导读:本文包含了苛求芽孢杆菌论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:尿酸酶,定向进化,高通量筛选,细胞裂解液
苛求芽孢杆菌论文文献综述
冯涛[1]（2016）在《苛求芽孢杆菌尿酸酶体外定向进化系统及应用》一文中研究指出采用易错PCR(error-prone PCR,epPCR)技术对天然苛求芽孢杆菌胞内尿酸酶叁段氨基酸区域(A1-V150;V150-D212;Q160-L322)对应编码基因进行体外随机突变,在不影响PCR产物生成量的前提下,通过增加反应体系中MnCl2浓度至1.5 mM,提高突变率至4.4%;通过epPCR反应后快速加入2.0 mM EDTA-Na2溶液消除高浓度Mn2+对连接效率的影响;采用同源重组克隆方法实现表达载体突变体库的构建。突变体单克隆接种于48孔细胞培养板进行细胞培养及诱导表达,诱导后细胞悬液以1:9体积比加至含1.0 M Tris-HCl(pH 9.0)缓冲液的96孔细胞培养板(含0.1%吐温-20,1.0 mM 4-氨基苯甲脒二磷酸盐缓冲液),室温下于微孔板快速振荡器中裂解7.5-10.5h;使用150μM底物在酶标仪上于298 nm检测尿酸酶反应过程;分析酶动力学过程确定裂解液中尿酸酶活性Vm/Km。动力学过程分析法确定尿酸酶活性Vm/Km对初始底物浓度不敏感,且定量上限为经典初速度法的3倍。基于所述高通量筛选系统,选取活性之比分别为1.8倍(天然尿酸酶VS L322D-SN-6His)和3.3倍(天然尿酸酶VS E2R/L322D-SN-6His)的两对尿酸酶突变体作为测试菌株,应用受试者工作曲线(Receiver Operation Curve,ROC)比较用Vm/Km识别活性提高一倍以上阳性突变体的可靠性。当活性之比为3.3时,对应碱裂解方法曲线下面积(Area Under Curve,AUC)为0.957;与经典超声裂解法相当(AUC=0.978)。将尤登指数最大时对应Vm/Km作为判断尿酸酶突变体活性提高1倍以上的参考阈值,相当于以模板尿酸酶活性均值加上3.6倍标准偏差。用所建立定向进化系统,对近400个单克隆高通量筛选,获得一株活性提高的阳性尿酸酶协同突变体L171I/Y182F/Y187F/A193S。此突变体活性较天然尿酸酶提高了约60%,但其生理条件下热稳定性较差,仅为天然酶的1/70。综上所述,所建立的定向进化系统可以用来进行苛求芽孢杆菌尿酸酶的体外定向分子改造筛选高活性突变体。(本文来源于《重庆医科大学》期刊2016-05-01）
王璐[2]（2015）在《苛求芽孢杆菌尿酸酶保守序列突变对其性质的影响》一文中研究指出苛求芽孢杆菌(ATCC29604)胞内尿酸酶含322个残基,四聚体为活性形式。此尿酸酶在pH 7.4和37℃时半衰期约为23天,比真菌尿酸酶热稳定性高近10倍。分析晶体结构发现,此尿酸酶N端前9位残基和C端296到302位残基以反向β-折迭方式聚拢成二聚体并维持亚基界面上的活性中心,其中N端有碱性和酸性的残基而C端主要是酸性的残基。本项目基于尿酸酶构象分析、序列比对和定点突变,探索保守序列在酶热稳定性和活性中的作用,为其分子改造奠定基础。1.苛求芽孢杆菌尿酸酶N端序列对其性质的影响野生型N端序列为AERTMFYGKGDV;据其晶体结构,分析附近静电作用网络设计改变其静电网络的N端突变体。比较发现N端残基突变后Ki、Km、最适温度和最适pH变化较小,但比活性和热稳定性变化不同。野生型尿酸酶比活达约11.5kU/g,前叁个氨基酸的突变ARR、QQR、RQR、VQR的比活分别为6.3kU/g、7.0kU/g、8.6kU/g、 9.3kU/g,非变性PAGE电泳发现均为四聚体,RER突变体比活提高到13.5kU/g。