导读:本文包含了差减克隆论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:大叶落地生根,胎生苗,差减杂交,基因克隆
差减克隆论文文献综述
钟天秀[1]（2015）在《大叶落地生根胎生苗差减cDNA文库的构建及相关基因的克隆》一文中研究指出大叶落地生根(K. daigremontiana)别名花蝴蝶、倒吊莲、大还魂,是景天科(Crassulaceae)伽蓝菜属(Kalanchoe adans.)中一种极易栽培的观赏植物。大叶落地生根的胎生苗无性繁殖过程,同时具有胚胎发生途径和器官发生途径的特点,由于其不形成种子,而在叶片边缘形成体细胞胚,为研究体细胞胚发生途径、器官发生途径和植物体细胞全能性提供了一个良好的模型。因此,本研究以大叶落地生根胎生苗为研究对象,揭示无性繁殖过程中相关基因的的变化,为进一步阐明大叶落地生根胎生苗无性繁殖的过程提供一个框架和平台,对深入了解无性繁殖的分子机制奠定了理论基础。具体的研究结果如下：1.通过外施植物激素的方法来确定生长素和细胞分裂素在胎生苗发生和发育中的作用。胎生苗是发生在母叶边缘锯齿处2-3 mm范围内的细胞层中,从叶片顶端向叶柄基部逐渐发生,而且沿着叶片中轴对称产生。生长素(2,4-D)对胎生苗无性繁殖的影响较小,起关键作用的激素是细胞分裂素(6-BA),用细胞分裂素抑制剂(PR)完全抑制在切割叶片中胎生苗的产生。而且在发育阶段,细胞分裂素处理过的胎生苗叶片直径明显大于对照和其他处理。2.通过SSH技术来寻找差异表达的功能基因,以着生胎生苗的母叶为测试方(tester),不着生胎生苗的母叶为驱动方(driver),构建大叶落地生根胎生苗差减文库,共富集到481条高质量的序列,拼接成390条一致性序列,包括338条单一序列和52条重迭群序列。有132条序列能够在COG数据库中比对到,分为12个大类。挑选30条基因进行real-time PCR实验,根据实验结果将这些分为5类,说明在胎生苗发生发育过程中的基因表达模式非常复杂,同时也证明无性繁殖是一个复杂的基因调控系统,涉及到大量基因的表达水平的变化。3.对差减文库中的6条基因进行克隆和分析,包括：组氨醇脱氢酶(KdHDH)、谷胱甘肽s-转移酶(KdGST)、F-Box家族蛋白(KdF-box)、S-腺苷高半胱氨酸水解酶(KdSAHH)、谷氨酸脱羧酶(KdGAD)、细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶(KdCDK)。通过RACE-PCR技术,获得这6个基因的全长。生物信息学结果分析,6个蛋白都没有信号肽,推测它们都不是分泌蛋白,说明这6个蛋白在细胞内起作用。其中,KdSAHH、KdF-box、KdCDK、KdGAD、KdGST是亲水性蛋白,KdHDH是疏水性蛋白。KdSAHH、KdF-box、KdCDK、KdGAD、KdHDH是酸性蛋白质,KdGST是碱性蛋白质。其中,大叶落地生根KdHDH基因ORF长为1452 bp,编码483个氨基酸,具有明显的疏水区域和跨膜结构,LOCTree软件预测定位在叶绿体膜上,与咪唑甘油磷酸脱水酶存在相互作用。大叶落地生根KdGST基因ORF长为1272 bp,编码423个氨基酸,是一个亲水性蛋白,定位于内质网膜上。大叶落地生根KdGAD基因ORF长为1509 bp,编码502个氨基酸,分子大小为56.57 kD。没有明显的疏水区域和跨膜结构。