示启动子具有活性。对启动子5'端缺失分析显示,TCA element作用元件可能参与响应SA,TC rich repeats作用元件可能参与响应葡萄白粉菌。3、从前期中国野生毛葡萄商-24株系中的转录组数据库中发现一条抗白粉病候选基因,命名为VpTNL2,在接种白粉菌后VpTNL2诱导表达下调,分析了在根、茎、叶、花和果皮中的表达模式,VpTNL2在上述不同组织中存在着表达差异。克隆测序显示,cDNA全长3,835 bp,ORF长3,783 bp,编码1,260个氨基酸。生物信息分分析显示其N端存在着一个TIR结构域和NB-ARC结构域,C端存在着6个连续LRR结构域。克隆其启动子并对启动子元件预测,启动子序列含有多个参与生物胁迫和非生物胁迫的作用元件,构建了启动子融合GUS报告基因的瞬时表达载体,采用农杆菌介导的瞬时转化法转入葡萄叶片后,证明其启动子有活性。4、从中国野生华东葡萄白河-35-1克隆了VpRPM1,VpRPM1-4和VpRPM1-5,ORF长度分别为2,794 bp,465 bp和2,556 bp,从中国野生毛葡萄中克隆出VqRPM1-2和VqRPM1-3,ORF长分别为2805和2727 bp,其推导的氨基酸都具有保守的NB-ARC结构域。对其在白粉菌侵染后的表达分析显示,5个基因都显着下调。对欧亚葡萄“黑比诺”RPM1类基因生物信息学分析表明,在基因组中鉴定出17个RPM1类基因,同线性结果分析显示染色体大片段复制和串联重复有可能是RPM1类基因在染色体扩增的主要方式。(本文来源于《西北农林科技大学》期刊2015-11-01）
焦晨[4]（2015）在《中国野生葡萄抗白粉病转录组及两个重要抗病相关基因功能分析》一文中研究指出葡萄做为最具有经济价值的果树作物之一,在世界范围内被广泛种植。2013年,全球葡萄年产量达到了7.7千万吨,我国以超过一千万吨的年产量位居世界第一(FAO,2013)。然而,在种植面积和年产量不断增加的背景下,如何保障生产安全是葡萄产业面临的严峻考验。与其他作物一样,葡萄受到病毒、细菌和真菌等多方面的威胁,其中,葡萄白粉病就是一种广泛流行的活体专性寄生的真菌病害,在世界范围内造成了严重的经济损失。然而,作为酿酒和鲜食主要原料的欧洲种葡萄,却几乎全部不能抵抗白粉病的危害。目前,寻找和培育对白粉病在内的多种真、细菌病原抗性品种是葡萄育种研究的重点。在我国,大量的研究积累证明来源于中国的野生葡萄具有优良的抗病、抗逆特性,然而,其中的分子机理了解不足。据此,本研究以探索中国野生葡萄抗白粉病的机理为目的,选取了具有不同白粉病抗性的野生葡萄,通过大规模测序技术,对其不同白粉病侵染阶段的转录组进行结构变异分析,同时还对感病和抗病葡萄在不同侵染时期的基因表达差异进行了系统研究。最后,对一个转录组中差异表达的重要激酶BAK1和一个前期mRNA差异显示文库中筛选到的凝集素受体激酶(LecRK)进行了抗病功能验证。获得以下主要研究结果:1.对叁个具有不同抗性的野生葡萄的转录组进行了从头(de novo)拼接,通过与葡萄参考基因组全面的比较,发现了大量的野生葡萄特异基因和丰富的遗传变异资源,例如SNPs和小片段的插入和缺失(indels)。在每个野生材料中找到了超过1,000个特异基因和600-700个非编码转录本,并且发现~30%的特异基因的功能与植物的防御反应有关。这些特异基因中富集了大量的植物响应病原菌侵染的生理过程和一些例如香豆素类植保素的合成过程。进一步的分析结果发现,6-10%的特异基因被预测为受体类激酶,8%的特异基因为NBS-LRR类抗病基因,而这两类基因都被认为能在植物免疫反应的不同层面中识别病原菌并且传递免疫信号。同时,大量的此类特异基因的存在,也说明这些直接或间接与病原菌互作的基因,可能受到了选择作用而表现出了较高的序列多态性。同时本研究还在野生葡萄和葡萄参考基因组PN40024之间找到了87,000-110,000个纯和的SNPs和约2,000个小片段的indels,并且对这些变异可能产生的影响进行了全面的预测。此外,通过链特异的RNA-Seq文库,还找到了100-200对cisNAT,这些转录本中显着富集了参与次生代谢途径和非生物胁迫途径的转录本,预示了野生葡萄中cis-NATs的潜在调节功能。2.以白粉病高抗和高感的野生葡萄为材料,对处于不同侵染阶段的组织进行了表达谱分析,在所有的样品比较中,总共找到了6,953个显着差异表达的基因。通过对这些差异基因进行表达模式聚类分析发现,有相当一部分同簇基因在不同抗性材料中表达模式一致,即不同抗性野生材料中该类基因对病原菌的响应一致。