这些突变体在37℃时热稳定性与野生酶基本一致,4℃pH9.2时稳定性略有下降。但突变体RESRESRER、REGREGRER、 SSSSSRER比活性下降到4.3kU/g、2.7kU/g、4.8kU/g,经非变性PAGE电泳发现仍为四聚体,且热稳定性在37℃pH 7.4变化显着,分别为1.3d,0.75d,16d。最特别的是突变体Y7F,其比活能保留27%,但在37℃中性条件热失活加速1000倍。2.苛求芽孢杆菌尿酸酶C端序列对其性质的影响对C端305位以后残基突变或者截断或延长C端考察性质改变。突变体D307R、去307都没有活性,突变体去314、R310E、R311R、 E318R、Y319F、L322R分别为3.2kU/g.4.4kU/g、3.6kU/g、3.3kU/g、 2.9kU/g、3.6kU/g,均为四聚体；中性条件下37℃热稳定性明显下降但碱性条件稳定性变化小。突变体L322SNSNSN、L322DSNSNSN、 L322DSNSNSNHHHHHH表达之后经DEAE-纤维素、制备型电泳纯化后最高比活保留66%,且热稳定性基本不变。无论C端还是N端加入His标签后比活性都会下降,但热稳定性影响不大,用Ni2+-NTA纯化效果与DEAE-纤维素接近,但效率高很多。3.苛求芽孢杆菌尿酸酶中间保守区突变对其性质的影响。序列比对发现在此尿酸酶中间也有保守序列。其中A68L、T69V、 D70L、K73E、F179L、D185N、S243A、I244F、Q245I、H246E均无活性,非变性PAGE电泳观察表达产物主要为二聚体；F179L为四聚体却仍无活性。突变体D70N、S71A、T188V、T189V、E192Q、Y249F、 F298L、Q299I、F301L的活性分别为0.55kU/g、0.34kU/g、 0.65kU/g、 0.53kU/g、1.85kU/g、4.71kU/g、1.97kU/、0.93kU/g、2.59kU/g;突变体D70N为二聚体,但有活性。在37℃和4℃及pH 7.4和pH 9.2时,这些突变体热稳定性均显着下降,其中D70N、T188V、E192Q热失活半衰期只为原来的0.1%。4.苛求芽孢杆菌尿酸酶亚基之间离子键改变对其性质的影响在此尿酸酶四聚体晶体结构中,每个二聚体中每个亚基的R140、 E142、E291、R293与另一个二聚体中对应相邻亚基的E142、R140、R293和E291形成四对离子键；据此两个二聚体间形成八对离子键。突变体R140E、R140Q、E142R、E291Q、E291R中,E142为四聚体无活性,其余活性为1.3kU/g、1.6kU/g、13.3kU/g、0.1kU/g; E291Q活性较高但稳定性最差。突变体N141C、P292C能形成二硫键,但不能提高稳定性。这7个突变体与氧嗪酸钾结合,在相应条件下的热稳定性都可以显着提高,最强的增强效应达到数百倍。5.苛求芽孢杆菌尿酸酶序列和性质关系此尿酸酶及其突变体解聚失活后,抑制剂氧嗪酸和黄嘌呤及底物尿酸可诱导聚合再组装成活性四聚体。此尿酸酶C端有独特构象且C端参与形成的静电网络、保守序列间氢键都是活性和稳定性所必须；四聚体内部相邻亚基之间的离子键也是维持活性四聚体的关键。在低温下,此尿酸酶初期非常稳定,但构象变化积累到一定程度后活性快速指数衰减,呈现明显的两阶段失活过程。总体而言,此尿酸酶有优异热稳定性,可能是此尿酸酶长期进化效应积累所致。(本文来源于《重庆医科大学》期刊2015-05-01）