LOCTree软件预测该蛋白定位在细胞核上。大叶落地生根KdCDK基因ORF长为888 bp,编码295个氨基酸,是一个亲水性蛋白,没有明显的跨膜区域,可能定位在细胞质中。大叶落地生根KdF-box基因ORF长为987 bp,编码328个氨基酸,是亲水性蛋白,没有明显的跨膜结构,定位在细胞质中,是非分泌蛋白。大叶落地生根KdSAHH基因ORF长1458 bp,编码485个氨基酸。没有明显的疏水区域和跨膜结构,是一个亲水性蛋白质,定位与细胞质中,属于非分泌蛋白。4. KdSAHH基因在胎生苗无性繁殖过程中上调表达,差异表达量达到4.08倍,该基因无信号肽及跨膜结构域,说明KdSAHH蛋白是一个广谱表达而非膜定位的蛋白,与甲基转移酶基因有相互作用,其它有相互作用的蛋白也都与甲基转移有关。因此,选择KdSAHH基因进行深入研究。成功构建KdSAHH基因的超表达载体、RNAi载体并转化大叶落地生根和烟草,获得转化植株。综上所述,本研究在转录组水平上对大叶落地生根胎生苗无性繁殖过程进行研究,发现大量与无性繁殖相关的基因,通过real-time PCR分析了30个基因的表达模式,通过RACE-PCR克隆出其中6个基因的全长,并进行生物信息学分析,选择KdSAHH基因进行下一步研究,构建KdSAHH基因的超表达载体、RNAi载体转化大叶落地生根和烟草,并成功获得转化植株。本研究的发现为解释大叶落地生根胎生苗无性繁殖的分子机制提供了基因资源和工作平台,充实了大叶落地生根的研究资源,是对大叶落地生根处于初级研究阶段的填补和充实。(本文来源于《北京林业大学》期刊2015-04-01）
王鹏[2]（2013）在《光滑鳖甲（Anatolica Polita）差减cDNA文库的构建和免疫相关蛋白基因的克隆》一文中研究指出与脊椎动物相似，昆虫在进化中形成强大的免疫系统，包括先天免疫系统和获得性免疫系统，由于缺乏对昆虫获得性免疫的认知，目前的研究主要针对昆虫的先天免疫系统。昆虫的先天免疫系统主要包括叁个通路：Toll通路、Imd通路和JAS/STAT通路。荒漠昆虫在极端环境中进化形成了独特的免疫抗菌适应机制，本研究以准噶尔荒漠广布的光滑鳖甲为研究对象，构建细菌诱导的抑制差减cDNA文库，筛选免疫抗菌相关的蛋白基因，这将对揭示光滑鳖甲的免疫适应机制和发展荒漠昆虫的免疫调控系统奠定理论基础。本研究首先根据实验室已建立的光滑鳖甲饲养体系，培养出1～6龄幼虫，观察各龄期昆虫的形态及体重特征。经抑菌实验分析，确定了诱导条件：取光滑鳖甲5龄幼虫为实验材料，体重0.1～0.2g，将大肠杆菌与金黄色葡萄球菌分别培养12h，微量注射器取10μL混合菌液（1:1混合）注射于幼虫侧腹部第叁节处，30℃培养16h。根据光滑鳖甲幼虫脂肪含量、角质等多糖含量确定不同实验方案提取RNA，采用TRIzol法提取总RNA，获得总RNA的OD260/280为2.0，终浓度为2.128μg·μL~(-1)，电泳检测完整的RNA。Oligotex mRNA Kits试剂盒纯化获得光滑鳖甲mRNA，通过抑制差减杂交技术获得光滑鳖甲的差减cDNA文库，蓝白斑、PCR、地高辛筛选阳性克隆，最终获得70个长度在250～750bp的ESTs序列。根据表达量的改变方向分为正向文库和反向文库两部分，进行功能分类后发现所获得的基因涉及生物调节，细胞致死，细胞分子、组织构成、生物进化，细胞过程，免疫系统过程，代谢过程，多生物体过程，刺激应答等过程，其中刺激应答和多生物体过程涉及蛋白相对丰富，分析结果提示，昆虫的免疫应答过程往往与一些环境因素的应答同时发生，两种系统相互影响。