王越珉:人参皂苷Rg1对LPS诱导奶山羊乳房炎的治疗作用及机理研究论文

王越珉:人参皂苷Rg1对LPS诱导奶山羊乳房炎的治疗作用及机理研究论文

本文主要研究内容

作者王越珉(2019)在《人参皂苷Rg1对LPS诱导奶山羊乳房炎的治疗作用及机理研究》一文中研究指出:大肠杆菌(Escherichia coli,coli)是泌乳动物临床型乳房炎的主要病因之一,可引起泌乳量减少、奶品质下降、治疗管理费用增加等问题,严重时可造成动物淘汰甚至死亡,给奶业生产带来巨大的经济损失。目前,奶牛场多依赖抗生素来预防和治疗干乳期或泌乳期动物的乳房炎,这不仅容易诱导产生耐药菌株,而且易造成乳制品中抗生素残留,对食品安全卫生构成潜在威胁。近年来,国家对抗生素在养殖业使用的控制日趋严格。因此,探讨使用非抗生素方法治疗乳房炎具有现实意义。前期研究表明,人参皂苷(Ginsenoside)Rg1可结合到小鼠细胞上的Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)4,抑制大肠杆菌内毒素(Lipopolysacchrides,LPS)刺激巨噬细胞,从而下调炎症反应。本研究在此基础上,研究Rg1对山羊大肠杆菌内毒素性乳房炎的治疗作用,并探讨其作用机理。1.Rg1阻断LPS对奶山羊单核细胞作用目的:观察Rg1对LPS诱导的山羊外周血单核细胞炎症反应和氧化应激是否具有阻断作用。方法:1)分离山羊外周血单核细胞,将Rg1和单核细胞共培养,用免疫荧光法标记Rg1,观察Rg1在细胞内外的分布情况;2)将不同浓度Rg1与Alexa fluor 488-LPS和单核细胞共培养,用免疫荧光标记法观察在Rg1存在的情况下结合到单核细胞的LPS;3)将不同浓度Rg1与LPS和单核细胞共孵育,检测在Rg1存在的情况下LPS刺激细胞后肿瘤坏死因子(Tumornecrosis factor,TNF)-α、白介素(Interleukin,IL)-1β、IL-6 IL-8、TLR4和细胞内核转录因子-κB(Nuclear transcription factor-KB,NF-κB)mRNA表达水平,以及细胞培养液中前列腺素E2(Prostaglandin E2,PGE2)表达水平;4)将不同浓度Rg1与LPS和单核细胞共孵育后,检测细胞内超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)和丙二醛(Malondialdehyde,MDA)的含量。结果:1)荧光显微镜下可见细胞内呈现红色荧光,表明Rg1能够在细胞内分布;2)荧光显微镜下可见,随着Rg1浓度的增加,标记LPS的绿色荧光逐渐减弱,推测一定浓度Rg1可干扰LPS与单核细胞的结合;3)在Rg1存在的情况下,单核细胞IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α和PGE2表达水平以及TLR4及NF-κB表达水平显著下调;4)在Rg1存在的情况下,单核细胞内的SOD水平显著升高而MDA的水平显著减少。因此,Rg1可显著抑制LPS对单核细胞的刺激,降低细胞内的氧化应激产物,提高细胞的抗氧化水平。2.Rg1对大肠杆菌内毒素性奶山羊乳房炎的治疗作用目的:观察人参皂苷Rg1对大肠杆菌内毒素性奶山羊乳房炎的治疗作用。方法:将9只泌乳期健康奶山羊随机平均分配至3组。组1,用LPS乳房内灌注,之后生理盐水静脉注射,作为模型对照组;组2,乳房内灌注相同剂量LPS后,颈静脉注射Rg1,作为治疗组;组3,用生理盐水乳房内灌注后再用生理盐水静脉注射,作为空白对照组。在乳房内灌注LPS后3、6、9、12、15、18、21、24、48和72 h,采集血样和奶样,检测泌乳量,用血细胞自动分析仪检测外周血白细胞(White blood cell,WBC)、中性粒细胞(Neutrophils,NEU)、淋巴细胞(Lymphocytes,LYM),血液自动生化分析仪检测血清总蛋白(Total protein,TP)、白蛋白(Albumin,ALB)、球蛋白(Globulin,GLOB),乳成分分析仪检测乳糖,体细胞计数仪检测乳中体细胞数(Somatic cell count,SCC)和分光光度法检测N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(N-Acetyl-Beta-D-Glucosaminidase,NAGase)活性。LPS灌注后 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、18、21、24、48和72 h,分别测量乳房围度,利用体温计和红外线成像仪检测直肠温度和乳房表面温度变化。结果:1)组1,模型对照组中奶山羊乳房内灌注LPS后,表现出抑郁、坐立不安,体温显著升高,直至10 h后恢复正常。LPS灌注后乳房围度增加,局部肿胀、发热、疼痛,泌乳量减少,直至96 h后恢复正常。乳成分检测结果表明,LPS灌注后乳糖含量显著下降,乳中SCC和NAGase活性则显著上升。血液检测结果表明,外周血WBC、NEU、LYM以及血清TP、ALB、GLOB含量在乳房炎山羊中减少。以上结果表明,乳房内灌注LPS可诱导奶山羊发生临床型乳房炎。根据血液和乳成分检测结果推测,LPS乳房灌注后产生乳房局部炎症反应,导致血液中大量白细胞向乳腺组织游走,同时由于血乳屏障受损,大量血清蛋白进入乳腺,造成外周血白细胞和血清总蛋白的减少、乳体细胞数的增加以及乳房肿胀。