但也有一类重要的抗病基因,在不同材料中表现出了不同的响应模式。带有NBS结构域的R基因在感病材料中显着全程抑制,而含有受体域的R基因则在抗病材料中显着诱导。此外,本研究还在侵染初期的感病材料中发现了大量下调富集的生物过程,其中有很多跟植物抗病相关。通过差异基因的代谢通路富集性分析发现,一些与抗病相关的常见次生代谢在不同抗性的植株中均上调富集,而一些在葡萄中报导较少的初级及次级代谢途径,则在两个株系中表现出不同的富集模式。3.在前期的mRNA差异显示文库中,获得了一条抗病候选基因片段,进一步分析后发现该片段在抗病与感病的野生葡萄接种白粉菌后均被诱导表达,但是呈现出不同的表达模式。克隆测序后发现其包含有一个G型lectin结构域、跨膜域和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域,可以划分为凝集素类受体激酶(LecRK)。亚细胞定位试验也证明其蛋白在拟南芥的原生质体中可以被定位到细胞膜上,证实其为膜蛋白。超表达VqLecRK1的拟南芥植株表现出了对活体型寄生菌(白粉菌和Pst DC3000)显着增强的抗性,并且出现了一些常见的抑制活体寄生菌的防御反应(胼胝质的大量积累和活性氧的爆发及集中出现的细胞死亡)。此外异源表达VqLecRK1的拟南芥植株在经PAMPs处理和Pst DC3000接种后,表现出了不同程度增强的PTI反应(如:胼胝质的累积和气孔开张度的变化),说明葡萄中VqLecRK1参与了这些病原菌的响应过程。4.转录组的前期结果显示葡萄的SERK基因家族可以被白粉病菌显着诱导表达,并且不同成员之间表现出不完全一致的表达趋势,其中VqBAK1(VqSERK3)的基础表达最大且增强幅度较大。本研究克隆了野生毛葡萄里的BAK1基因,并且证实它定位于细胞膜上。在拟南芥bak1-4突变体中异源表达VqBAK1基因,发现它可以恢复bak1-4突变体因缺失AtBAK1而出现的细胞死亡,说明其也具有控制细胞死亡的能力。此外,本研究还发现超表达VqBAK1的拟南芥表现出对Pst DC3000增强的抗性和增强的PAMP诱导的PTI反应。综上,证实VqBAK1的功能相对保守,在葡萄中也具有控制细胞死亡和增强PTI信号的功能。(本文来源于《西北农林科技大学》期刊2015-05-01）
马辉,韩永涛,高玉荣,徐虹,文颖强[5]（2013）在《中国野生葡萄VpR82H基因的克隆与功能分析》一文中研究指出白粉病是危害葡萄生产的重要真菌病害。生产上广泛栽培的欧洲葡萄普遍不抗白粉病。因此,利用优异抗病资源培育新的抗病品种或利用转基因技术改良原有欧洲葡萄品种显得尤为重要。西北农林科技大学葡萄课题组多年研究表明,中国野生葡萄蕴藏着丰富的抗性资源,尤其是中国野生华东葡萄株系‘白河-35-1'高抗白粉病,是很好的抗病育种材料和抗性基因资源库。拟南芥广谱抗病基因RPW8.2不但对拟南芥白粉菌有抗性作用,而且对烟草白粉病、花叶病毒病和拟南芥霜霉病也具有一定程度的抗性。该基因另外一个独特之处是可以特异地锚定到白粉菌吸器(这是真菌特有的(本文来源于《中国园艺学会2013年学术年会论文摘要集》期刊2013-10-20）
史江莉[6]（2012）在《两个中国野生葡萄抗病相关基因的表达分析》一文中研究指出葡萄是世界性重要的经济类果树之一，在我国也享有很高的经济地位，目前的栽培面积和产量均位居世界前列。但是葡萄白粉病等严重影响了葡萄产业的发展,尤其是世界广泛种植的主要的栽培品种欧洲葡萄，果实品质优良但对白粉病抗性较差。作为世界上最重要的葡萄属植物起源中心之一，我国拥有很多葡萄野生资源，并对白粉病有抗性。尤其是中国野生华东葡萄由于抗病性强，成为葡萄抗病育种的珍贵资源。本课题组多年研究发现，中国野生华东葡萄株系‘白河-35-1’对白粉病抗性很强，因此构建了白粉菌诱导的‘白河-35-1’的全长cDNA文库，已经从中克隆了一些与抗病相关的转录因子，并研究其功能。本研究从该cDNA文库中克隆了一个WRKY转录因子，分析生物和非生物胁迫下的表达模式，并应用农杆菌介导的叶盘法转化烟草，研究其功能。中国野生毛葡萄‘丹凤-2’抗白粉病并且果实中白藜芦醇含量高。白藜芦醇是一种植保素，不仅能够增强植物的抗病性，而且在生物制药方面，发挥了抗癌、抗肿瘤、预防心血管疾病等作用。由于白藜芦醇是芪合成酶基因的表达产物，因此我们应用实时定量的方法研究了毛葡萄‘丹凤-2’芪合成酶基因家族的组织特异性表达,以期获得高量表达的中国野生毛葡萄芪合成酶基因。