选取正向文库中的抗菌肽和肽聚糖识别蛋白基因ESTs序列进行全长扩增，在5'-RACE和3'-RACE的PCR扩增基础上，克隆获得抗菌肽基因AMPFA85全长，对测序正确的全长序列进行生物信息学分析，预测所得抗菌肽为cecropin类抗菌肽，分子量为16.6kDa，生理pH下呈碱性，带有3个单位的正电荷，序列中含有16个甘氨酸，二级结构中包含一个α-螺旋和5个β-折迭，C-端疏水、N-端亲水。总之，本研究进一步完善了光滑鳖甲饲养体系，确定了细菌免疫诱导光滑鳖甲的诱导条件，构建了光滑鳖甲抑制差减cDNA文库，对文库中表达的基因进行功能注释，分析了具有特定功能的蛋白，表明光滑鳖甲经细菌诱导后将激活Toll通路和酚氧化酶原级联反应；克隆获得了cecropin类抗菌肽AMPFA85基因，并对所得抗菌肽结构与功能进行了预测，AMPFA85基因的表达与活性分析有待进一步研究。(本文来源于《新疆大学》期刊2013-05-28）
刘富中,张映,周亚君,陈钰辉,连勇[3]（2011）在《茄子单性结实抑制差减文库的构建及相关基因的克隆》一文中研究指出茄子单性结实性能克服低温引起的落花、落果障碍,增强坐果能力,显着提高产量,同时还可改进果实品质,降低栽培成本。本研究旨在构建茄子单性结实果实差异表达基因的抑制性差减cDNA文库,分离获得茄子单性结实相关基因,研究茄子单性结实形成的分子机制。(本文来源于《中国园艺学会2011年学术年会论文摘要集》期刊2011-10-19）
刘柏林[4]（2011）在《马铃薯块茎休眠与发芽抑制差减cDNA文库构建及相关功能基因克隆》一文中研究指出马铃薯在我国乃至世界都是第四大粮食作物。马铃薯块茎的休眠与发芽对于马铃薯的种植栽培以及生产加工极为重要。关于马铃薯块茎休眠与发芽的研究大都集中在储藏生理、遗传及细胞生物学方面。生产实践中主要通过低温或者化学抑制剂来控制储存块茎的发芽。然而,低温储存会产生低温糖化影响马铃薯的加工品质,使用化学药剂抑制发芽不断增加人们对环境和经济的担忧。由于目前对块茎休眠和发芽机理了解欠缺,人工调控技术发展缓慢,制约了马铃薯种薯的生产和块茎作为工业加工原料的充分利用。研究块茎休眠和发芽的分子机理及调控,对于马铃薯栽培、贮藏保鲜和产业的发展等具有十分重要的意义。本研究旨在通过分离和克隆马铃薯块茎休眠与发芽相关基因,初步揭示参与块茎休眠与发芽的基因的种类和数量,为进一步研究休眠与发芽的分子机制提供理论基础和技术支持。取得的主要研究结果如下:1.利用抑制差减杂交技术(SSH)构建了一个马铃薯块茎休眠与发芽相关基因片段的差减文库。经初步筛选和测序获得310个有效EST片段,BLASTn和BLASTx比对分析发现34条EST为未知功能序列,其余EST均可推测出其同源基因或者蛋白功能。2.初步分析发现所获得EST序列涉及糖类代谢、蛋白质代谢、能量代谢、核酸转录与翻译、信号传导、膜转运、细胞结构以及细胞的分裂与生长等一系列生物学过程。利用GO分类标准对EST从细胞组分,生物过程和分子功能进行了2级水平分类。随机选取的13个差异表达基因用Real-time PCR检测分析,证明其在块茎休眠与发芽过程中上调表达或者下调表达。3.从块茎发芽与休眠相关SSH cDNA文库中筛选了一个与ARF基因同源的EST阳性克隆片段,经过电子克隆获得了ARF基因的cDNA全序列,分析属于马铃薯的ARF1基因。