导读:本文包含了组蛋白融合蛋白载体论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:GST-HDAC1融合蛋白,原核表达
组蛋白融合蛋白载体论文文献综述
王桂玲,陈薇,王孝会,姜佩佳[1]（2011）在《组蛋白脱乙酰化酶GST-HDAC1融合蛋白载体的构建及其在大肠杆菌中的表达》一文中研究指出目的构建GST-HDAC1融合蛋白表达载体,并在大肠埃希菌(E.coli)中诱导表达。方法以质粒pcDNA3.1-HDAC1为模板进行PCR,通过EcoR1单酶切位点将HDAC1插入pGEX-5X-1中,构建原核表达质粒pGEX-5X-1-HDAC1,并转化E.coli DH5α,通过利用载体上的BamH1酶切位点和HDAC1上Nde1酶切位点来筛选阳性重组子,DNA序列测定正确后,转入化E.coli BL21中,异丙基硫代β-D半乳糖苷诱导表达,鉴定。结果酶切后获得940bp片段为正向;如获得500bp片段为反向。重组质粒测序后与GenBank进行同源性比对证明导入片段为HDAC1,成功构建了原核表达质粒pGEX-5X-1-HDAC1,并用SDS-PAGE方法证实了GST-HDAC1融合蛋白在大肠杆菌中的表达。结论成功构建了HDAC1原核表达载体,并证实了融合蛋白在大肠埃希菌中的表达,为进一步纯化HDAC1蛋白及与其它蛋白的关系奠定了基础。(本文来源于《解剖科学进展》期刊2011年06期）
王春艳[2]（2010）在《组蛋白H4融合蛋白载体用于肿瘤基因治疗的研究》一文中研究指出作为一类新型的非病毒基因转运工具,蛋白或多肽介导的基因转运越来越表现出强大的基因转运效率。在当前的研究中,一些研究人员发现,组蛋白能有效的介导基因转运(组蛋白转染)。小麦组蛋白H4是构成核小体的核心组蛋白,由103个氨基酸组成,它的基因序列和蛋白的空间结构最初是由Tabata等人1983年发表的。它与人的组蛋白H4及其它真核生物的组蛋白H4有着高度的同源性,基因内部均不含内含子序列。在氨基酸组成上来讲,与人的组蛋白H4氨基酸序列相比,只有第61和78两个位点的氨基酸差异。这个分子量大约在11.0 kDa小分子蛋白,由于它的低毒性和低免疫原性,是一个较好的基因转运工具的候选分子。基于此,我们构建了组蛋白H4融合蛋白基因转运载体。蛋白跨膜结构转导域(PTDs)是一类能穿越哺乳动物细胞质膜的小分子多肽类物质,这类物质已经被广泛应用于蛋白质治疗的各个领域。研究人员可以通过基因工程的方法将PTDs的基因与细胞毒作用的蛋白进行融合与表达,借此将异源目的蛋白携入细胞内。PTD-tat是研究比较透彻的一个穿膜肽。它是来源于HIV-1病毒的TAT蛋白的一个多肽结构域,由11个氨基酸组成。它的组成序列,YGRKKRRQRRR,由几个强碱性的氨基酸序列组成的,并且是完成穿膜作用的关键肽段。考虑到PTD-tat在药物运输中起到的重要作用,很多人利用此分子作为治疗性分子或粒子进入哺乳动物细胞的重要工具。尽管有报导称,四种核心组蛋白都有蛋白跨膜转运的能力,但是在研究表明,与单纯的组蛋白相比较,引入PTD-tat融合组蛋白作为DNA转运工具,在很大程度上能够提高组蛋白转染细胞的效率。正是因为此多肽能够高效的介导小分子和大分子的细胞内摄,在本研究中,我们将此肽整合进入小麦组蛋白H4的C末端,以保证小麦组蛋白H4能通过PTD-tat的途径高效的将治疗基因携入细胞内。除此之外,靶向性药物专一地用于治疗癌症有着许多优点,例如可以维持一个较低的给药浓度,就能将药物从血清中运送至靶细胞,还可以减少药物的副作用,并且可以提高抗肿瘤的效率。一个成功的靶向性药物传输系统必须能够获得很高的细胞穿膜效率并能停滞于特异性的细胞类群上。这种特异性是通过将靶向性的基序与药物传输系统相结合,而这些基序也必须能够精确的与癌症细胞表面的受体相结合。