2)组2,Rg1治疗组中奶山羊乳房灌注LPS后,临床表现出抑郁,坐立不安等症状。经颈静脉注射Rg1后,乳房疼痛得到缓解,直肠和乳房表面温度下调,泌乳量回升,乳房围度增加趋势得到抑制,乳房肿胀停止。乳成分检测结果表明,Rg1给药后乳SCC以及NAGase活性减少,乳糖含量恢复。血液检测结果表明,给药后血液成分,包括WBC、NEU、LYM以及血清TP、ALB、GLOB,恢复正常水平。以上结果显示,人参皂苷Rg1静脉注射可缓解LPS性乳房炎,减轻奶山羊的全身和局部症状,使泌乳量和乳成分恢复。3)组3,空白对照组中奶山羊乳房灌注生理盐水后未见临床型乳房炎症状,经颈静脉注射生理盐水前后,除体温、乳房表面温度随室温略有变化外,乳房围度、外周血白细胞计数、血清蛋白含量、泌乳量、乳糖含量、SCC以及乳NAGase活性均无显著变化。3.Rg1对大肠杆菌内毒素性奶山羊乳房炎乳清蛋白组影响目的:探索人参皂苷Rg1对LPS诱导山羊乳房炎乳清蛋白质含量变化的影响。方法:乳房灌注后6 h,采集上述3组奶山羊的乳样,每组3只羊,每只羊各1份,共9份。经过脱脂、酪蛋白沉淀等步骤,制备乳清蛋白并分解成肽段。利用基于串联质量标签标记技术(Tandem mass tags,TMT)的定量蛋白质组学方法,进行乳清蛋白质组检测,分析各组之间的差异蛋白,并进行基因本体论(Gene ontology,GO)功能和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集方面的信息学分析。结果:1)各组乳清蛋白样品均一性较好,经TMT方法上机检测后,共获得3838个不同肽段。利用Uniprot蛋白分析数据库中“Ruminantia”数据库对所检测到肽段进行分析,共鉴定得到乳清样品中791个蛋白,其中2段以上肽段覆盖蛋白占总蛋白数的69.5%,各样品蛋白丰度分布基本呈正态分布,主成分分析结果显示三组组内各样品差异较小。2)各组间蛋白含量统计学分析表明,组1与组3(空白对照组)之间共有98个差异蛋白。其中组1含量显著升高的蛋白是炎症因子,包括IL-6、急性期蛋白、凝血因子和补体蛋白等。同时ALB在组1中显著上调,表明LPS灌注引起乳房血乳屏障破坏。组2与组1之间共有34个差异蛋白。其中组2的ALB、IL-6等急性期反应相关蛋白显著下调,而真核翻译起始因子4B(Eukaryotic translation initiation factor 4B,EIF4B)、β-1,4-半乳糖基转移酶-I(Beta-1,4-galactosyltransferase I,B4GALT1),以及与过氧化物酶体增殖物激活受体γ(Peroxisome proliferator-activated receptor γ,PPARγ)相关蛋白表达水平上调,包括三叶因子2(Trefoil factor 2,TFF2)、脂肪酸转运蛋白(Fatty acid transporter,CD36)、脂肪酸结合蛋白5(Fatty acid binding protein 5,FABP5)和金属蛋白酶组织抑制因子2(TIMP metallopeptidase inhibitor 2,TIMP2)等。这些蛋白与抑制炎性介质分泌、缓解LPS诱导的氧化应激水平上调、阻止细胞凋亡、保护血乳屏障完整性等方面有关。组2与组3样品比较,共获得差异蛋白53个。其中组2急性期反应蛋白显著上调。但差异蛋白聚类热图显示,组2各样品蛋白含量与组3更接近,提示Rg1静脉注射减弱了 LPS对奶山羊乳清蛋白含量的影响。3)GO富集分析发现,各组间差异蛋白主要被富集到的GO条目为对刺激物的反应(Responseto stimulus)。该条目富集到组1与组3间差异蛋白44个,表明LPS乳房灌注后,乳清蛋白质组主要差异蛋白富集在对刺激的反应上。该条目还富集到组2与组1间差异蛋白11个,以及组2与组3间差异蛋白20个。以上结果表明,Rg1静脉注射能下调内毒素诱导的山羊免疫应答反应,减少乳清蛋白质组的变化。4)KEGG通路富集分析结果显示,补体和血凝级联反应信号通路(Complement and coagulation cascades)富集到较多的差异表达蛋白,包括组1与组3间差异蛋白20个,均在LPS刺激后显著上升;组2与组1间差异蛋白4个,均在Rg1治疗后显著下降;组2与组3间差异蛋白10个,均在Rg1治疗后尚未恢复正常水平。该结果表明,LPS诱导奶山羊乳房炎后,机体补体系统被激活,从外周血进入乳腺,并在感染早期募集中性粒细胞和单核细胞至炎症部位,同时介导机体免疫细胞的杀伤等作用。Rg1静脉注射可下调LPS诱导的补体和血凝级联反应通路,抑制该通路诱导的促炎介质分泌和白细胞募集等作用。综上所述,人参皂苷Rg1可干扰LPS与单核细胞的结合,抑制IL-6等炎性细胞因子表达、下调TLR4/NF-KB信号通路、缓解LPS诱导的氧化损伤。静脉注射Rg1可抑制LPS诱导的乳房炎症肿胀、降低山羊的体温和乳房局部温度、下调乳SCC和NAGase活性、恢复泌乳量和乳糖含量、恢复外周血白细胞和血清总蛋白含量。乳清蛋白组学分析表明,Rg1静脉注射显著下调了 LPS诱导的急性期反应相关蛋白在乳清中的含量,增加与PPARy以及保护乳腺组织相关蛋白的表达水平。因此,Rg1静脉注射对LPS诱导的奶山羊乳房炎有治疗作用,可能与Rg1的抗炎和对乳腺的保护作用有关。临床上如何采用Rg1治疗反刍动物大肠杆菌性乳房炎值得进一步研究。

Abstract