Real time-PCR组织特异性分析表明,ARF基因在马铃薯块茎中优势表达。4.分别对20℃和4℃储存的收获后1周、收获后4周、芽眼萌动、芽长2 mm、芽长5 mm和芽长大于10 mm的马铃薯块茎中ARF基因的相对表达量分析表明,在马铃薯块茎的休眠解除过程中,ARF基因的表达量呈下降上升下降变化趋势,突破芽眼和芽长超过1 cm为两个转折点。对成熟收获、室温储存45天芽眼萌动和室温储存90天芽长2～5mm的试管薯中ARF基因的相对表达量分析表明也呈下降上升的趋势,突破芽眼为马铃薯块茎解除休眠的一个重要时期。ARF基因在块茎中的优势表达和表达量的变化说明其可能参与调控马铃薯块茎的休眠与发芽生理。(本文来源于《甘肃农业大学》期刊2011-06-01）
王伟旗[5]（2011）在《通过二次抑制差减杂交方法克隆和鉴定大豆耐盐相关基因》一文中研究指出大豆是世界上重要的粮食作物,又是我国主要的油料作物。大豆属于中度耐盐植物,受盐渍条件影响显着,在盐渍条件下产量下降明显。我国是盐碱化土地分布广泛的国家之一,且由于灌溉不当、植被破坏和海水入侵等因素,致使土地盐渍化的面积每年还在不断增加。因此,培育耐盐品种显得尤为迫切。抑制差减杂交技术是一个研究基因差异表达的有效方法,而且在多数植物中都有成功应用的例子。但是,在筛选文库时会得到大量的EST序列,获得的有效基因数目较少,筛选的效率较低。尽管与耐盐机理相关的信息比较丰富,但是耐盐机理的基础理论研究还不够深入。为了更好的理解大豆盐胁迫反应的分子机理和克隆一些大豆中重要的耐盐基因。本研究利用大豆耐盐品种文丰7号和盐敏感品种Union,分别构建了耐盐大豆品种根系盐诱导表达的抑制差减文库(SSH1)和盐敏感大豆品种根系盐诱导表达的抑制差减文库(SSH2)。利用文库SSH1和SSH2的二次PCR产物,经过再一次的抑制差减杂交,构建了抑制差减文库SSH3。在叁个文库中分别随机挑取了600个阳性克隆子,经过测序共获得高质量的EST序列1500个,513个来自SSH1,453个来自SSH2,534个来自SSH3。并提交到GenBank的dbEST数据库中,获得序列号为HO759947-HO761446。经过序列比对分析,挑选了16个可能与耐盐性相关的基因。利用Real-time PCR方法分析它们在不同大豆品种盐处理前后的差异表达情况。结果表明,这些基因在文丰7与Union盐处理前后中的表达存在差异。对文库SSH1和SSH2中相同和相似的EST序列进行了Dot blot杂交检测。杂交的结果表明,文库SSH3确实可以将SSH1和SSH2中相似的EST序列剔除掉。对文库SSH1和SSH3中获得的EST序列进行了GO基因的功能注释和COG功能分类分析。结果证明,文库SSH3可以将一些与生长发育和防御机制相关的基因剔除掉。因此,文库SSH3确实使耐盐相关的基因得到了富集,而且提高了筛选的效率。从与大豆耐盐性高度相关的EST序列中确定并选择了2个候选基因。通过与NCBI中的EST数据库进行比对分析,预测和克隆了两个基因。生物信息学分析发现,它们分别与硫氧还蛋白和耐钠、锂离子基因同源性很高,分别被命名为GmTrx和GmSLT。而且前人研究发现,这两类基因与提高植物的耐盐性相关。构建了GmSLT基因根系转化正、反义和缺失的表达载体,利用大豆根系转化系统研究了这个基因与耐盐性的关系。试验结果表明,GmSLT基因的过表达在一定程度上提高了大豆转基因发状根和大豆复合体植株的耐盐性。(本文来源于《中国农业科学院》期刊2011-06-01）