本研究主要取得以下结果：1.采用RACE技术从白粉菌诱导的中国野生华东葡萄‘白河-35-1’（Vitispseudoreticulata）全长cDNA文库中分离得到WRKY基因，命名为VpWRKY3（GenbankAccession No. JF500755），全长1280bp,包含960bp开放阅读框，编码319个氨基酸，分子量为35.4kDa。氨基酸序列同源性比对分析表明，VpWRKY3属于WRKY家族II型a，VpWRKY3含有一个WRKY保守结构域、一个C2-HH型(C-X5-C-X23-H-X1-H)锌指结构域，和两个预测核定位信号RKRK和KKPR。瞬时转化试验表明VpWRKY3具有核定位功能。并且通过酵母单杂交试验证明了VpWRKY3在酵母中具有转录激活活性。为了验证VpWRKY3的抗病性，我们运用实时荧光定量方法，分析抗性株系‘白河-35-1’和感病株系‘白河-35-2’分别接种白粉病菌后，VpWRKY3的表达模式。在接种葡萄白粉菌6小时后，VpWRKY3在两个株系中均被迅速诱导，并在12h达到最高，而后逐渐减弱，由此表明VpWRKY3参与了葡萄对白粉病的抗病响应。通过农杆菌介导的叶盘法转化烟草进一步验证了，VpWRKY3在转基因烟草中能够提高对青枯病的抗性，起到正向调控的作用。此外乙烯、脱落酸和水杨酸能够诱导VpWRKY3的表达，最高诱导量均出现在8h，但是VpWRKY3不受茉莉酸甲酯的诱导，因此VpWRKY3可能主要参与乙烯、脱落酸和水杨酸的信号转导途径。干旱、高温、低温、渗透胁迫等处理表明，VpWRKY3均上调表达，试验结果表明VpWRKY3参与了各种非生物胁迫的响应过程。此外，在转基因株系中VpWRKY3能够诱导产生更多须根，可能因此增强了植物的耐盐性。2.本研究利用前期克隆了中国野生毛葡萄‘丹凤-2’芪合成酶基因家族28个成员(Genbank Accession No. JQ868665， JQ868666， JQ868668， JQ868670-JQ868687，JQ868689-JQ868693， JQ868697， JQ868698)，运用实时定量PCR的方法分析这些基因在幼叶、幼果、成熟果、果肉、果皮、种子等不同组织之间的表达水平。结果表明，不同组织之间相比，中国野生毛葡萄‘丹凤-2’芪合成酶基因在成熟果实中的表达明显高于其它五个组织器官，其次为果肉和种子，幼叶中表达最低。实际上这些基因在不同组织中的表达量也不相同，VqSTS32(Genbank Accession No. JQ868666)在幼叶中的表达最高，VqSTS5(GenbankAccession No. JQ868693)在幼果中的表达最高，在成熟果实和果肉中均为VqSTS6(Genbank Accession No. JQ868692)的表达最高，VqSTS25(GenbankAccession No. JQ868673)在果皮中的表达最高，VqSTS2(Genbank Accession No. JQ868697)在种子中的表达最高。中国野生毛葡萄‘丹凤-2’芪合成酶基因家族28个成员，大多数基因在成熟果实和果肉中的表达都高于其它组织，但也有例外，如VqSTS5(GenbankAccession No. JQ868693)和VqSTS2(Genbank Accession No. JQ868697)在种子的表达明显高于其它组织。在果肉组织中，表达水平最高的和最低的基因差距很大，基因VqSTS6(Genbank Accession No. JQ868692)比基因VqSTS2(Genbank Accession No. JQ868697)表达量明显高很多。总之，在28个基因成员中VqSTS6在六种组织中的整体表达最高，因此，这对今后深入研究利用VqSTS6基因提供了重要依据。此外运用染色体步移法，我们还从‘丹凤-2’中克隆了两个芪合成酶基因上游调控序列（Genbank Accession No.JX537789和JX537790），功能预测分析表明，该启动子含有与病原菌胁迫相关的W-box及一些非生物胁迫相关的顺式作用元件，将进一步深入研究。(本文来源于《西北农林科技大学》期刊2012-08-01）