da chang gan jun (Escherichia coli,coli)shi bi ru dong wu lin chuang xing ru fang yan de zhu yao bing yin zhi yi ,ke yin qi bi ru liang jian shao 、nai pin zhi xia jiang 、zhi liao guan li fei yong zeng jia deng wen ti ,yan chong shi ke zao cheng dong wu tao tai shen zhi si wang ,gei nai ye sheng chan dai lai ju da de jing ji sun shi 。mu qian ,nai niu chang duo yi lai kang sheng su lai yu fang he zhi liao gan ru ji huo bi ru ji dong wu de ru fang yan ,zhe bu jin rong yi you dao chan sheng nai yao jun zhu ,er ju yi zao cheng ru zhi pin zhong kang sheng su can liu ,dui shi pin an quan wei sheng gou cheng qian zai wei xie 。jin nian lai ,guo jia dui kang sheng su zai yang shi ye shi yong de kong zhi ri qu yan ge 。yin ci ,tan tao shi yong fei kang sheng su fang fa zhi liao ru fang yan ju you xian shi yi yi 。qian ji yan jiu biao ming ,ren can zao gan (Ginsenoside)Rg1ke jie ge dao xiao shu xi bao shang de Tollyang shou ti (Toll-like receptor,TLR)4,yi zhi da chang gan jun nei du su (Lipopolysacchrides,LPS)ci ji ju shi xi bao ,cong er xia diao yan zheng fan ying 。ben yan jiu zai ci ji chu shang ,yan jiu Rg1dui shan yang da chang gan jun nei du su xing ru fang yan de zhi liao zuo yong ,bing tan tao ji zuo yong ji li 。1.Rg1zu duan LPSdui nai shan yang chan he xi bao zuo yong mu de :guan cha Rg1dui LPSyou dao de shan yang wai zhou xie chan he xi bao yan zheng fan ying he yang hua ying ji shi fou ju you zu duan zuo yong 。fang fa :1)fen li shan yang wai zhou xie chan he xi bao ,jiang Rg1he chan he xi bao gong pei yang ,yong mian yi ying guang fa biao ji Rg1,guan cha Rg1zai xi bao nei wai de fen bu qing kuang ;2)jiang bu tong nong du Rg1yu Alexa fluor 488-LPShe chan he xi bao gong pei yang ,yong mian yi ying guang biao ji fa guan cha zai Rg1cun zai de qing kuang xia jie ge dao chan he xi bao de LPS;3)jiang bu tong nong du Rg1yu LPShe chan he xi bao gong fu yo ,jian ce zai Rg1cun zai de qing kuang xia LPSci ji xi bao hou zhong liu huai si yin zi (Tumornecrosis factor,TNF)-α、bai jie su (Interleukin,IL)-1β、IL-6 IL-8、TLR4he xi bao nei he zhuai lu yin zi -κB(Nuclear transcription factor-KB,NF-κB)mRNAbiao da shui ping ,yi ji xi bao pei yang ye zhong qian lie xian su E2(Prostaglandin E2,PGE2)biao da shui ping ;4)jiang bu tong nong du Rg1yu LPShe chan he xi bao gong fu yo hou ,jian ce xi bao nei chao yang hua wu qi hua mei (Superoxide dismutase,SOD)he bing er quan (Malondialdehyde,MDA)de han liang 。