本文主要研究内容
作者赵然（2019）在《基于CRISPR/Cas12a的食气扬氏梭菌基因组编辑工具的建立与应用》一文中研究指出：大部分细菌和几乎所有古生菌的基因组中,都存在着一种规律排列成簇的短回文重复序列CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats),由 spacer和repeat间隔排列组成。这种重复序列的相邻位置往往是一些CRISPR相关蛋白(CRISPR-associated proteins)Cas的编码基因,这类蛋白具有核糖核酸内切酶的功能,与CRISPR转录出的导向性RNA共同形成这些微生物中的一种适应性免疫系统,即CRISPR-Cas系统,用于抵御外来病毒和噬菌体的入侵。基于该系统的特性,人们发展了一系列高效的基因编辑工具,在植物、动物、微生物中均得到广泛应用。Cas12a(又称Cpf1)属于Cas蛋白家族的ClassII typeV型蛋白,含有Ruvc结构域和Nuc结构域,同时具备DNA核酸酶活性和RNA核酸酶活性。与常用的Cas9不同的是,Cas12a不仅可以对靶标DNA进行切割,也可以对自身CRISPR转录的RNA前体进行切割加工,形成成熟的crRNA(CRISPRRNA)。而且Cas12a蛋白的分子量比Cas9蛋白小100个氨基酸,适配的PAM(protospacer adjacent motif)序列为5’-TTN-3’,而不是5’-NGG-3’,更适用于GC含量更低的物种,针对AT含量丰富的基因序列可选择的靶标位点更多,更具优势。扬氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)是食气梭菌的代表性菌株之一,具有Wood-Ljungdahl固碳途径,能够以CO、CO2气体为唯一碳源进行生长,并代谢产生有机酸和有机醇等,具有良好的工业应用前景。然而,扬氏梭菌作为一种低GC含量的革兰氏阳性菌,全基因组内的GC含量大约只有31%,可供CRISPR-Cas9系统识别的PAM序列较少,尤其是对于基因组上一些短小的序列而言,由于缺乏合适的PAM位点,研究者无法采用CRISPR-Cas9对其进行分子操作。而Cas12a蛋白识别的PAM是序列富含胸腺嘧啶的5’-TTN-3’,在扬氏梭菌基因组上出现的几率极高。因此,开发基于CRISPR-Cas12a的基因组编辑工具对于扬氏梭菌十分重要,可有效提高编辑效率和灵活性,弥补原有CRISPR-Cas9系统的缺陷和不足。本研究旨在扬氏梭菌中开发基于CRISPR-Cas12a的基因组编辑工具,用于实现基因敲除和基因表达抑制两个方面的目标。在这项研究中,我们首先从四种不同来源的Cas12a蛋白中筛选出针对扬氏梭菌毒性相对较小的蛋白——新凶手土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis subsp.novicida U112)FnCas12a蛋白,并通过体内实验验证了FnCas12a具有体内切割DNA双链的活性,适合在该菌中进行基因编辑工具的开发。因此,针对CRISPR-FnCas12a,构建了基因敲除系统的质粒,并基于改进的高效感受态制备方法,通过该敲除系统成功进行了pta(CLJU_c12770编码磷酸乙酰转移酶的基因)、adhE1(CLJU_c16510编码醇醛脱氢酶的基因)、ctf(CLJU_c39430编码酰基辅酶A转移酶的基因)、pyrE(CLJU_c35680编码乳清酸磷酸核糖转移酶的基因)四个基因的同框缺失。此外,还对FnCas12a蛋白的1006位氨基酸进行了替换,获得失去DNA切割功能的ddFnCas12a(Dead-DNaseFnCas12a)蛋白,开发了该蛋白介导的CRISPRi系统,有效地实现了目标基因的转录下调。具体使果糖培养条件下转录量靠前的四个基因CLJU_c09110(编码厌氧一氧化碳脱氢酶催化亚基的基因),CLJU_c04990(编码表层蛋白质的基因),CLJU_c37650(编码甲酸—四氢叶酸连接酶的基因)以及CLJU_c16510(编码双功能醛/醇脱氢酶的基因)分别产生99%、96%、88%、97%的下调。此外,通过这种基因抑制的方法,在整合了丁酸途径的工程菌株中抑制途径基因adhE1的表达,实现了碳流量的重新分布,根据总溶剂占比情况,乙醇、乙酸和丁酸的分布均有改变,乙醇比率从4.6%(对照)降至2.6%,丁酸比例从26.8%(对照)增加到32.1%,丁酸的产量在一定程度上得以提高,相比于对照组有20%的提升。综上,本研究在扬氏梭菌中建立了高效的遗传操作系统CRISPR-FnCas12a和CRISPR-ddFnCas12a,并将之应用于代谢途径中关键基因的敲除和干扰,为这一重要工业微生物的基础和应用研究提供了技术支撑。
Abstract
da bu fen xi jun he ji hu suo you gu sheng jun de ji yin zu zhong ,dou cun zai zhao yi chong gui lv pai lie cheng cu de duan hui wen chong fu xu lie CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats),you spacerhe repeatjian ge pai lie zu cheng 。zhe chong chong fu xu lie de xiang lin wei zhi wang wang shi yi xie CRISPRxiang guan dan bai (CRISPR-associated proteins)Casde bian ma ji yin ,zhe lei dan bai ju you he tang he suan nei qie mei de gong neng ,yu CRISPRzhuai lu chu de dao xiang xing RNAgong tong xing cheng zhe xie wei sheng wu zhong de yi chong kuo ying xing mian yi ji tong ,ji CRISPR-Casji tong ,yong yu di yu wai lai bing du he shi jun ti de ru qin 。