牛姣,张玉成,郭荣荣,王西平[7]（2012）在《中国野生葡萄病原菌诱导响应VqSAP基因的克隆及表达分析》一文中研究指出【目的】为了验证SAP基因在葡萄抗病防御机制中的作用,【方法】在前期通过抑制消减杂交技术(SSH)获得中国野生葡萄毛葡萄株系‘商-24’衰老相关蛋白(SAP)基因EST序列的基础上,采用RT-PCR从毛葡萄‘商-24’中分离到SAP基因cDNA序列,并通过实时定量PCR和半定量PCR分析了SAP基因的表达特异性。【结果】序列分析表明该基因具有完整的的开放阅读框,序列长度为819 bp,编码272个氨基酸残基,相对分子质量为30.56 ku,等电点为8.78,将其命名为VqSAP。多重比较结果显示VqSAP基因与油棕、玉米、萱草、拟南芥、水稻等植物SAP基因的同源性为65%~74%。实时定量结果表明,在白粉菌诱导初期,抗病的毛葡萄株系‘商-24’和感病的华东葡萄株系‘湖南-1’VqSAP基因表达量均升高,这可能是因为它参与了病原菌诱导的细胞程序性死亡过程。水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)、乙烯(Eth)处理表明衰老相关蛋白基因表达受激素分子调节,但在抗病和感病株系中基因的表达量有所差异。在嫩叶、嫩茎、花、果皮、卷须等不同葡萄组织中的表达表明VqSAP基因的表达具有空间差异性。【结论】这些结果暗示着VqSAP的表达响应病原菌侵染并受生物胁迫相关激素的调控,很有可能在葡萄防御病原菌侵染的机制中发挥重要作用。(本文来源于《果树学报》期刊2012年04期）
贺明阳[8]（2012）在《中国野生葡萄芪合成酶和病程相关蛋白PR10基因克隆与功能分析》一文中研究指出葡萄（Vitis spp.）是世界性重要经济作物之一，受葡萄白粉菌和霜霉菌等危害严重。葡萄白藜芦醇是一种植保素，在植物对病原菌的防御反应中起重要作用，同时对人体健康具有消炎、抗癌、预防心脑血管疾病等作用。芪合成酶是葡萄催化合成白藜芦醇的关键酶。植物病程相关蛋白PR10受病原菌诱导积累，参与葡萄抗真菌病害反应。本研究克隆了野生毛葡萄(V. quinquangularis)抗白粉菌和果实高含白藜芦醇株系‘丹凤-2’芪合成酶基因和野生华东葡萄(V. pseudoreticulata)抗白粉菌和霜霉菌株系‘白河-35-1’的PR10基因，并对其进行了表达和功能研究。主要取得以下结果：1.以中国野生华东葡萄芪合成酶基因序列在Genoscope葡萄基因组数据库搜索，共获得53条芪合成酶基因同源序列，其中9条序列无芪合成酶特征识别序列‘IPNSAGAIAGN’，而具有查尔酮聚合酶家族特征识别序列‘GVLFGFGPGLT’，推测为查尔酮合成酶基因序列。欧洲葡萄（V. vinifera）芪合成酶基因家族有44条芪合成酶基因成员，在第10染色体上有6条，第16染色体上有38条，其中11条不能正确编码芪合成酶。通过RACE技术克隆获得中国野生毛葡萄‘丹凤-2’果实和接种白粉菌叶片芪合成酶基因家族成员41条，其中一条编码区有缺失；将其登录GenBank，登录号为：JQ868658至JQ868698。欧洲葡萄和野生毛葡萄芪合成酶基因序列种内保守，但种间进化关系较远。2.通过实时定量PCR分析，芪合成酶基因在葡萄根中表达量最高，在叶片中表达量最低；在果实发育过程中，芪合成酶基因在转色期出现表达高峰，在果实成熟期，野生毛葡萄芪合成酶基因出现表达高峰，而欧洲葡萄果实转色期后开始持续下降；野生毛葡萄芪合成酶基因和苯丙烷类代谢途径的相关基因的表达模式与欧洲葡萄相关基因表达模式不同；野生毛葡萄STS基因和PAL基因在果实成熟期的表达高峰和白藜芦醇在成熟果实的积累趋势一致。野生毛葡萄白藜芦醇在果实发育不同阶段的模式与欧洲葡萄果实白藜芦醇积累模式相似，在转色期达到最高峰，分别为16.897μg·FW-1和8.908μg·FW-1，随后开始下降；野生毛葡萄果实白藜芦醇在果实成熟期有一个积累峰，而欧洲葡萄果实白藜芦醇含量持续降低。野生毛葡萄成熟果实中白藜芦醇在果实含量高于欧洲葡萄‘黑比诺’成熟果实中白藜芦醇含量，野生毛葡萄成熟果实白藜芦醇含量为7.297μg·gFW-1，欧洲葡萄成熟果实白藜芦醇含量为4.791μg·gFW~（-1）。3.通过实时定量PCR分析，野生华东葡萄、野生毛葡萄和欧洲葡萄芪合成酶基因受葡萄白粉菌和霜霉菌诱导调控；表达水平与葡萄种质对病原菌的抗性呈正相关；野生毛葡萄和欧洲葡萄各芪合成酶基因家族成员受白粉菌诱导表达模式不相同，各芪合成酶基因成员的表达模式和水平都有差异。野生毛葡萄芪合成酶基因受亲和的葡萄白粉菌和不亲和的烟草白粉菌诱导表达，参与葡萄亲和性抗病和非亲和性抗病；芪合成酶基因受脱落酸、茉莉酸甲酯、水杨酸、冷、热和干旱等非生物胁迫调控表达；受水杨酸诱导表达量最高。