jie guo :1)ying guang xian wei jing xia ke jian xi bao nei cheng xian gong se ying guang ,biao ming Rg1neng gou zai xi bao nei fen bu ;2)ying guang xian wei jing xia ke jian ,sui zhao Rg1nong du de zeng jia ,biao ji LPSde lu se ying guang zhu jian jian ruo ,tui ce yi ding nong du Rg1ke gan rao LPSyu chan he xi bao de jie ge ;3)zai Rg1cun zai de qing kuang xia ,chan he xi bao IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-αhe PGE2biao da shui ping yi ji TLR4ji NF-κBbiao da shui ping xian zhe xia diao ;4)zai Rg1cun zai de qing kuang xia ,chan he xi bao nei de SODshui ping xian zhe sheng gao er MDAde shui ping xian zhe jian shao 。yin ci ,Rg1ke xian zhe yi zhi LPSdui chan he xi bao de ci ji ,jiang di xi bao nei de yang hua ying ji chan wu ,di gao xi bao de kang yang hua shui ping 。2.Rg1dui da chang gan jun nei du su xing nai shan yang ru fang yan de zhi liao zuo yong mu de :guan cha ren can zao gan Rg1dui da chang gan jun nei du su xing nai shan yang ru fang yan de zhi liao zuo yong 。fang fa :jiang 9zhi bi ru ji jian kang nai shan yang sui ji ping jun fen pei zhi 3zu 。zu 1,yong LPSru fang nei guan zhu ,zhi hou sheng li yan shui jing mai zhu she ,zuo wei mo xing dui zhao zu ;zu 2,ru fang nei guan zhu xiang tong ji liang LPShou ,geng jing mai zhu she Rg1,zuo wei zhi liao zu ;zu 3,yong sheng li yan shui ru fang nei guan zhu hou zai yong sheng li yan shui jing mai zhu she ,zuo wei kong bai dui zhao zu 。zai ru fang nei guan zhu LPShou 3、6、9、12、15、18、21、24、48he 72 h,cai ji xie yang he nai yang ,jian ce bi ru liang ,yong xie xi bao zi dong fen xi yi jian ce wai zhou xie bai xi bao (White blood cell,WBC)、zhong xing li xi bao (Neutrophils,NEU)、lin ba xi bao (Lymphocytes,LYM),xie ye zi dong sheng hua fen xi yi jian ce xie qing zong dan bai (Total protein,TP)、bai dan bai (Albumin,ALB)、qiu dan bai (Globulin,GLOB),ru cheng fen fen xi yi jian ce ru tang ,ti xi bao ji shu yi jian ce ru zhong ti xi bao shu (Somatic cell count,SCC)he fen guang guang du fa jian ce N-yi xian -β-D-an ji pu tao tang gan mei (N-Acetyl-Beta-D-Glucosaminidase,NAGase)huo xing 。LPSguan zhu hou 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、18、21、24、48he 72 h,fen bie ce liang ru fang wei du ,li yong ti wen ji he gong wai xian cheng xiang yi jian ce zhi chang wen du he ru fang biao mian wen du bian hua 。