这样才能有效的降低药物对正常的健康组织的副作用。促黄体素释放素(LHRH)的受体在人乳腺癌、卵巢和子宫内膜肿瘤以及前列腺癌细胞等肿瘤细胞表面过量表达,而在正常内脏组织细胞表面没有表达,因此,我们利用LHRH作为靶向性的基序转运抗肿瘤药物至特定的癌症细胞,起到了很好的效果。本研究构建了一个异源性的、有组氨酸标签的重组小麦组蛋白H4,命名为H4TL。在小麦根尖组织中提取了小麦基因组,目标基因H4TL包含小麦组蛋白H4基因,蛋白跨膜转导肽TAT基因以及靶向性配体分子LHRH的基因序列。通过PCR方法在小麦基因组中扩增H4基因,利用重迭延伸PCR方法对基因进行改造。经过6次PCR,每次PCR片段均克隆进pMD18T载体中进行鉴定,鉴定正确后的片段进入下一次延伸反应,最后得到了编码完全正确的基因片段,将此片段插入改造过的原核表达载体pET28a (++)中,得到重组pET28a(++)-H4TL质粒。将鉴定正确的质粒转入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中,利用IPTG诱导表达。此目的蛋白在大肠杆菌中获得高效表达。目的蛋白是一个含有141个氨基酸,分子量为15.5 kDa小分子蛋白。利用抗His标签的单克隆抗体对目的蛋白进行了Western blot鉴定。将表达阳性的细胞通过摇瓶进行发酵培养,通过改变诱导条件,优化了最佳表达条件,培养基PH为6.8-7.6,诱导剂IPTG浓度范围0.6-1.0mM,诱导温度25-30℃,诱导时间>10h,得到了高效可溶性表达,表达量占菌体总蛋白的35%以上。收集发酵瓶中细胞,用超声波破碎后离心,上清过滤后冷冻保存。用质量分数为30%的硫酸铵溶液盐析沉淀目的蛋白,随后用6M盐酸胍变性结合亲和层析分离和纯化融合蛋白H4TL,亲和纯化的介质为Ni~+-葡聚糖。100-200mM的咪唑进行梯度洗脱,收集到峰期的洗脱液,用凝胶层析脱盐柱快速脱盐,纯化后的样品经超滤柱或PEG20000进行浓缩,于超净工作台用0.22μm滤膜过滤后冷冻保存。最终建立了一种有效的纯化方法,对重组蛋白进行了高效的分离和纯化,高效液相色谱分析其纯度达到了95%以上。用SmartSpecTM plus分光光度法测定纯化后蛋白浓度,分别按蛋白/质粒DNA质量比0-8进行凝胶电泳阻滞试验,凝胶电泳阻滞结果证明重组蛋白H4TL可以有效的结合质粒DNA。在凝胶电泳阻滞试验的基础上,我们对结合后的蛋白/DNA复合物进行了降解试验。核酸降解试验结果证明了重组蛋白与DNA形成的复合物有很强的稳定性,并且可以有效的防止DNA酶的降解。更重要的是,此蛋白成功地将报告基因pEGFP/C1转染进入人乳腺癌细胞MCF-7,人卵巢癌细胞HO8910,人前列腺癌细胞LNCap,人肺癌细胞A549以及人宫颈癌细胞HeLa中,转染效率与细胞类型、复合物浓度、蛋白与质粒DNA的配比、细胞密度及Ca~(2+)浓度有关。我们确立的最佳的转染条件为蛋白与质粒DNA质量比4:1,转染前细胞为60-70%丰度,Ca~(2+)浓度为2-4mM。凋亡素,是一个来源于鸡贫血病毒的小分子蛋白质,之所以受到人们关注,是因为它可以选择性的杀死肿瘤细胞而对正常细胞无毒性作用。凋亡素的亚细胞定位是肿瘤特异性的关键因素,在正常细胞中,它位于细胞质中,而有肿瘤细胞中它可以转运进入细胞核中。凋亡素的这种核定位机制主要是由自身的磷酸化水平控制的。在肿瘤细胞中,凋亡素引起活细胞内包括Akt等激酶物质的核聚集,并且可以被CDK2磷酸化。因此,凋亡素可以间接地在活细胞内传递细胞凋亡信号。此外,凋亡素也会以多聚物的形式与DNA分子相结合,通过与几个核靶分子相互作用,例如与促细胞后期复合物相互作用,导致G2/M期逃逸。这种促凋亡信号由信号分子Nur77经核传递给细胞质,激活非p53依赖的线粒体途径,诱导肿瘤细胞凋亡。