在葡萄叶片接种白粉菌后，芪合成酶基因与病程相关蛋白基因PR1、PR2、PR10和PR14协同表达，芪合成酶基因表达变化最大。4.以芪合成酶多克隆抗体分别免疫白粉菌和霜霉菌接种的葡萄叶片，葡萄芪合成酶定位于接种病菌叶片表皮细胞的细胞质、细胞壁和霜霉菌的菌丝和吸器细胞壁；构建野生毛葡萄芪合成酶基因VqSTS1原核表达载体，将芪合成酶基因在大肠杆菌中融合表达，葡萄芪合成酶融合蛋白对葡萄白粉菌、霜霉菌、灰霉菌和烟草赤星病有体外抑菌活性；构建野生毛葡萄芪合成酶基因VqSTS1的植物表达载体pCAMBIA1302-VqSTS1，在烟草中过量表达葡萄芪合成酶基因，能诱导烟草病程相关蛋白基因PR1、PR2、PR4高水平积累，PR5和PR10少量上调表达，而烟草查尔酮合成酶基因被抑制表达。结果表明芪合成酶可能通过芪合成酶及其产物白藜芦醇的直接抑菌活性和调控病程相关蛋白基因表达等多途径增加植物抗病性。5. PR10.2基因在野生华东葡萄和欧洲葡萄叶片中的表达水平高于其他PR10基因家族成员。通过RACE技术克隆获得野生华东葡萄抗白粉菌和霜霉病株系‘白河-35-1’病程相关蛋白PR10.2基因，命名为VpPR10.2，GenBank登录号为：HQ634186。通过PCR扩增，克隆获得VpPR10.2基因gDNA序列和启动子序列，GenBank登录号为：HQ634185。VpPR10.2与欧洲葡萄VvPR10.2基因编码区序列同源率为99.6%，推导氨基酸序列同源率为100%，启动子区域同源率为96.2%。欧洲葡萄PR10基因家族启动子区域序列同源性低，可能是PR10基因家族成员表达模式差异的原因。6.通过实时定量PCR分析，VpPR10.2在根、茎、叶、花和果实中表达，在根中表达水平最高，在叶中最低；VpPR10.2受葡萄白粉菌、霜霉菌诱导表达；VpPR10.2受白粉菌诱导后表达峰出现在12dpi，而欧洲葡萄VvPR10.2出现在72hpi；VpPR10.2受霜霉菌诱导后在72dpi出现表达高峰，约为接种前表达水平的13倍左右，而欧洲葡萄VvPR10.2先受抑制表达而后少量上升表达。VpPR10.2受ABA、MeJA和SA诱导表达，ABA诱导量最大；VpPR10.2受冷、热和干旱胁迫诱导表达。结果表明，VpPR10.2受生物和非生物胁迫诱导表达，在抗、感病葡萄种质中受病原菌诱导表达模式有差异。7.构建VpPR10.2原核表达载体pGEX-VpPR10.2，将VpPR10.2在大肠杆菌中融合表达，纯化获得VpPR10.2融合蛋白。VpPR10.2融合蛋白能降解酵母总RNA和葡萄gDNA，具有体外RNase和DNase活性；VpPR10.2融合蛋白具有体外抑制烟草赤星病菌（Alternaria alternata）生长功能；构建VpPR10.2基因的植物表达载体pCAMBIA1302-VpPR10.2，冻融法转入农杆菌中。通过真空渗透法将VpPR10.2转入欧洲葡萄中，在叶片中过量表达VpPR10.2基因能提高欧洲葡萄叶片对霜霉菌的抗性；VpPR10.2蛋白在叶片中动态定位于细胞壁、细胞质、叶绿体和细胞核；受霜霉菌诱导后能进入霜霉菌吸器细胞的胞质和葡萄叶片表皮细胞的细胞核，诱导葡萄叶片表皮细胞程序性死亡。(本文来源于《西北农林科技大学》期刊2012-05-01）
曹江玲[9]（2012）在《中国野生葡萄芪合成酶基因的克隆及转化欧洲葡萄研究》一文中研究指出葡萄（Vitis spp.）是世界性重要的经济作物，常遭受真菌病的危害。葡萄白藜芦醇是一种重要的植保素，在植物对病原菌的防御反应中起重要作用，同时又对人体健康具有消炎、抗癌、预防心脑血管疾病等营养保健作用。芪合成酶是在葡萄中催化合成白藜芦醇的关键酶。本研究克隆了中国野生华东葡萄株系‘白河-35-1’(Vitis pseudoreticulataaccession Baihe-35-1)抗白粉病芪合成酶基因，克隆了野生毛葡萄株系‘丹凤-2’(Vitisquinquangularis accession Danfeng-2)抗白粉病芪合成酶基因，并对其进行了生物信息学分析及转化研究。取得的结果如下：1．通过RACE技术克隆获得在病原菌诱导下的中国野生华东葡萄株系‘白河-35-1’芪合成酶基因家族成员53条，其中4条序列编码区有缺失，为假基因。将获得的芪合成酶基因序列登入GenBank，登录号为：JQ886584至JQ886636。欧洲葡萄和中国野生华东葡萄株系‘白河-35-1’芪合成酶基因部分序列同源最高达98%，但聚类亲缘关系相对较远。