肖国胜常贺李刚王焱(厦门大学附属中山医院厦门心脏中心福建厦门361004)
【摘要】目的：研究特异性Kv1.3通道阻断剂ShK(L5)对大鼠动脉粥样硬化发生过程中T细胞亚群及Kv1.3通道表达的影响。方法大鼠随机分为3组，动脉粥样硬化组（AS）组给予高脂饮食联合维生素D3负荷的方法喂养，药物干预组在AS组基础上每天皮下注射特异性Kv1.3阻断剂ShK(L5)；对照组仅给予基础饲料。8周后留取主动脉石蜡包埋，应用HE染色、Masson三色染色观察主动脉粥样硬化病变情况。结果AS模型组和药物干预组TC、TG、LDL与对照组比较明显升高，HDL相比降低（P＜0.05）；AS模型组主动脉内膜增厚明显，可见大量炎性细胞浸润，中膜平滑肌层排列紊乱；药物干预组内膜病变程度减轻；对照组各层组织结构正常。结论：特异性阻断Kv1.3通道，可以减轻动脉粥样硬化的发生。
【关键词】动脉粥样硬化电压门控钾通道
【中图分类号】R965【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2012）26-0026-02
前言
近年来随着对动脉粥样硬化研究的深入,越来越多的证据显示，动脉粥样硬化不但具有慢性炎症的特征,而且炎症反应的整个过程都有先天性和获得性免疫应答参与其中。目前研究已经发现，在动脉粥样硬化斑块中最主要的T淋巴细胞亚群是CD4+T淋巴细胞，约占70%，绝大多数表达MHC类抗原，表示其处于免疫活化状态。电压门控钾通道Kv1.3由Kv1.3基因编码，是电压门控钾通道Shaker家族的成员,由大约500个氨基酸的亚单位非共价结合形成的同源四聚体。Kv1.3作为一个电压门控的通道，它的门控由膜电位所控制，膜电位的改变可被包含正电荷（即所谓的门控电荷）的“电压感受器”区域所感知。本研究即使主要研究Kv1.3通道在动脉粥样硬化中的作用以及Kv1.3通道特异性抑制剂ShK(L5)对动脉粥样硬化的作用。
材料和方法
1实验动物:清洁级24只健康Wistar雄性大鼠，随机分为三组，每组8只：（1）、正常对照组，（2）、动脉粥样硬化模型组，高脂饮食并注射维生素D3（3）、药物干预组，模型组并每天皮下注射Kv1.3特异性阻断剂SHK(L5)，剂量为10μg/kg；。各组喂养8周后取血，处死，取血管组织等。
2血脂检测：分别按照试剂盒说明书方法检测总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇。
3主动脉HE染色：4%多聚甲醛固定血管环，脱水处理后，常规石蜡包埋。切成厚度为4μm的石蜡切片，脱蜡水化，苏木素侵泡5min，自来水冲洗，盐酸酒精分化10s，自来水浸泡15min，伊红染色1min，常规脱水，透明，中性树脂封片，镜下观察并拍照。
4Masson三色染色甲醛固定血管环，脱水处理，石蜡包埋。切成厚度为4μm的石蜡切片，置于普通载玻片上，切片脱蜡水化，每片切片滴加Masson复合染色液100μl，染5min，蒸馏水冲洗，滴加磷钼酸溶液100μl，染5min，甩干，滴加苯胺蓝溶液100μl，染5min蒸馏水冲洗，滴加分化液100μl分化30s，常规脱水，透明，封片：95％乙醇2min→100％乙醇2min→中性树胶封片，镜下观察并拍照。
5统计方法
实验数据用SPSS11.5统计数据软件处理，所有数据均采用均数±标准差（x-±S）表示，两组间比较方差齐采用t检验，方差不齐采用秩和检验，P＜0.05表示有统计学意义。