吴红珍[6]（2011）在《结核分枝杆菌T淋巴细胞结合短肽克隆的全细胞差减筛选》一文中研究指出研究目的：以T淋巴细胞为靶标对结核分枝杆菌噬菌体随机肽库,进行3轮全细胞差减筛选,期望获得与T淋巴细胞特异性结合的短肽,为寻找能够激活T淋巴细胞的活性肽,进而为开发相应的结核病新型多肽疫苗提供一些实验依据。研究方法：利用尼龙毛柱法分离小鼠的T淋巴细胞,以结核分枝杆菌H37Rv免疫Balb/c小鼠的T淋巴细胞为靶细胞,以生理盐水注射的Balb/c小鼠的T淋巴细胞为阴性吸附细胞,对结核分枝杆菌噬菌体随机肽库进行3轮全细胞差减筛选,在第一、二、叁轮筛选中,结核分枝杆菌噬菌体随机肽库与免疫组T淋巴细胞的孵育时间分别为2h、1.5h、1h；与正常细胞孵育时间分别为2h、2.5h、3h；洗脱液的浓度分别为1%、3%、5%。蓝白斑筛选阳性克隆,提取纯化阳性克隆的单链DNA进行电泳鉴定,并观察阳性克隆对小鼠淋巴细胞转化的影响。研究结果：结核分枝杆菌H37Rv免疫的Balb/c小鼠血清抗PPD IgG水平在第六周时达到1：3200；第2周、第4周、第6周的对照组和免疫组之间差异显着(p<0.05)；除笫2周差异不极显着外、第4周、第6周的对照组和免疫组之间差异极显着(p<0.01),抗体水平的增加说明已成功获得免疫小鼠。尼龙毛柱分离T淋巴细胞的回收率为30%,活细胞比率为93%,得到了高活力的T淋巴细胞。3轮全细胞差减筛选后噬菌体得到了富集,噬菌体的回收率从4.0×10-55增加到52,获得的阳性克隆滴度为1.3×104/ml。蓝白斑筛选得到了阳性克隆,阳性克隆单链DNA电泳条带一致。阳性克隆对免疫组T淋巴细胞转化的影响明显大于其他刺激物,其刺激指数最大为3.5。结论：成功利用尼龙毛柱分离到T淋巴细胞,其回收率为30%,活细胞比率为93%；3轮全细胞差减筛选后获得了阳性克隆,阳性克隆滴度为1.3×104/ml；阳性克隆能够有效刺激T淋巴细胞活化。(本文来源于《吉林农业大学》期刊2011-06-01）
张开岳[7]（2011）在《基于微囊藻毒素处理后鲢鱼肝脏差减文库的构建和分析以及部分基因的克隆》一文中研究指出随着水体富营养化的加剧,有毒蓝藻水华对水环境的危害和生物安全日益引起广泛的关注,蓝藻水华产生的各种藻毒素给人类和水生动物的健康造成巨大的威胁。其中以LR型微囊藻毒素(Microcystin-LR,MC-LR)毒性最强、出现频率最高、造成的危害最大。鲢鱼(Hypophthalmichthys molitrix)等食藻鱼类食用大量有毒蓝藻,与哺乳动物相比它们对MC具有更强的抗性,但其去毒分子机理尚未完全阐明。因此开展MC染毒后鲢鱼肝脏组织基因表达的变化以研究其去毒机理具有重要的理论和实际意义。本研究利用抑制差减杂交技术(suppression subtractive hybridization,SSH)构建了MC-LR处理后鲢鱼肝脏差减cDNA文库,对文库中序列进行了功能注释和分类,初步探明了MC-LR处理后鲢鱼肝脏的基因表达情况,并对筛选到的部分差异表达基因进行了克隆,为从分子水平阐明鲢鱼的解毒机制奠定了基础。本论文主要包括以下几方面内容:1.鲢鱼肝脏MC-LR暴露及不同时间GST表达分析实验组鲢鱼腹腔注射200μg kg-1 body weight (bwt)溶解于0.8% NaCl溶液的MC-LR,对照组鲢鱼注射等体积的0.8% NaCl溶液,并于注射毒素后1 h、3 h、5 h和10 h分别取实验组和对照组肝脏组织用于实验。