陈远翔[3]（2012）在《重组苛求芽孢杆菌尿酸酶诊断性能评估》一文中研究指出用尿酸酶法测定血清中尿酸水平可分为间接尿酸酶法和直接尿酸酶法，间接尿酸酶法中，用尿酸酶偶联上醛脱氢酶和过氧化物酶的动力学方法效率高，缺点是成本高，干扰因素较多，使其很难在临床上应用推广。目前的直接尿酸酶法只有终点平衡法，受0.40mmol/L以上血清黄嘌呤等少数物质干扰，对大多数其余血清成分有抗性，曾是IFCC推荐的参考方法。用过氧化物酶偶联尿酸酶再加上不同的显色剂称为间接终点平衡法，则因为重复性好，操作简便，节约成本等特点在临床上得到了广泛地应用，但最大的干扰因素来自于血清中的黄嘌呤。我们已克隆了苛求芽孢杆菌胞内尿酸酶基因并已申请其发明专利(专利受理号200910103741.1)，此酶用于直接动力学法尿酸测定时可对1.50mmol/L黄嘌呤有抗性。本课题的研究目的是考察此尿酸酶在间接终点平衡法应用中的最适条件，对其诊断性能进行详细地评价，建立尿酸试剂盒的初步模型。优化后的试剂最适条件如下：R1两份(PBS6.0) R2一份(PH9.2硼砂)HRP2.7U/ml(1.8U/ml) uricase1.2U/ml(0.4U/ml)4-AAP0.45mmol/L(0.3mmol/L) Toos4.2mmol/L(1.4mmol/L)NaN30.05%NaN30.05%按照NCCLS的相关要求，对自主研制的尿酸试剂的各个诊断性能进行了详细地评价：检测限LOD=LOB+1.65SD=14.4umol/L；线性范围：0-1600umol/L线性方程：Y=0.0003X-0.0012, R~2=0.9971；可报告范围：14.4-3510umol/L；批内精密度为2.2%和3.0%，批间精密度为4.0%和4.8%；试剂保存的稳定性可达半年以上，参考区间：男206-426umol/L,女145-336umol/L；胆红素浓度≤320umol/L，抗坏血酸浓度≤0.4mmol/L，血红蛋白浓度≤4g/L时，对尿酸测定结果没有明显干扰；与中生北控尿酸试剂进行方法学比较：直线方程y=0.9506X-1.2647，R~2=0.9956。在抗黄嘌呤干扰方面：中生北控尿酸试剂盒、成都迈克尿酸试剂盒、新城生物尿酸试剂盒、自制尿酸试剂盒在黄嘌呤浓度为0-1.2mmol/L时测定结果都没有明显干扰。而真核尿酸试剂在黄嘌呤浓度>0.3mmol/L时，即对测定结果有明显的负干扰。以上实验证明实验室自制原核表达的尿酸酶试剂比真核表达的尿酸酶在抗黄嘌呤方面有明显的优势，其它性能指标的评价也达到了市场同类产品的相同水平。为后续将此重组尿酸酶作为诊断用工具酶进行体外诊断制剂的申报工作提供了详细的实验室数据，也为将此重组尿酸酶药用制剂的开发奠定了基础。(本文来源于《重庆理工大学》期刊2012-04-10）
陈远翔,姜海蓉,彭方毅,廖娟,杨晓兰[4]（2012）在《诊断用苛求芽孢杆菌尿酸酶的剂型与储存方法》一文中研究指出目的:考察重组苛求芽孢杆菌尿酸酶作为诊断试剂的剂型和储存方法。方法:将此重组尿酸酶制成干粉和液体剂型于-18℃和4℃储存,定期测定酶活性;在干粉制剂时加入保护剂于-18℃储存,在液体制剂时加入防腐剂于4℃储存,间隔适当时间监测酶活性。聚丙烯酰胺凝胶电泳分离此尿酸酶四聚体和二聚体,染色检测蛋白和酶活性。结果:此尿酸酶干粉和液体制剂在4℃储存28 d后对应的剩余酶活性分别为12%和100%,在-18℃冻存28 d后对应的剩余酶活性分别为24%和92%。在干粉制剂时加海藻糖、蔗糖或甘露醇作为保护剂于-18℃储存56 d后,剩余酶活性对应分别为100%、76%和43%。加迭氮钠或苯甲酸的液体制剂,在4℃储存56 d后对应的剩余酶活性分别为99%和82%。在-18℃储存至无活性的冻干粉制剂经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,发现此尿酸酶主要以无活性二聚体存在而活性四聚体很少。结论:此尿酸酶作为诊断试剂,可加入迭氮钠制成液体剂型在4℃储存。(本文来源于《重庆医科大学学报》期刊2012年03期）