ji yu gai ji tong de te xing ,ren men fa zhan le yi ji lie gao xiao de ji yin bian ji gong ju ,zai zhi wu 、dong wu 、wei sheng wu zhong jun de dao an fan ying yong 。Cas12a(you chen Cpf1)shu yu Casdan bai jia zu de ClassII typeVxing dan bai ,han you Ruvcjie gou yu he Nucjie gou yu ,tong shi ju bei DNAhe suan mei huo xing he RNAhe suan mei huo xing 。yu chang yong de Cas9bu tong de shi ,Cas12abu jin ke yi dui ba biao DNAjin hang qie ge ,ye ke yi dui zi shen CRISPRzhuai lu de RNAqian ti jin hang qie ge jia gong ,xing cheng cheng shou de crRNA(CRISPRRNA)。er ju Cas12adan bai de fen zi liang bi Cas9dan bai xiao 100ge an ji suan ,kuo pei de PAM(protospacer adjacent motif)xu lie wei 5’-TTN-3’,er bu shi 5’-NGG-3’,geng kuo yong yu GChan liang geng di de wu chong ,zhen dui AThan liang feng fu de ji yin xu lie ke shua ze de ba biao wei dian geng duo ,geng ju you shi 。yang shi suo jun (Clostridium ljungdahlii)shi shi qi suo jun de dai biao xing jun zhu zhi yi ,ju you Wood-Ljungdahlgu tan tu jing ,neng gou yi CO、CO2qi ti wei wei yi tan yuan jin hang sheng chang ,bing dai xie chan sheng you ji suan he you ji chun deng ,ju you liang hao de gong ye ying yong qian jing 。ran er ,yang shi suo jun zuo wei yi chong di GChan liang de ge lan shi yang xing jun ,quan ji yin zu nei de GChan liang da yao zhi you 31%,ke gong CRISPR-Cas9ji tong shi bie de PAMxu lie jiao shao ,you ji shi dui yu ji yin zu shang yi xie duan xiao de xu lie er yan ,you yu que fa ge kuo de PAMwei dian ,yan jiu zhe mo fa cai yong CRISPR-Cas9dui ji jin hang fen zi cao zuo 。er Cas12adan bai shi bie de PAMshi xu lie fu han xiong xian mi ding de 5’-TTN-3’,zai yang shi suo jun ji yin zu shang chu xian de ji lv ji gao 。yin ci ,kai fa ji yu CRISPR-Cas12ade ji yin zu bian ji gong ju dui yu yang shi suo jun shi fen chong yao ,ke you xiao di gao bian ji xiao lv he ling huo xing ,mi bu yuan you CRISPR-Cas9ji tong de que xian he bu zu 。ben yan jiu zhi zai yang shi suo jun zhong kai fa ji yu CRISPR-Cas12ade ji yin zu bian ji gong ju ,yong yu shi xian ji yin qiao chu he ji yin biao da yi zhi liang ge fang mian de mu biao 。zai zhe xiang yan jiu zhong ,wo men shou xian cong si chong bu tong lai yuan de Cas12adan bai zhong shai shua chu zhen dui yang shi suo jun du xing xiang dui jiao xiao de dan bai ——xin xiong shou tu la fu lang xi si jun (Francisella tularensis subsp.novicida U112)FnCas12adan bai ,bing tong guo ti nei shi yan yan zheng le FnCas12aju you ti nei qie ge DNAshuang lian de huo xing ,kuo ge zai gai jun zhong jin hang ji yin bian ji gong ju de kai fa 。