以β-actin为内参照,应用半定量RT-PCR技术分析MC-LR注射后鲢鱼肝脏不同时期GST mRNA的表达差异。结果表明,MC-LR注射后肝脏GST的表达水平显着降低,其中注射1 h后GST mRNA表达量即有显着下降,说明注射毒素1 h后GST已经参与MC-LR解毒过程,因此本实验选用1 h的实验样本进行差减杂交以筛选该过程中起关键作用的基因。2. MC-LR诱导的鲢鱼肝脏SSH文库的构建及分析利用SSH技术成功构建了MC-LR处理后鲢鱼肝脏差减cDNA文库,并且正、反向差减cDNA文库分别获得2248和1686个重组子。从正、反向差减文库中随机挑选150个阳性克隆(正向文库70个、反向文库80个)进行测序,获得88条ESTs(正向文库48个、反向文库40个)。对这88个序列经GenBank检索比较分析,其中75个(正向文库44个,反向文库31个)为单一基因,其他13个为重复序列。在这75个单一基因ESTs中,有38个片段与GenBank登陆的已知基因有较高的同源性;有11个与GenBank登陆的未知基因有较高的同源性,而其余26条序列尚无同源序列。根据其功能将他们划分为不同的类别,显示与免疫相关、转运蛋白和新陈代谢酶等在MC-LR处理后基因表达发生变化的种类与数量较多,推测他们在微囊藻毒素解毒过程中起到重要作用。3.鲢鱼肝脏差异表达基因的半定量表达分析运用半定量RT-PCR技术对正反向差减文库中各叁条ESTs的表达情况进行了分析。通过实验发现他们的表达情况与抑制差减杂交实验的预期结果基本一致,正向文库的叁条ESTs:Fs29(尚无同源序列)、Fs59(磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因,PEPCK)和Fs70(尚无同源序列)在MC-LR处理1 h后的表达量均显着升高。反向文库的两条ESTs:Rs15(尚无同源性序列)和Rs161(蛋白质二硫键异构酶A3基因,PDIA3)在MC-LR处理1 h后的表达量均显着降低,仅有Rs2(尚无同源序列)降低但未达到显着。此结果也证明了差减文库的构建是成功的。4.鲢鱼PEPCK和PDIA3基因的克隆及其生物信息学分析采用Rapid amplification of cDNA ends(RACE)方法克隆了两条差异表达基因PEPCK和PDIA3的全长cDNA序列。鲢鱼PEPCK cDNA全长2605 bp,包括101 bp的5’端非翻译区,564 bp的3’端非翻译区,1911 bp的开放阅读框,编码636个氨基酸。序列分析结果显示,鲢鱼PEPCK与翘嘴红鲌的同源性最高,其核酸及氨基酸序列的相似性分别达到97%和99%;其次为斑马鱼,同源性均达到90%以上;与星斑川鲽的同源性最差,但核酸及氨基酸序列的相似性也分别达到77%和84%,说明鱼类PEPCK在长期的进化过程中具有很高的保守性。鲢鱼PEPCK具有与草酰乙酯结合的特有结构域以及与GTP叁磷酸链结合的激酶1和激酶2基序。鲢鱼PDIA3 cDNA全长2102 bp,包括206 bp的5’端非翻译区,381 bp的3’端非翻译区,1488 bp的开放阅读框,编码495个氨基酸。序列分析结果显示,鲢鱼PDIA3与斑马鱼的同源性较高,其核酸及氨基酸序列的相似性分别达到86%和92%;与斑点叉尾鮰同源性均较低但核酸及氨基酸序列的相似性也均达到80%以上,说明鱼类PDIA3在长期的进化过程中具有很高的保守性。PDIA3包括4个硫氧还蛋白区域可能在GSH的从头合成及再生时蛋白二硫键的形成中起到作用。(本文来源于《上海海洋大学》期刊2011-05-10）