冯娟[5]（2011）在《苛求芽孢杆菌尿酸酶的结构对其热稳定性的影响》一文中研究指出重组苛求芽孢杆菌(ATCC29604)胞内尿酸酶用于动力学方法测定血清尿酸有显着优势，还有治疗高尿酸血症的药用潜力。本实验室构建N端序列为AERTMFYGKGDV的重组尿酸酶，其米氏常数为(0.22±0.01)mM，初速度法不适合测定其动力参数；此重组尿酸酶在pH7.4的稳定性半衰期约7小时，且四聚体结构不稳定。本文首先建立了重组苛求芽孢杆菌尿酸酶动力学参数的评价方法，考察了不同条件下重组表达的尿酸酶的四聚体结构变化，分析了其单位结构模型的活性中心及其附近静电作用网络，优化此静电网络及N端第1到9位残基、C端296到322位残基，构建了N端、中间点突变体及C端截短共12个突变体，并表征了所构建突变体的性质，探索N端、C端序列与此重组表达尿酸酶热稳定性和高级结构的关系。1.重组表达尿酸酶动力学参数评价方法的建立通过初速度法测定了Tris-HCl和硼砂缓冲液中的酶中间产物5-羟异尿酸的干扰，用0.103U的酶量，300μM的尿酸反应，308nm下测定，在Tris-HCl缓冲液中的5-羟异尿酸的积累较硼砂缓冲液中的严重，pH7.4较pH9.2的严重，200μM的Mg2+加速5-羟异尿酸的分解。尿酸对二甲基酚橙法测定尿酸酶米氏常数在Tris-HCl缓冲液中有负干扰，在硼砂缓冲液中有正干扰，可能是由于Fenton反应产生羟自由基会诱发尿酸氧化而造成二价铁离子氧化，但加入消除羟自由基的0.5M甘露醇和0.5M甲酸钠并不能消除干扰。通过初速度法测定308nm吸收时，随着加入酶量降低中间产物积累的干扰减弱，测得pH7.4,8.2and9.2的Km分别逐渐趋于0.17±0.02mM (n=3),0.34±0.02mM (n=3),0.35±0.01mM（n=3）。因分析反应过程对起点的不确定度有抗性,采用积分法测定黄嘌呤和氧嗪酸钾的Ki。初速度法测定尿酸为75μM,300μM,600μM时，酶的最适温度为分别为10℃、20℃、20℃。二甲基酚橙法测定尿酸浓度为75μM,300μM,600μM时最适温度分别为10℃、20℃、30℃。可能由于有熵效应的存在，此尿酸酶的最适温度在30℃。几种方法测得其最适pH值均在9.0附近。2.不同条件下N端为AERTMFYGK重组尿酸酶的四级结构变化﹣20℃冻存3个月以后造成重组尿酸酶四聚体结构逐渐解聚为二聚体，伴随着酶的比活性降低，﹣20℃冻存6个月的样品主要以二聚体为主。在37℃，pH7.4和9.2的硼砂缓冲液中当其比活性降为原来的1/10以下时，可溶性部分仅有四聚体，而体系出现肉眼可观察到的不溶性沉淀;非变形PAGE分离所得四聚体仍然保留催化活性，但其比活性降低；新鲜制备的此重组尿酸酶在pH7.4的半衰期为50h，但冻存后明显缩短。3.配体增强N端为AERTMFYGK的重组尿酸酶热稳定性非变性PAGE分析发现此重组表达尿酸酶低温冻存后形成二聚体；经400μM尿酸，120μM黄嘌呤或30μM氧嗪酸钾诱导之后转变为有活性的四聚体，且经亲和力较强的氧嗪酸钾作用之后，重组表达的尿酸酶在pH7.4的的半衰期可延长到150个小时左右。4.苛求芽孢杆菌N端C端结构对其稳定性的影响据已有N端为AERTMFYGK的基因序列的重组表达载体的同源建模的模型，分析了活性中心及其附近静电作用网络，优化此静电网络及N端第1到9位残基、C端296到322位残基，构建系列N端、中间点突变体及C端截短共12个突变体，设计合成突变引物进行PCR反应，克隆突变体。N端7个突变体重组表达尿酸酶比较发现N端序列对其Ki、Km及最适温度和最适pH影响较小，而前叁个氨基酸对其比活性和稳定性影响显着：其中N端突变体ADD,SQR,QQG的比活性分别为0.01U、1.64U、0.153U,经非变性PAGE电泳可见以二聚体为主，而N端为QER,QQR,VQR的比活性分别为7.0U、7.2U、9.3U,经非变性PAGE电泳可见以四聚体为主，QER,QQR,VQR在pH7.4的体外半衰期分别为350,450,200小时左右，N端前叁个氨基酸对其比活性及结构稳定性起重要作用，N端的ADD，ARR突变体去除C端12个氨基酸后其比活性只有天然酶的0.1%左右，C端对尿酸酶催化活性起重要作用，突变体VQR比活性在所测定突变体中最高，达到9.3U/mg，略低于原来N端为AERT者。(本文来源于《重庆医科大学》期刊2011-05-01）