实验结果
1实验大鼠血脂检测结果
AS组和药物干预组之间TC、TG、LDL和HDL之间差别较小，经t检验分析，无明显统计学差别，P＞0.05。
AS组、药物干预组与对照组各指标之间差异较大，血清总胆固醇（TC）、甘油三脂（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）明显增高，P＜0.05，高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）明显降低，P＜0.05。见表1
表1各组大鼠8周时血脂（x-±S）
与AS模型组和药物干预组比较，*P＜0.05。
2实验大鼠主动脉HE染色结果
正常对照组大鼠，主动脉管腔圆形,内膜、中膜和外膜分界清楚,内膜层平滑；AS模型组大鼠，主动脉横断面上有多少不等的内膜局部增厚病灶，内膜和中膜分界不清，弹性纤维层结构不清，炎性细胞大量浸润；药物干预组大鼠，主动脉横断面上主动脉内膜大致整齐，可见内膜增厚突出，但程度较轻，炎性细胞较少，弹力纤维排列紊乱，但无明显断裂，中膜平滑肌层排列大致正常，可见脂质沉积和泡沫细胞，无钙化灶和坏死物质。
图1各组HE染色a正常对照组b动脉粥样硬化模型组c药物干预组（X200）
3实验大鼠主动脉Masson染色结果
正常对照组大鼠，主动脉管腔圆形,内膜、中膜和外膜分界清楚，中膜平滑肌纤维排列规则，弹力纤维层清晰完整，呈环形排列，无脂肪沉积和钙化坏死;外膜为薄层疏松结缔组织；AS模型组大鼠，内膜和中膜分界不清，内膜下大量平滑肌细胞增生，内弹力层发生变性、断裂和崩解；药物干预组大鼠，主动脉横断面上主动脉内膜大致整齐，少见内膜增厚突出，弹力纤维排列紊乱，但无明显断裂，中膜平滑肌层排列大致正常，可见脂质沉积引起的空洞，钙化灶和坏死物质不明显。
图2Masson染色a正常对照组b动脉粥样硬化模型组c药物干预组（X200）
讨论
AS的发生与脂质代谢失常密切相关，AS的本质就是动脉壁对从血浆侵入的脂质的反应，高血脂尤其是LDL-C的增高是动脉粥样硬化的最重要的危险因素，其重要性已经得到众多大规模临床实验证实。LDL-C可以通过激活EGF受体以及增加PDGF的分泌的方式来促进平滑肌的增殖,还可以增加VSMC上的LDL－C受体并以此增加细胞内的钙离子，从而促进平滑肌细胞增殖。实验8周后，检测大鼠血脂，发现AS组大鼠的血清总胆固醇（TC），甘油三酯（TG）低密度脂蛋白（LDL）与空白对照组比较明显升高，高密度脂蛋白（HDL）也明显减低，已经形成较明显的高脂血症。正常对照组大鼠主动脉管腔圆形，内膜、中膜和外膜分界清楚,内膜层平滑无突起增厚，由单层内皮细胞覆盖,中膜为排列规则的梭形平滑肌细胞，弹力纤维层清晰完整，呈环形排列;外膜为薄层疏松结缔组织。AS模型组大鼠主动脉局部管壁向管腔内突出，内膜、中膜和外膜分界不清，内膜可见明显增厚，弹性纤维层结构不清，炎性细胞大量浸润；内膜下中膜平滑肌细胞排列紊乱，可见脂质沉积，点状或片状钙化灶及坏死物质形成。
特异性Kv1.3通道阻断剂阻断Kv1.3通道，可能是通过减少动脉粥样硬化中T细胞的活化和增殖，减轻动脉粥样硬化的发生，有明显的抗AS作用。同时，也从另一方面证实了Kv1.3通道、T淋巴细胞和动脉粥样硬化的相关性[6]，为Kv1.3通道成为新的动脉粥样硬化免疫治疗的靶点提供了理论依据。
基金项目：国家自然科学基金面上项目(No.30871045)，福建省自然基金（No.2012J01415）