宋清晓[8]（2010）在《东方山羊豆盐胁迫下抑制差减杂交文库的构建和分析及Ca~（2+）/H~+反向转运体基因的克隆》一文中研究指出东方山羊豆(Galega orientalis)作为一个引进的重要牧草品种,在很多方面表现出优越的性能,但在其推广区域由于土壤盐渍化的影响,使其大面积种植受到了很大的限制。本研究旨在通过克隆和分离与东方山羊豆盐诱导相关基因,为揭示东方山羊豆耐盐分子机制,以及其耐盐育种提供基础。本研究取得的主要结果如下:1.通过抑制差减杂交方法成功构建东方山羊豆盐诱导抑制差减杂交cDNA文库。该消减文库克隆的重组率为92%,插入片段大部分集中在0.2～1kb之间。2.挑取500个克隆进行测序及同源性分析,获得258个cleanESTs,经聚类、拼接,去除冗余序列,共获得132个Unigene,其中含有32个contigs,100个singlets,该库的冗余度为24%。对其进行功能预测及分类,得到大量参与信号转导、转录调控、渗透和代谢调节、机体防御以及光合作用等过程的相关基因。3.随机选择非重复的4个差异表达的序列设计引物,以半定量PCR方法验证其消减效率,结果显示,诱导组的表达量显着高于非诱导组,说明该文库有较高质量。4.从文库中筛选到一个与蒺藜苜蓿同源的EST序列,通过RACE方法,得到一个全长为1769bp的基因,命名为GoCAX。其ORF长度为1377bp,编码458个氨基酸。对其氨基酸序列进行同源性比对分析,与蒺藜苜蓿CAX蛋白同源性最高,为91%。5.蛋白质序列分析表明:其N段无信号肽,疏水性氨基酸均匀分布在整个肽链中,明显多于亲水性氨基酸。从而可以推断整个多肽链表现为疏水性,没有明显的亲水区域,在其N末端有一定的亲水区域,这与其他已知的CAX蛋白相似;二级结构分析表明:β-转角和不规则卷曲所占比例较大;跨膜片段分析显示其含有11个跨膜片段。(本文来源于《中国农业科学院》期刊2010-06-01）
刘玉刚,初同伟[9]（2009）在《应用抑制性差减杂交技术克隆幼年兔损伤关节软骨再生相关基因》一文中研究指出目的构建幼年新西兰白兔软骨再生修复因子的抑制性差减基因片断文库,克隆筛选主导幼年新西兰白兔膝关节软骨损伤后自然修复的相关基因。方法应用抑制性消减杂交技术(suppression subtractivehybridization,SSH)构建幼年新西兰白兔损伤膝关节软骨修复组织的消减杂交文库,通过PCT(本文来源于《第七届全国创伤学术会议暨2009海峡两岸创伤医学论坛论文汇编》期刊2009-09-25）
任洪林,徐丹丹,乔琨,蔡灵,黄伟滨[10]（2008）在《细菌攻毒杂色鲍血淋巴细胞抑制性差减杂交文库构建及巨噬细胞表达蛋白cDNA的克隆与差异表达》一文中研究指出以雌性杂色鲍为对象,以大肠杆菌、副溶血弧菌、溶壁微球菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌的混悬液做为攻毒菌,利用抑制性差减杂交(SSH)技术构建细菌攻毒的杂色鲍血淋巴细胞SSHcDNA文库。随机挑取生长菌落110个克隆子,进行菌液PCR鉴定,计算文库重组率为98.18%,文库容量为1.37×106pfu。将重组子测序,经BLAST一致性搜索比对分析,有一重组片段含有穿孔素(Perforin)保守结构域,为巨噬细胞表达蛋白(MEP)类穿孔素部分cDNA序列,片段大小为1551bp,连续编码517个氨基酸残基,申请GenBank登录号为EU272049。经半定量PCR和荧光定量PCR差异显示分析,发现在细菌感染状态下MEP基因在血淋巴细胞中存在明显的上调表达现象。(本文来源于《遗传》期刊2008年08期）