李想,冯娟,张纯,蒲军,杨晓兰[6]（2011）在《反应条件对苛求芽孢杆菌胞内尿酸酶与嘌呤衍生物作用的影响》一文中研究指出用底物尿酸的紫外吸收变化跟踪反应,用单或双底物米氏方程和初速度估算苛求芽孢杆菌胞内尿酸酶最大反应速度,按Arrenius经验公式得到该尿酸酶在pH 9.2和pH 7.4的活化能,但这些活化不能解释其在两个pH下的催化活性差异.该酶同常见嘌呤衍生物氧嗪酸、黄嘌呤和尿酸有亲和力,但对尿酸亲和力最低,且亲和力与嘌呤衍生物解离成阴离子的能力相关.在生理条件下,该酶对尿酸的亲和力相对于最适条件有显着下降.据此推测,优化静电相互作用选择性增强该酶对尿酸的亲和力是提高其成药性的可能措施之一.(本文来源于《应用与环境生物学报》期刊2011年01期）
李想[7]（2010）在《苛求芽孢杆菌尿酸酶的重组表达及其N端序列与功能关系的初步探讨》一文中研究指出苛求芽孢杆菌(ATCC29604)胞内尿酸酶用于动力学方法测定血清尿酸有显着优势,还有治疗高尿酸血症的药用潜力。本实验室初步表征了天然苛求芽孢杆菌尿酸酶并获得大部分编码区的序列,但其N端序列未确认;Edman降解得N端为A(Q)E(Q)RTMFYGKGDV,而5’-RACE未获得N端两个残基编码碱基。本文首先考察所克隆序列是否为预期的尿酸酶,再构建系列N端变异体并考察它们的性质,探索有利于提高此重组表达尿酸酶比活性和稳定性的对应N端序列。1.苛求芽孢杆菌尿酸酶重组表达载体的构建据苛求芽孢杆菌胞内尿酸酶主要编码区序列设计引物,从基因组PCR克隆主要编码区,再将所得序列插入表达载体pET28a中;这些表达载体在大肠杆菌中经过37℃培养、在18℃用1.0 mmol/L的IPTG诱导约20 h后,其表达量可达细菌可溶蛋白50%,在TB培养基中酶产量可达1 kU/L。去除N端甲硫氨酸后为AERTMFYGK的重组表达尿酸酶经DEAE-cellulose 52层析及制备性凝胶电泳纯化,纯度可达95%,比活性(11.5±0.5)U/mg,与天然胞内尿酸酶最大比活性接近;MALDI-TOF-MS分析发现其只有35,779 KDa的主峰,与理论计算分子量仅差约10 Da,表明此重组体尿酸酶N端甲硫氨酸已被除去。与N端为AERTMFYGK的重组尿酸酶相比,此苛求芽孢杆菌天然胞内尿酸酶分子量多204 Da;如其N端第一个氨基酸为Q,其分子量仍然差147 Da。因此,此苛求芽孢杆菌天然胞内尿酸酶可能有其它修饰。2. N端为AERTMFYGK的重组尿酸酶性质N端为AERTMFYGK的重组尿酸酶最适温度25-30℃,最适pH为8.9-9.5;25℃、pH 9.2时Km为0.29±0.03 mmol/L (n = 5),黄嘌呤抑制常数为33±4μmol/L (n = 3)。此酶活性可被低浓度常见阳离子激活;在0.1M Tris-HCl pH 8.9的缓冲液中,镁离子的激活作用最强,可达在无阳离子时的3倍。该重组尿酸酶在pH7.4时10℃、25℃、40℃的Km分别为91±5μmol/L (n = 3)、228±15μmol/L (n = 3)、892±40μmol/L (n = 3);在pH9.2时10℃、25℃、40℃的Km分别为180±6μmol/L (n = 4)、290±30μmol/L (n = 5)、1010±50μmol/L (n = 3)。