我们利用靶向性的蛋白H4TL作为载体,进行凋亡素基因的转染研究,来评价H4TL的转染效率及其凋亡素转入细胞后的释控及表达,同时检测凋亡素基因对人乳腺癌细胞MCF-7及人卵巢癌HO8910两种肿瘤细胞的凋亡作用。我们构建了凋亡素真核表达载体pcDNA3.1(+)/apoptin,利用重组蛋白H4TL将其转染进入受试细胞中。利用经典的RT-PCR和western blot分析其在受试细胞中的表达情况;MTT法检测了转染凋亡素后细胞的增殖抑制情况,利用Annexin V–FITC /PI双荧光染色法对转染后的细胞进行细胞凋亡的检测,得到了较高凋亡率,对阴性的对照细胞系-正常人肺胚二倍体细胞2BS的凋亡率不超过20%,MCF-7细胞的凋亡率达到了42%(对照组为9.18%); HO8910细胞的凋亡率为44%(对照组为3.31%)。此外,我们利用DNA ladder法检测了凋亡后细胞中的基因组DNA的片段化,利用罗丹明123作为荧光染料检测了处于凋亡状态的细胞的线粒体膜电位的缺失情况,这些试验帮助我们进一步验证了重组蛋白H4TL作为基因转运载体和凋亡素作为治疗基因的有效性。同时,这些结果说明了靶向于肿瘤特异性受体的非病毒载体为基因转运提供了一个廉价的、简单高效的工具。(本文来源于《吉林大学》期刊2010-12-01）
刘承武,陈登宇,胡水旺,刘靖华,姜勇[3]（2009）在《白蛋白融合蛋白表达载体的构建及其在细胞中的表达和定位》一文中研究指出目的:构建白蛋白-血凝素(Alb-HA)融合蛋白的真核表达载体,观察Alb在NIH3T3细胞中表达和定位。方法:采用两步克隆法将HA和Alb的编码序列以融合表达的形式克隆到载体pcDNA3上,随后转染NIH3T3细胞在荧光显微镜下观察Alb的表达和分布。结果:重组质粒经酶切、聚合酶链反应(PCR)和测序鉴定证明构建正确,并在NIH3T3细胞中大量表达,免疫荧光标记后在荧光显微镜下观察,Alb-HA融合蛋白分布于细胞质内。结论:成功构建Alb-HA融合蛋白表达载体并表达于NIH3T3细胞中,为下一步深入研究Alb的细胞内功能奠定了基础。(本文来源于《广西医科大学学报》期刊2009年01期）
梁爽,于振香,赵丹,杨柯,赵雪俭[4]（2006）在《大鼠睾丸AQP8和绿色荧光蛋白融合蛋白表达载体构建》一文中研究指出目的:克隆Wistar大鼠睾丸水通道蛋白(AQP8)cDNA,构建增强型绿色荧光蛋白(EGFP)与大鼠AQP8的融合蛋白真核细胞表达载体。方法:用RT-PCR钓取AQP8 cDNA编码区全长序列,测序鉴定,将AQP8 cDNA亚克隆于pEGFP-C1基因的下游。结果:①AQP8 cDNA测序结果与登录在GenBank上的大鼠AQP8基因序列(GenBank登录号:NM_019158)高度同源,但PCR产物的序列分析结果中发现4个碱基序列与已发表的AQP8序列不同:NM_019158的第135~137位碱基分别是C、A和G,而测序结果缺乏这3个碱基,NM_019158的第311位为A,而测序结果为G;②酶切鉴定在表达载体pEGFP-C1中AQP8 cDNA融合于EGFP基因的下游。结论:pEGFP-C1-AQP8融合蛋白的表达载体构建成功。(本文来源于《吉林大学学报(医学版)》期刊2006年02期）
组蛋白融合蛋白载体论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