差减克隆论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
与脊椎动物相似，昆虫在进化中形成强大的免疫系统，包括先天免疫系统和获得性免疫系统，由于缺乏对昆虫获得性免疫的认知，目前的研究主要针对昆虫的先天免疫系统。昆虫的先天免疫系统主要包括叁个通路：Toll通路、Imd通路和JAS/STAT通路。荒漠昆虫在极端环境中进化形成了独特的免疫抗菌适应机制，本研究以准噶尔荒漠广布的光滑鳖甲为研究对象，构建细菌诱导的抑制差减cDNA文库，筛选免疫抗菌相关的蛋白基因，这将对揭示光滑鳖甲的免疫适应机制和发展荒漠昆虫的免疫调控系统奠定理论基础。本研究首先根据实验室已建立的光滑鳖甲饲养体系，培养出1～6龄幼虫，观察各龄期昆虫的形态及体重特征。经抑菌实验分析，确定了诱导条件：取光滑鳖甲5龄幼虫为实验材料，体重0.1～0.2g，将大肠杆菌与金黄色葡萄球菌分别培养12h，微量注射器取10μL混合菌液（1:1混合）注射于幼虫侧腹部第叁节处，30℃培养16h。根据光滑鳖甲幼虫脂肪含量、角质等多糖含量确定不同实验方案提取RNA，采用TRIzol法提取总RNA，获得总RNA的OD260/280为2.0，终浓度为2.128μg·μL~(-1)，电泳检测完整的RNA。Oligotex mRNA Kits试剂盒纯化获得光滑鳖甲mRNA，通过抑制差减杂交技术获得光滑鳖甲的差减cDNA文库，蓝白斑、PCR、地高辛筛选阳性克隆，最终获得70个长度在250～750bp的ESTs序列。根据表达量的改变方向分为正向文库和反向文库两部分，进行功能分类后发现所获得的基因涉及生物调节，细胞致死，细胞分子、组织构成、生物进化，细胞过程，免疫系统过程，代谢过程，多生物体过程，刺激应答等过程，其中刺激应答和多生物体过程涉及蛋白相对丰富，分析结果提示，昆虫的免疫应答过程往往与一些环境因素的应答同时发生，两种系统相互影响。选取正向文库中的抗菌肽和肽聚糖识别蛋白基因ESTs序列进行全长扩增，在5'-RACE和3'-RACE的PCR扩增基础上，克隆获得抗菌肽基因AMPFA85全长，对测序正确的全长序列进行生物信息学分析，预测所得抗菌肽为cecropin类抗菌肽，分子量为16.6kDa，生理pH下呈碱性，带有3个单位的正电荷，序列中含有16个甘氨酸，二级结构中包含一个α-螺旋和5个β-折迭，C-端疏水、N-端亲水。总之，本研究进一步完善了光滑鳖甲饲养体系，确定了细菌免疫诱导光滑鳖甲的诱导条件，构建了光滑鳖甲抑制差减cDNA文库，对文库中表达的基因进行功能注释，分析了具有特定功能的蛋白，表明光滑鳖甲经细菌诱导后将激活Toll通路和酚氧化酶原级联反应；克隆获得了cecropin类抗菌肽AMPFA85基因，并对所得抗菌肽结构与功能进行了预测，AMPFA85基因的表达与活性分析有待进一步研究。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
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