据单底物米氏动力学由初速度换算得到最大反应速度,据Arrenius经验公式计算该酶在pH7.4和pH9.2时活化能分别为31 kJ/mol和16 kJ/mol,远低于乙酰胆碱酯酶的活化能,但此酶的催化能力显然远低于乙酰胆碱酯酶。故Arrenius经验公式不适用于本文所述情况。3.苛求芽孢杆菌尿酸酶N端序列和活性的关系N端为AERTMFYGK的尿酸酶经SDS-PAGE电泳只有一35KDa的多肽;在非变性PAGE电泳中出现四聚体和二聚体两种成分,且随着该酶四聚体条带逐渐减少,酶比活性降低,与四聚体为活性形式的假定一致。C端His-tag对比活性影响很小,而N端氨基酸残基却对该酶的比活性的影响显着:N端为AERTMFYGK时最高比活性为11.5U/mg。N端为GFYGK其产物纯化后的活性仅有0.1 U/mg。非变性PAGE电泳可见N端为GFYGK时几乎仅有二聚体。对5个重组尿酸酶比较发现N端序列对其Ki、Km及最适温度和最适pH影响较小;在C端的His-tag轻微降低比活性,但能使该酶被金属离子激活更明显和pH效应更明显,并能提高40℃时稳定性。但C端的His-tag不能用Ni+亲和层析纯化,可能是该C端的His-tag未能充分显露。4.同源建模和序列功能关系的初步分析用来自杆菌尿酸酶的结构1J2G.pdb为模板(序列一致性在50%以上,相似性在70%以上),对N端为AERTMFYGK的重组尿酸酶建模。发现N端序列中RTMFY中的R直接与另一个相邻亚基的C端310位附件连续ED残基靠近,预期有很强的静电相互作用,这可能是此酶透析解聚、阳离子激活等效应的结构基础;并且,这种相互作用可能影响亚基解聚和组装的精细过程。综上所述,N端为AERTMFYGK的重组尿酸酶和天然尿酸酶性质相似,其N端序列脱掉了甲硫氨酸;天然尿酸酶完整序列仍不能确认,还有存在其它的修饰的可能性;其N端第叁个氨基酸—精氨酸对活性中心形成可能有重要作用,后续可通过对N端序列改造来提高酶的比活性;还可在C端加入His-tag来增加酶的温度稳定性。(本文来源于《重庆医科大学》期刊2010-06-01）
武文明,段瑞娴[8]（2010）在《产朊假丝酵母尿酸酶与苛求芽孢杆菌尿酸酶特性的比较》一文中研究指出目的探讨产朊假丝酵母尿酸酶与苛求芽孢杆菌胞内尿酸酶的特性。方法复苏、培养新购进菌株以制备尿酸酶,利用硫酸铵分级沉淀法、DEAE纤维素52层析和制备PAGE纯化尿酸酶,测定纯化的尿酸酶的活力、表征,并分析其亚基构成。结果两种尿酸酶分子均为同四聚体,产朊假丝酵母尿酸酶的单肽链分子量和天然酶分子量分别为33.0 ku和134.0 ku,其最适pH值接近8.8,在pH7.4时可保留50%以上活性,该酶的米氏常数(Km)为(32.8±3.1)μmol/L(n=10),黄嘌呤的抑制常数为(4.8±0.2)μmol/L(n=3);而苛求芽孢杆菌胞内尿酸酶则分别为35.7 ku和151.0 ku,最适pH大于9.0,pH7.4时酶活性保留不到30%,其Km为(204±14)μmol/L(n=8),黄嘌呤的抑制常数为(41±7)μmol/L(n=5)。结论该研究对构建杂合药用尿酸酶以治疗高尿酸血症相关疾病具有一定的理论意义。(本文来源于《基础医学与临床》期刊2010年04期）
赵运胜,赵利娜,杨根庆,陶佳,卜友泉[9]（2007）在《苛求芽孢杆菌胞外尿酸酶的表征及其在血清尿酸测定中的应用》一文中研究指出目的考察苛求芽孢杆菌(ATCC 26904)分泌型尿酸酶的特性和将其应用于直接动力学尿酸酶法测定血清尿酸的有效性。方法苛求芽孢杆菌分泌的尿酸酶经DEAE-cellulose层析纯化后,用于以积分法分析尿酸酶反应曲线预测反应体系本底的直接动力学尿酸酶法测定血清尿酸。结果苛求芽孢杆菌分泌的尿酸酶只含1种肽链,分子量为34.7 kD(1kD=0.992 1 ku),其米氏常数为(0.22±0.01)mmo1/L(n=11),黄嘌呤抑制常数为(36±3)μmo1/L(n=4)。