2．采用RT-PCR技术克隆中国野生毛葡萄株系‘丹凤-2’芪合成酶基因VqDSTS1，并进行了序列及表达模式分析。结果表明，VqDSTS1基因cDNA编码区全长为1179bp，GenBank登录号为JQ342086,编码392个氨基酸；氨基酸序列分析表明，VqDSTS1含有芪合成酶基因家族的特征识别序列‘IPNSAGAIAGN’和‘GVLFGFGPGLT’；序列比对显示VqDSTS1与其他葡萄种质的芪合成酶氨基酸序列一致性在95.2%~98.7%之间；半定量RT-PCR分析表明，VqDSTS1受白粉病诱导表达，呈双峰模式。为进一步研究中国野生毛葡萄株系‘丹凤-2’芪合成酶基因家族的表达及功能分析提供了基础。3．在欧洲葡萄胚状体再生体系中，‘红地球’花药的最佳诱导培养基为NN69+CH0.5g·L~(-1)+PVP1g·L~(-1)＋2,4-D0.5mg·L~(-1)+BAP4.0mg·L~(-1)；子房的最佳诱导培养基为NN69+CH0.5g·L~(-1)+PVP1g·L~(-1)＋2,4-D1.0mg·L~(-1)+BAP4.0mg·L~(-1)。赤霞珠的花器官胚性愈伤组织的诱导效率要明显高于无核白。NN69培养基的诱导率最高（花药29.3%，子房32.5%），其次是B5培养基（花药4.5%，子房9.1%），MS培养基诱导率最低（花药4.0%，子房6.3%）。细胞悬浮培养的方法可迅速扩繁胚性愈伤组织，且能够获得均一的体细胞胚。4．农杆菌介导的遗传转化中，潮霉素对愈伤组织的最低致死浓度为13mg·L~(-1)；采用此浓度对胚性愈伤组织进行抗性筛选。GV3101菌株转化率明显高于LBA4404菌株。转化后抗性愈伤组织随着继代次数的增加，报告基因GFP的表达逐渐增强。(本文来源于《西北农林科技大学》期刊2012-05-01）
彭少兵[10]（2012）在《中国野生葡萄再生体系研究及抗病相关基因（VpGLOX、VpPR17、VpHSF1）的克隆与功能分析》一文中研究指出葡萄作为世界重要经济水果，病害是引起葡萄减产的重要原因，用化学防治的方法增加生产成本，降低葡萄的品质。利用抗病资源培育抗病品种是解决这一问题的有效途径。我国野生葡萄资源对主要葡萄病害有较强的抗性。利用中国野生葡萄资源进行抗病育种具有重要意义。本研究一方面针对中国野生葡萄再生率低的问题，进行了茎尖培养及再生的研究；另一方面，在前期研究的基础上，分析乙二醛氧化酶基因的功能，并利用同源克隆等方法克隆分析了病程相关蛋白基因以及热激转录因子的功能，旨在于更好保护利用中国野生葡萄资源，进一步揭示中国野生葡萄抗病机制，研究取得以下主要研究结果。1、从初代培养、增殖培养、生根培养叁个阶段研究了影响华东葡萄株系‘白河-35-1’茎尖组织培养的因素，重点研究了不同盐浓度、不同生长调节物质种类与浓度、糖浓度、不同抗氧化剂及接种材料对组培‘白河-35-1’生根培养的影响。结果表明：较适宜的初代培养基为MS+0.2mg.L~(-1)IBA+0.5～1mg.L~(-1)BAP；增殖过程中用MS+1.0mg.L~(-1)BAP+0.1mg.L~(-1)NAA取得较的增殖效果；生根培养较好的培养基为：1/2MS+琼脂6g.L~(-1)+IBA0.2mg.L~(-1)+活性碳1g.L~(-1)。2、用‘白河-35-1’的叶片等材料为外植体进行了器官再生的研究，结果表明：用叶片为外植体的不定芽再生率比叶柄和茎段为外植体的再生率高，在接种后10d出现愈伤组织，40d出现再生芽，再生芽多为丛生芽。‘白河-35-1’叶片再生适宜的基本培养基为MS培养基，适宜的分裂素为TDZ，浓度为2.0㎎.L~(-1)，适宜的生长素为NAA，浓度为0.1㎎.L~(-1)。经过液体培养的材料，其叶片再生率比一般继代培养的叶片高，再生诱导时先形成为胚性愈伤，进而形成叶状结构，最后得到再生芽。3、用了8种中国野生葡萄10个株系以及2种欧洲葡萄雄蕊和雌蕊进行了胚状途径再生的研究，其中华东葡萄V.pseudoreticulata W.T.Wang的2个株系‘白河-35-2’和‘广西-2’，刺葡萄V. davidii株系‘宁强-6’，及欧洲葡萄Vitis vinifera L2个品种‘雷司令’和‘梅尔诺’获得了胚状体，雄蕊为外植体时胚状体诱导率比雌蕊为外植体高，MSC培养基胚状体诱导率比其他3种培养基效果好，愈伤组织诱导率的高低与胚状体诱导率高低没有直接关系。NN69为基本培养基、用植物凝胶为凝固剂有利于中国野生葡萄胚状体诱导。