jie guo :1)zu 1,mo xing dui zhao zu zhong nai shan yang ru fang nei guan zhu LPShou ,biao xian chu yi yu 、zuo li bu an ,ti wen xian zhe sheng gao ,zhi zhi 10 hhou hui fu zheng chang 。LPSguan zhu hou ru fang wei du zeng jia ,ju bu zhong zhang 、fa re 、teng tong ,bi ru liang jian shao ,zhi zhi 96 hhou hui fu zheng chang 。ru cheng fen jian ce jie guo biao ming ,LPSguan zhu hou ru tang han liang xian zhe xia jiang ,ru zhong SCChe NAGasehuo xing ze xian zhe shang sheng 。xie ye jian ce jie guo biao ming ,wai zhou xie WBC、NEU、LYMyi ji xie qing TP、ALB、GLOBhan liang zai ru fang yan shan yang zhong jian shao 。yi shang jie guo biao ming ,ru fang nei guan zhu LPSke you dao nai shan yang fa sheng lin chuang xing ru fang yan 。gen ju xie ye he ru cheng fen jian ce jie guo tui ce ,LPSru fang guan zhu hou chan sheng ru fang ju bu yan zheng fan ying ,dao zhi xie ye zhong da liang bai xi bao xiang ru xian zu zhi you zou ,tong shi you yu xie ru bing zhang shou sun ,da liang xie qing dan bai jin ru ru xian ,zao cheng wai zhou xie bai xi bao he xie qing zong dan bai de jian shao 、ru ti xi bao shu de zeng jia yi ji ru fang zhong zhang 。2)zu 2,Rg1zhi liao zu zhong nai shan yang ru fang guan zhu LPShou ,lin chuang biao xian chu yi yu ,zuo li bu an deng zheng zhuang 。jing geng jing mai zhu she Rg1hou ,ru fang teng tong de dao huan jie ,zhi chang he ru fang biao mian wen du xia diao ,bi ru liang hui sheng ,ru fang wei du zeng jia qu shi de dao yi zhi ,ru fang zhong zhang ting zhi 。ru cheng fen jian ce jie guo biao ming ,Rg1gei yao hou ru SCCyi ji NAGasehuo xing jian shao ,ru tang han liang hui fu 。xie ye jian ce jie guo biao ming ,gei yao hou xie ye cheng fen ,bao gua WBC、NEU、LYMyi ji xie qing TP、ALB、GLOB,hui fu zheng chang shui ping 。yi shang jie guo xian shi ,ren can zao gan Rg1jing mai zhu she ke huan jie LPSxing ru fang yan ,jian qing nai shan yang de quan shen he ju bu zheng zhuang ,shi bi ru liang he ru cheng fen hui fu 。3)zu 3,kong bai dui zhao zu zhong nai shan yang ru fang guan zhu sheng li yan shui hou wei jian lin chuang xing ru fang yan zheng zhuang ,jing geng jing mai zhu she sheng li yan shui qian hou ,chu ti wen 、ru fang biao mian wen du sui shi wen lve you bian hua wai ,ru fang wei du 、wai zhou xie bai xi bao ji shu 、xie qing dan bai han liang 、bi ru liang 、ru tang han liang 、SCCyi ji ru NAGasehuo xing jun mo xian zhe bian hua 。