用此尿酸酶,只要被分析反应曲线终点的底物浓度低于起点的30%,应用积分法就能可靠预测本底;直接测定反应前吸收,可使直接动力学尿酸酶法不受常见血清成分、酶活性变化和15μmo1/L黄嘌呤等干扰。监测0.025 U/ml尿酸酶反应5 min的数据,其线性响应范围为1~50μmol/L;所得临床标本血清尿酸含量(Ck)与过氧化物酶偶联间接终点平衡法(Ce)正相关(Ck=-0.008+1.046Ce,r=0.996,n=206),但Bland-Altman法分析表明两种方法不一致。结论苛求芽孢杆菌分泌的尿酸酶可用于直接动力学尿酸酶法测定尿酸,并可保障其优势。(本文来源于《华中科技大学学报(医学版)》期刊2007年02期）
赵运胜,卜友泉,张宏娟,廖飞[10]（2006）在《苛求芽孢杆菌基因组DNA提取方法的比较》一文中研究指出目的:比较不同方法提取苛求芽孢杆菌基因组DNA的差异。方法:用经典CTAB提取法、改进CTAB法(溶菌酶处理结合CTAB提取法)、UniQ柱吸附提取法制备苛求芽孢杆菌基因组DNA,比较产物完整性和用于PCR扩增的有效性。结果:叁种方法制备基因组DNA纯度接近,但改进CTAB法产率最高,UniQ法产率最低。经典CTAB法和UniQ法提取基因组DNA易降解。叁种方法所得基因组DNA用于PCR扩增效率接近。结论:溶菌酶裂解结合CTAB提取更适合制备苛求芽孢杆菌基因组DNA。(本文来源于《生物技术》期刊2006年02期）
苛求芽孢杆菌论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
苛求芽孢杆菌(ATCC29604)胞内尿酸酶含322个残基,四聚体为活性形式。此尿酸酶在pH 7.4和37℃时半衰期约为23天,比真菌尿酸酶热稳定性高近10倍。分析晶体结构发现,此尿酸酶N端前9位残基和C端296到302位残基以反向β-折迭方式聚拢成二聚体并维持亚基界面上的活性中心,其中N端有碱性和酸性的残基而C端主要是酸性的残基。本项目基于尿酸酶构象分析、序列比对和定点突变,探索保守序列在酶热稳定性和活性中的作用,为其分子改造奠定基础。1.苛求芽孢杆菌尿酸酶N端序列对其性质的影响野生型N端序列为AERTMFYGKGDV;据其晶体结构,分析附近静电作用网络设计改变其静电网络的N端突变体。比较发现N端残基突变后Ki、Km、最适温度和最适pH变化较小,但比活性和热稳定性变化不同。野生型尿酸酶比活达约11.5kU/g,前叁个氨基酸的突变ARR、QQR、RQR、VQR的比活分别为6.3kU/g、7.0kU/g、8.6kU/g、 9.3kU/g,非变性PAGE电泳发现均为四聚体,RER突变体比活提高到13.5kU/g。这些突变体在37℃时热稳定性与野生酶基本一致,4℃pH9.2时稳定性略有下降。但突变体RESRESRER、REGREGRER、 SSSSSRER比活性下降到4.3kU/g、2.7kU/g、4.8kU/g,经非变性PAGE电泳发现仍为四聚体,且热稳定性在37℃pH 7.4变化显着,分别为1.3d,0.75d,16d。最特别的是突变体Y7F,其比活能保留27%,但在37℃中性条件热失活加速1000倍。2.苛求芽孢杆菌尿酸酶C端序列对其性质的影响对C端305位以后残基突变或者截断或延长C端考察性质改变。突变体D307R、去307都没有活性,突变体去314、R310E、R311R、 E318R、Y319F、L322R分别为3.2kU/g.4.4kU/g、3.6kU/g、3.3kU/g、 2.9kU/g、3.6kU/g,均为四聚体；中性条件下37℃热稳定性明显下降但碱性条件稳定性变化小。