4、在前期研究的基础之上，进一步分析了乙二醛氧化酶基因（VpGLOX）的功能，用qRT-PCR分析了VpGLOX在抗病株系‘白河-35-1’以及感病株系‘佳利酿’中受白粉病诱导表达的情况，在2种葡萄基因型中VpGLOX的表达均受葡萄白粉病的诱导，在抗病基因型‘白河-35-1’中接种后基因表达量变化量大于感病基因型，表达量比同时期感病型基因高。构建了该基因的表达载体和干扰载体，进行烟草遗传转化，获得了4株过量表达的转基因烟草，转基因烟草中乙二醛氧化酶含量以及H2O2含量增加，转基因烟草对烟草疫霉病的抗性增加。用瞬时转化的方法，对转入的VpGLOX进行干扰处理，干扰处理后的植株乙二醛氧化酶含量下降，但H2O2含量无明显变化。5、采取同源克隆的方法，从‘白河-35-1’叶片cDNA中克隆得到葡萄病程相关蛋白VpPR17(GenBank登录号：JQ248075)，并用生物信息学的方法分析了该基因编码氨基酸序列的一些特点。该基因开放阅读框有681个碱基，编码226个氨基酸，等电点（PI）为：6.30，分子量为25.41kDa，有信号肽。VpPR17编码蛋白序列与马铃薯、烟草的病程相关蛋白27相似性分别为70%和71%，亚细胞定位结果表是明：VpPR17在细胞质中表达，有的细胞器中多些。qRT-PCR分析表明，在抗病株系‘白河-35-1’中VpPR17的表达基本不受白粉病诱导而在感病品种‘佳利酿’中白粉病接种后变化很明显。将VpPR17连入原核表达载体pGEX-6T-1，转入E.coli BL21中，经IPTG诱导后重组菌在约50kDa的位置出现一特异条带，说明VpRFP1基因在表达菌E.coli BL21中得到表达，其蛋白粗提液有抑菌活性。通过农杆菌瞬时转化法将VpPR17转入‘白河-35-1’叶片，后接种霜霉菌，经转化的叶片在接种后的3、5、9d的叶片菌丝的发展速度明显少于对照，说明VpPR17与植物抗病相关。6、利用RACE技术从中国野生葡萄华东葡萄cDNA中克隆得到1个葡萄热激转录因子，命名为VpHsf1（GenBank登录号为：GU393313)，cDNA全长1428bp，开放阅读框为918bp，VpHsf1编码305个氨基酸，预测蛋白质分子约33.7kD和估算等电点为5.09，同源对比表明：VpHsf1属于HSF B类家族，VpHsf1具有核定位功能。在葡萄中，VpHsf1的表达受病原菌、高温和干旱所诱导。qRT-PCR分析表明，在抗病株系‘白河-35-1’以及感病株系‘佳利酿’中VpHsf1的表达均受葡萄白粉病的诱导，与感病品种不同是，在抗病基因型中，表达量较低。烟草中过量表达VpHsf1降低了烟草的耐热性，而增加了获得耐热性，转基因烟草对烟草黑胫病更为敏感，也降低了烟草抵抗渗透胁迫的能力。总之，VpHsf1与葡萄的生物和非生物胁迫有关。(本文来源于《西北农林科技大学》期刊2012-04-01）
中国野生葡萄基因论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
葡萄是世界性重要的经济类作物之一,特别是欧洲葡萄品种,其品质优良,具有很高的经济地位,但抗病性较差。中国是葡萄属植物的起源地之一,拥有丰富的抗性野生葡萄种质资源,这些资源具有良好的抗病性。其中,中国野生华东葡萄株系‘白河-35-1’具有高抗葡萄白粉病的特性;中国野生毛葡萄‘丹凤-2’的白藜芦醇含量较高。白藜芦醇属于芪类化合物,不仅是一类重要的植保素可以增强植物的抗病性,而且还具有清除活性氧、抗肿瘤、预防心血管疾病等医疗保健功能。本研究以高抗葡萄白粉病的中国野生华东葡萄‘白河-35-1’、高含量白藜芦醇的中国野生毛葡萄‘丹凤-2’为试材,通过生物和非生物胁迫处理,研究获得了调控芪合成酶基因的相关信号物质水杨酸,揭示葡萄中水杨酸信号物质调节芪合成酶基因表达产物抗白粉病的分子过程,也探究了MAPK级联途径对毛葡萄芪类物质积累的作用。取得的主要研究结果如下:1.从中国野生华东葡萄‘白河-35-1’和欧洲葡萄‘佳利酿’基因组DNA中分别克隆获得了一对芪合成酶等位基因及其启动子序列。两个芪合成酶基因组序列结构分析表明:两条序列的STS基因序列部分高度保守(碱基序列相似度98.63%),均为1538bp,包含一个内含子和两个外显子;外显子1的核苷酸长度为178 bp,内含子长度为360 bp,外显子2的长度为1000 bp;可编码392个氨基酸的蛋白(氨基酸序列相似度99.49%)。