3.Rg1dui da chang gan jun nei du su xing nai shan yang ru fang yan ru qing dan bai zu ying xiang mu de :tan suo ren can zao gan Rg1dui LPSyou dao shan yang ru fang yan ru qing dan bai zhi han liang bian hua de ying xiang 。fang fa :ru fang guan zhu hou 6 h,cai ji shang shu 3zu nai shan yang de ru yang ,mei zu 3zhi yang ,mei zhi yang ge 1fen ,gong 9fen 。jing guo tuo zhi 、lao dan bai chen dian deng bu zhou ,zhi bei ru qing dan bai bing fen jie cheng tai duan 。li yong ji yu chuan lian zhi liang biao qian biao ji ji shu (Tandem mass tags,TMT)de ding liang dan bai zhi zu xue fang fa ,jin hang ru qing dan bai zhi zu jian ce ,fen xi ge zu zhi jian de cha yi dan bai ,bing jin hang ji yin ben ti lun (Gene ontology,GO)gong neng he jing dou ji yin yu ji yin zu bai ke quan shu (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)tong lu fu ji fang mian de xin xi xue fen xi 。jie guo :1)ge zu ru qing dan bai yang pin jun yi xing jiao hao ,jing TMTfang fa shang ji jian ce hou ,gong huo de 3838ge bu tong tai duan 。li yong Uniprotdan bai fen xi shu ju ku zhong “Ruminantia”shu ju ku dui suo jian ce dao tai duan jin hang fen xi ,gong jian ding de dao ru qing yang pin zhong 791ge dan bai ,ji zhong 2duan yi shang tai duan fu gai dan bai zhan zong dan bai shu de 69.5%,ge yang pin dan bai feng du fen bu ji ben cheng zheng tai fen bu ,zhu cheng fen fen xi jie guo xian shi san zu zu nei ge yang pin cha yi jiao xiao 。2)ge zu jian dan bai han liang tong ji xue fen xi biao ming ,zu 1yu zu 3(kong bai dui zhao zu )zhi jian gong you 98ge cha yi dan bai 。ji zhong zu 1han liang xian zhe sheng gao de dan bai shi yan zheng yin zi ,bao gua IL-6、ji xing ji dan bai 、ning xie yin zi he bu ti dan bai deng 。tong shi ALBzai zu 1zhong xian zhe shang diao ,biao ming LPSguan zhu yin qi ru fang xie ru bing zhang po huai 。zu 2yu zu 1zhi jian gong you 34ge cha yi dan bai 。ji zhong zu 2de ALB、IL-6deng ji xing ji fan ying xiang guan dan bai xian zhe xia diao ,er zhen he 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    论文作者分别是来自浙江大学的王越珉,发表于刊物浙江大学2019-09-16论文,是一篇关于人参皂苷论文,乳房炎论文,奶山羊论文,内毒素论文,浙江大学2019-09-16论文的文章。本文可供学术参考使用,各位学者可以免费参考阅读下载,文章观点不代表本站观点,资料来自浙江大学2019-09-16论文网站,若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权,请联系我们删除。

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    王越珉:人参皂苷Rg1对LPS诱导奶山羊乳房炎的治疗作用及机理研究论文
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