作为一类新型的非病毒基因转运工具,蛋白或多肽介导的基因转运越来越表现出强大的基因转运效率。在当前的研究中,一些研究人员发现,组蛋白能有效的介导基因转运(组蛋白转染)。小麦组蛋白H4是构成核小体的核心组蛋白,由103个氨基酸组成,它的基因序列和蛋白的空间结构最初是由Tabata等人1983年发表的。它与人的组蛋白H4及其它真核生物的组蛋白H4有着高度的同源性,基因内部均不含内含子序列。在氨基酸组成上来讲,与人的组蛋白H4氨基酸序列相比,只有第61和78两个位点的氨基酸差异。这个分子量大约在11.0 kDa小分子蛋白,由于它的低毒性和低免疫原性,是一个较好的基因转运工具的候选分子。基于此,我们构建了组蛋白H4融合蛋白基因转运载体。蛋白跨膜结构转导域(PTDs)是一类能穿越哺乳动物细胞质膜的小分子多肽类物质,这类物质已经被广泛应用于蛋白质治疗的各个领域。研究人员可以通过基因工程的方法将PTDs的基因与细胞毒作用的蛋白进行融合与表达,借此将异源目的蛋白携入细胞内。PTD-tat是研究比较透彻的一个穿膜肽。它是来源于HIV-1病毒的TAT蛋白的一个多肽结构域,由11个氨基酸组成。它的组成序列,YGRKKRRQRRR,由几个强碱性的氨基酸序列组成的,并且是完成穿膜作用的关键肽段。考虑到PTD-tat在药物运输中起到的重要作用,很多人利用此分子作为治疗性分子或粒子进入哺乳动物细胞的重要工具。尽管有报导称,四种核心组蛋白都有蛋白跨膜转运的能力,但是在研究表明,与单纯的组蛋白相比较,引入PTD-tat融合组蛋白作为DNA转运工具,在很大程度上能够提高组蛋白转染细胞的效率。正是因为此多肽能够高效的介导小分子和大分子的细胞内摄,在本研究中,我们将此肽整合进入小麦组蛋白H4的C末端,以保证小麦组蛋白H4能通过PTD-tat的途径高效的将治疗基因携入细胞内。除此之外,靶向性药物专一地用于治疗癌症有着许多优点,例如可以维持一个较低的给药浓度,就能将药物从血清中运送至靶细胞,还可以减少药物的副作用,并且可以提高抗肿瘤的效率。一个成功的靶向性药物传输系统必须能够获得很高的细胞穿膜效率并能停滞于特异性的细胞类群上。这种特异性是通过将靶向性的基序与药物传输系统相结合,而这些基序也必须能够精确的与癌症细胞表面的受体相结合。这样才能有效的降低药物对正常的健康组织的副作用。促黄体素释放素(LHRH)的受体在人乳腺癌、卵巢和子宫内膜肿瘤以及前列腺癌细胞等肿瘤细胞表面过量表达,而在正常内脏组织细胞表面没有表达,因此,我们利用LHRH作为靶向性的基序转运抗肿瘤药物至特定的癌症细胞,起到了很好的效果。本研究构建了一个异源性的、有组氨酸标签的重组小麦组蛋白H4,命名为H4TL。在小麦根尖组织中提取了小麦基因组,目标基因H4TL包含小麦组蛋白H4基因,蛋白跨膜转导肽TAT基因以及靶向性配体分子LHRH的基因序列。通过PCR方法在小麦基因组中扩增H4基因,利用重迭延伸PCR方法对基因进行改造。经过6次PCR,每次PCR片段均克隆进pMD18T载体中进行鉴定,鉴定正确后的片段进入下一次延伸反应,最后得到了编码完全正确的基因片段,将此片段插入改造过的原核表达载体pET28a (++)中,得到重组pET28a(++)-H4TL质粒。将鉴定正确的质粒转入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中,利用IPTG诱导表达。此目的蛋白在大肠杆菌中获得高效表达。目的蛋白是一个含有141个氨基酸,分子量为15.5 kDa小分子蛋白。利用抗His标签的单克隆抗体对目的蛋白进行了Western blot鉴定。将表达阳性的细胞通过摇瓶进行发酵培养,通过改变诱导条件,优化了最佳表达条件,培养基PH为6.8-7.6,诱导剂IPTG浓度范围0.6-1.0mM,诱导温度25-30℃,诱导时间>10h,得到了高效可溶性表达,表达量占菌体总蛋白的35%以上。收集发酵瓶中细胞,用超声波破碎后离心,上清过滤后冷冻保存。用质量分数为30%的硫酸铵溶液盐析沉淀目的蛋白,随后用6M盐酸胍变性结合亲和层析分离和纯化融合蛋白H4TL,亲和纯化的介质为Ni~+-葡聚糖。100-200mM的咪唑进行梯度洗脱,收集到峰期的洗脱液,用凝胶层析脱盐柱快速脱盐,纯化后的样品经超滤柱或PEG20000进行浓缩,于超净工作台用0.22μm滤膜过滤后冷冻保存。