而各自的芪合成酶基因上游调控启动子序列同源性差异较大,主要表现为缺失;克隆获得的华东葡萄VpSTS启动子片段核苷酸长度为2264 bp,克隆获得的欧洲葡萄‘佳利酿’VvSTS启动子片段核苷酸长度为2021 bp;序列比对显示VpSTS启动子有一段18 bp的缺失,而VvSTS启动子有两段缺失,分别为13 bp和244 bp。2.构建了野生华东葡萄‘白河-35-1’和欧洲葡萄‘佳利酿’芪合成酶基因启动子与GUS报告基因融合载体,稳定整合转化模式植物拟南芥中,应用Real-time quantitative PCR(qRT-PCR)分析了两个转基因植株中GUS基因的表达模式。结果表明,‘白河-35-1’芪合成酶基因(VpSTS)启动子驱动的GUS基因在根、茎、叶片、花芽和果荚中均表达,而‘佳利酿’芪合成酶基因(VvSTS)启动子驱动的GUS基因仅在叶片中表达。用拟南芥白粉菌(Golovinomyces cichoracearum strain UCSC1)侵染转基因拟南芥植株,结果表明:二者均为病原菌诱导型启动子,并且VpSTS基因启动子的活性显着高于VvSTS启动子。同时,构建了2个芪合成酶基因启动子与各自芪合成酶基因融合的植物表达载体,稳定整合转入模式植物拟南芥中。在接种拟南芥白粉菌情况下,转VpSTS::STS基因植株的抗病性明显强于野生型和转VvSTS::STS基因拟南芥,且其叶片中芪类物质含量明显高于转VvSTS::STS基因的植株。3.构建了芪合成酶基因启动子与双荧光素酶报告基因融合载体,通过基因枪法瞬时转入欧洲葡萄‘黑比诺’悬浮细胞中,对启动子活性进行分析。结果表明,‘白河-35-1’VpSTS启动子能够响应细菌鞭毛蛋白flg22的诱导,而‘佳利酿’VvSTS启动子对flg22则没有响应;两种启动子对紫外诱导和植物过敏性致病蛋白harpin诱导均无响应。在外源水杨酸(Salicylic acid,SA)和茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate,MeJA)处理下,VpSTS启动子对水杨酸诱导的表达活性显着高于VvSTS启动子;两种启动子对MeJA的响应均相对较弱而且差异不显着。通过对水杨酸激活芪合成酶基因启动子过程中的信号通路分析,认为VpSTS启动子响应水杨酸时依赖于钙离子通道的打开、活性氧爆发、MAPK级联途径的激活以及茉莉酸的合成。4.从中国野生毛葡萄‘丹凤-2’中克隆了促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶基因VqMAPKKK38,开放阅读框全长为1419 bp,定位于葡萄第5号染色体上,属于MAPKKK基因家族中的RAF类亚家族。该序列编码472个氨基酸,含有Gln~(203)到Leu~(450)的蛋白激酶催化结构域,其中包含一个Ser/Thr催化位点(VIHCDLKPKNILL)。应用qRT-PCR技术分析了VqMAPKKK38在生物和非生物胁迫下的表达模式,结果表明VqMAPKKK38响应葡萄白粉菌的侵染、高盐胁迫和低温胁迫,而不受高温胁迫和机械损伤的诱导表达。外源激素SA、MeJA、脱落酸(ABA)和乙烯(Ethylene)处理均能诱导VqMAPKKK38表达,其中VqMAPKKK38受SA诱导表达量最高。5.分别构建了中国野生毛葡萄‘丹凤-2’VqMAPKKK38基因过量表达和干扰表达的植物表达载体,通过农杆菌介导瞬时转化‘丹凤-2’叶片,结合qRT-PCR和HPLC技术,检测了上述两个表达载体转化的葡萄叶片中芪合成酶基因表达水平和芪类物质的含量。结果表明:VqMAPKKK38基因通过正向调控芪合成酶基因的表达而提高葡萄芪类物质的积累。而用钙离子通道抑制剂氯化钆和活性氧清除剂二甲基硫脲预处理后,再经氯化钙和过氧化氢处理的‘丹凤-2’叶片,检测其VqMAPKKK38基因表达量显着降低。结果证明钙离子信号和活性氧(ROS)信号位于VqMAPKKK38基因的上游,激活VqMAPKKK38的表达;同时也正调控葡萄芪合成酶基因的激活和芪类物质的积累。综上,中国野生葡萄芪合成酶基因的表达与产物的积累受信号物质水杨酸的调控;并推测中国野生毛葡萄‘丹凤-2’中的MAPKKK38对芪合成酶基因的表达以及芪类物质的积累有着积极的作用。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
中国野生葡萄基因论文参考文献
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