突变体L322SNSNSN、L322DSNSNSN、 L322DSNSNSNHHHHHH表达之后经DEAE-纤维素、制备型电泳纯化后最高比活保留66%,且热稳定性基本不变。无论C端还是N端加入His标签后比活性都会下降,但热稳定性影响不大,用Ni2+-NTA纯化效果与DEAE-纤维素接近,但效率高很多。3.苛求芽孢杆菌尿酸酶中间保守区突变对其性质的影响。序列比对发现在此尿酸酶中间也有保守序列。其中A68L、T69V、 D70L、K73E、F179L、D185N、S243A、I244F、Q245I、H246E均无活性,非变性PAGE电泳观察表达产物主要为二聚体；F179L为四聚体却仍无活性。突变体D70N、S71A、T188V、T189V、E192Q、Y249F、 F298L、Q299I、F301L的活性分别为0.55kU/g、0.34kU/g、 0.65kU/g、 0.53kU/g、1.85kU/g、4.71kU/g、1.97kU/、0.93kU/g、2.59kU/g;突变体D70N为二聚体,但有活性。在37℃和4℃及pH 7.4和pH 9.2时,这些突变体热稳定性均显着下降,其中D70N、T188V、E192Q热失活半衰期只为原来的0.1%。4.苛求芽孢杆菌尿酸酶亚基之间离子键改变对其性质的影响在此尿酸酶四聚体晶体结构中,每个二聚体中每个亚基的R140、 E142、E291、R293与另一个二聚体中对应相邻亚基的E142、R140、R293和E291形成四对离子键；据此两个二聚体间形成八对离子键。突变体R140E、R140Q、E142R、E291Q、E291R中,E142为四聚体无活性,其余活性为1.3kU/g、1.6kU/g、13.3kU/g、0.1kU/g; E291Q活性较高但稳定性最差。突变体N141C、P292C能形成二硫键,但不能提高稳定性。这7个突变体与氧嗪酸钾结合,在相应条件下的热稳定性都可以显着提高,最强的增强效应达到数百倍。5.苛求芽孢杆菌尿酸酶序列和性质关系此尿酸酶及其突变体解聚失活后,抑制剂氧嗪酸和黄嘌呤及底物尿酸可诱导聚合再组装成活性四聚体。此尿酸酶C端有独特构象且C端参与形成的静电网络、保守序列间氢键都是活性和稳定性所必须；四聚体内部相邻亚基之间的离子键也是维持活性四聚体的关键。在低温下,此尿酸酶初期非常稳定,但构象变化积累到一定程度后活性快速指数衰减,呈现明显的两阶段失活过程。总体而言,此尿酸酶有优异热稳定性,可能是此尿酸酶长期进化效应积累所致。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
苛求芽孢杆菌论文参考文献
[1].冯涛.苛求芽孢杆菌尿酸酶体外定向进化系统及应用[D].重庆医科大学.2016
[2].王璐.苛求芽孢杆菌尿酸酶保守序列突变对其性质的影响[D].重庆医科大学.2015
[3].陈远翔.重组苛求芽孢杆菌尿酸酶诊断性能评估[D].重庆理工大学.2012
[4].陈远翔,姜海蓉,彭方毅,廖娟,杨晓兰.诊断用苛求芽孢杆菌尿酸酶的剂型与储存方法[J].重庆医科大学学报.2012
[5].冯娟.苛求芽孢杆菌尿酸酶的结构对其热稳定性的影响[D].重庆医科大学.2011
[6].李想,冯娟,张纯,蒲军,杨晓兰.反应条件对苛求芽孢杆菌胞内尿酸酶与嘌呤衍生物作用的影响[J].应用与环境生物学报.2011
[7].李想.苛求芽孢杆菌尿酸酶的重组表达及其N端序列与功能关系的初步探讨[D].重庆医科大学.2010
[8].武文明,段瑞娴.产朊假丝酵母尿酸酶与苛求芽孢杆菌尿酸酶特性的比较[J].基础医学与临床.2010
[9].赵运胜,赵利娜,杨根庆,陶佳,卜友泉.苛求芽孢杆菌胞外尿酸酶的表征及其在血清尿酸测定中的应用[J].华中科技大学学报(医学版).2007
[10].赵运胜,卜友泉,张宏娟,廖飞.苛求芽孢杆菌基因组DNA提取方法的比较[J].生物技术.2006