yin ci ,zhen dui CRISPR-FnCas12a,gou jian le ji yin qiao chu ji tong de zhi li ,bing ji yu gai jin de gao xiao gan shou tai zhi bei fang fa ,tong guo gai qiao chu ji tong cheng gong jin hang le pta(CLJU_c12770bian ma lin suan yi xian zhuai yi mei de ji yin )、adhE1(CLJU_c16510bian ma chun quan tuo qing mei de ji yin )、ctf(CLJU_c39430bian ma xian ji fu mei Azhuai yi mei de ji yin )、pyrE(CLJU_c35680bian ma ru qing suan lin suan he tang zhuai yi mei de ji yin )si ge ji yin de tong kuang que shi 。ci wai ,hai dui FnCas12adan bai de 1006wei an ji suan jin hang le ti huan ,huo de shi qu DNAqie ge gong neng de ddFnCas12a(Dead-DNaseFnCas12a)dan bai ,kai fa le gai dan bai jie dao de CRISPRiji tong ,you xiao de shi xian le mu biao ji yin de zhuai lu xia diao 。ju ti shi guo tang pei yang tiao jian xia zhuai lu liang kao qian de si ge ji yin CLJU_c09110(bian ma ya yang yi yang hua tan tuo qing mei cui hua ya ji de ji yin ),CLJU_c04990(bian ma biao ceng dan bai zhi de ji yin ),CLJU_c37650(bian ma jia suan —si qing xie suan lian jie mei de ji yin )yi ji CLJU_c16510(bian ma shuang gong neng quan /chun tuo qing mei de ji yin )fen bie chan sheng 99%、96%、88%、97%de xia diao 。ci wai ,tong guo zhe chong ji yin yi zhi de fang fa ,zai zheng ge le ding suan tu jing de gong cheng jun zhu zhong yi zhi tu jing ji yin adhE1de biao da ,shi xian le tan liu liang de chong xin fen bu ,gen ju zong rong ji zhan bi qing kuang ,yi chun 、yi suan he ding suan de fen bu jun you gai bian ,yi chun bi lv cong 4.6%(dui zhao )jiang zhi 2.6%,ding suan bi li cong 26.8%(dui zhao )zeng jia dao 32.1%,ding suan de chan liang zai yi ding cheng du shang de yi di gao ,xiang bi yu dui zhao zu you 20%de di sheng 。zeng shang ,ben yan jiu zai yang shi suo jun zhong jian li le gao xiao de wei chuan cao zuo ji tong CRISPR-FnCas12ahe CRISPR-ddFnCas12a,bing jiang zhi ying yong yu dai xie tu jing zhong guan jian ji yin de qiao chu he gan rao ,wei zhe yi chong yao gong ye wei sheng wu de ji chu he ying yong yan jiu di gong le ji shu zhi cheng 。
论文参考文献
论文详细介绍
论文作者分别是来自河南大学的赵然，发表于刊物河南大学2019-09-20论文，是一篇关于扬氏梭菌论文,基因编辑论文,基因抑制论文,河南大学2019-09-20论文的文章。本文可供学术参考使用，各位学者可以免费参考阅读下载，文章观点不代表本站观点，资料来自河南大学2019-09-20论文网站，若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权，请联系我们删除。
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