最终建立了一种有效的纯化方法,对重组蛋白进行了高效的分离和纯化,高效液相色谱分析其纯度达到了95%以上。用SmartSpecTM plus分光光度法测定纯化后蛋白浓度,分别按蛋白/质粒DNA质量比0-8进行凝胶电泳阻滞试验,凝胶电泳阻滞结果证明重组蛋白H4TL可以有效的结合质粒DNA。在凝胶电泳阻滞试验的基础上,我们对结合后的蛋白/DNA复合物进行了降解试验。核酸降解试验结果证明了重组蛋白与DNA形成的复合物有很强的稳定性,并且可以有效的防止DNA酶的降解。更重要的是,此蛋白成功地将报告基因pEGFP/C1转染进入人乳腺癌细胞MCF-7,人卵巢癌细胞HO8910,人前列腺癌细胞LNCap,人肺癌细胞A549以及人宫颈癌细胞HeLa中,转染效率与细胞类型、复合物浓度、蛋白与质粒DNA的配比、细胞密度及Ca~(2+)浓度有关。我们确立的最佳的转染条件为蛋白与质粒DNA质量比4:1,转染前细胞为60-70%丰度,Ca~(2+)浓度为2-4mM。凋亡素,是一个来源于鸡贫血病毒的小分子蛋白质,之所以受到人们关注,是因为它可以选择性的杀死肿瘤细胞而对正常细胞无毒性作用。凋亡素的亚细胞定位是肿瘤特异性的关键因素,在正常细胞中,它位于细胞质中,而有肿瘤细胞中它可以转运进入细胞核中。凋亡素的这种核定位机制主要是由自身的磷酸化水平控制的。在肿瘤细胞中,凋亡素引起活细胞内包括Akt等激酶物质的核聚集,并且可以被CDK2磷酸化。因此,凋亡素可以间接地在活细胞内传递细胞凋亡信号。此外,凋亡素也会以多聚物的形式与DNA分子相结合,通过与几个核靶分子相互作用,例如与促细胞后期复合物相互作用,导致G2/M期逃逸。这种促凋亡信号由信号分子Nur77经核传递给细胞质,激活非p53依赖的线粒体途径,诱导肿瘤细胞凋亡。我们利用靶向性的蛋白H4TL作为载体,进行凋亡素基因的转染研究,来评价H4TL的转染效率及其凋亡素转入细胞后的释控及表达,同时检测凋亡素基因对人乳腺癌细胞MCF-7及人卵巢癌HO8910两种肿瘤细胞的凋亡作用。我们构建了凋亡素真核表达载体pcDNA3.1(+)/apoptin,利用重组蛋白H4TL将其转染进入受试细胞中。利用经典的RT-PCR和western blot分析其在受试细胞中的表达情况;MTT法检测了转染凋亡素后细胞的增殖抑制情况,利用Annexin V–FITC /PI双荧光染色法对转染后的细胞进行细胞凋亡的检测,得到了较高凋亡率,对阴性的对照细胞系-正常人肺胚二倍体细胞2BS的凋亡率不超过20%,MCF-7细胞的凋亡率达到了42%(对照组为9.18%); HO8910细胞的凋亡率为44%(对照组为3.31%)。此外,我们利用DNA ladder法检测了凋亡后细胞中的基因组DNA的片段化,利用罗丹明123作为荧光染料检测了处于凋亡状态的细胞的线粒体膜电位的缺失情况,这些试验帮助我们进一步验证了重组蛋白H4TL作为基因转运载体和凋亡素作为治疗基因的有效性。同时,这些结果说明了靶向于肿瘤特异性受体的非病毒载体为基因转运提供了一个廉价的、简单高效的工具。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
组蛋白融合蛋白载体论文参考文献
[1].王桂玲,陈薇,王孝会,姜佩佳.组蛋白脱乙酰化酶GST-HDAC1融合蛋白载体的构建及其在大肠杆菌中的表达[J].解剖科学进展.2011
[2].王春艳.组蛋白H4融合蛋白载体用于肿瘤基因治疗的研究[D].吉林大学.2010
[3].刘承武,陈登宇,胡水旺,刘靖华,姜勇.白蛋白融合蛋白表达载体的构建及其在细胞中的表达和定位[J].广西医科大学学报.2009
[4].梁爽,于振香,赵丹,杨柯,赵雪俭.大鼠睾丸AQP8和绿色荧光蛋白融合蛋白表达载体构建[J].吉林大学学报(医学版).2006
标签：GST-HDAC1融合蛋白; 原核表达;