导读:本文包含了家蚕丝腺论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:家蚕,生物反应器,丝腺,表达系统
家蚕丝腺论文文献综述
王红,黄精彩,周尧丽,王玉军[1]（2018）在《家蚕丝腺生物反应器的研究进展》一文中研究指出由于家蚕丝腺出色的蛋白合成能力,加之蚕丝蛋白成分相对简单以及家蚕幼虫易于室内饲养和基因工程操作,其作为生物反应器在实验室水平和产业化应用层面都受到越来越广泛的应用。家蚕丝腺生物反应器主要是利用家蚕丝腺的蛋白质高效合成能力进行外援蛋白的生产。家蚕生物反应器是一种真核表达系统,具有表达成本低及表达产物活性高的优势,其不仅在开发新型茧丝复合材料方面有着得天独厚的优势,随着生物技术的进展,其在表达有用活性蛋白方面也得到越来越广泛的应用。家蚕生物反应器主要分为家蚕丝腺生物反应器和家蚕杆状病毒表达系统。主要对家蚕丝腺生物反应器的研究进展进行了综述,提出其中存在的问题。(本文来源于《黑龙江科学》期刊2018年12期）
汤小芳[2]（2018）在《BmCKI的鉴定及其调控家蚕丝腺细胞核内周期的研究》一文中研究指出家蚕(Bombyx mori)是重要的泌丝经济昆虫。丝腺是家蚕幼虫特有的泌丝器官,丝蛋白大量合成的前提是丝腺细胞进行核内周期(endocycle)。核内周期,也称为核内复制周期,是正常有丝分裂细胞周期的变异形式,即细胞只进行DNA复制而不发生胞质分裂,从而形成了多倍体细胞。家蚕丝腺细胞仅在胚胎期发生约10次有丝分裂,形成了包含前部丝腺、中部丝腺和后部丝腺约1080个细胞。自此之后,丝腺细胞进入核内周期,只进行DNA的合成和细胞体积的增大。在幼虫期,丝腺细胞经历持续的17~19轮核内周期,使得DNA含量达到正常二倍体细胞的约40万倍,这为吐丝期丝蛋白的大规模合成奠定了遗传基础。果蝇和小鼠中核内周期的研究表明,核内周期的运转是由细胞周期依赖性激酶(cyclin-dependent kinase,CDK)活性的周期性振荡驱动的。细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(cyclin-dependent kinase inhibitors,CKIs)是CDK的主要负调节因子,它能与细胞周期蛋白(cyclin)和CDK结合并抑制CDK的激酶活性。与自然界其它进行核内周期的细胞相比,家蚕丝腺细胞发生核内复制的时间跨度更长,DNA复制效率更高效,是研究核内周期的理想材料,阐明丝腺细胞核内周期的调控机制,可为完善家蚕细胞周期调控机制提供重要线索,也可为丝腺遗传改良提供重要的理论依据。本研究对家蚕CKI进行了克隆和鉴定,并分析了该基因参与调控丝腺核内周期的作用机制,为家蚕丝腺细胞核内周期机制的解析和家蚕丝腺遗传改良提供了有利依据。主要研究结果和结论如下:1.BmCKI基因的鉴定及特征分析家蚕基因组中仅存在一个Cip/Kip家族同源基因,将该基因命名为BmCKI。BmCKI有两个剪切体,分别命名为BmCKI-L和BmCKI-S。这两个剪切体具有不同的5’非编码区(5’untranslated region,5’UTR),BmCKI-S从第二个外显子处的起始密码子进行翻译。BmCKI-L的编码区(coding sequence,CDS)全长654 bp,编码217个氨基酸(amino acid,aa),而BmCKI-S的CDS长度为579 bp,编码192个氨基酸,两者的CDS仅在5’端相差75 bp。序列分析显示,BmCKI-L和BmCKI-S存在Cip/Kip家族保守的结构域,该结构域包含cyclin结合位点和CDK结合位点。系统发生树分析显示,家蚕BmCKI蛋白与果蝇的同源蛋白聚在一支,两者同源性最高。免疫荧光分析BmCKI-L和BmCKI-S的亚细胞定位,结果显示两者均定位于细胞核。为了鉴定BmCKI的核定位信号,我们构建了一系列BmCKI-L的截短突变,并通过免疫荧光分析其定位情况。结果表明,181-210 aa区域是BmCKI-L核定位序列所在之处,该区域存在一个非典型的二元核定位信号,该核定位信号前后由两簇基本氨基酸组成,中间由16 aa连接,连接区域富含弱碱性的组氨酸。用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)分析了BmCKI-L和BmCKI-S的组织表达模式,发现BmCKI-L在表皮和卵巢的表达量较高,而在精巢的表达量较低;BmCKI-S在中肠的表达量比较高,而在丝腺的表达量最低,表明BmCKI-L和BmCKI-S存在不同的表达模式。2.BmCKI对家蚕细胞周期的调控为了在细胞水平上鉴定BmCKI的功能,我们首先在BmN-SWU1细胞系中,分别进行了过表达BmCKI-L和BmCKI-S的实验研究。过表达BmCKI-L和BmCKI-S的实验组中,G1期细胞显着增加,S期和G2期细胞显着减少,表明过表达BmCKI-L和BmCKI-S导致细胞周期阻滞在G1期;在过表达BmCKI-L和BmCKI-S的BmN-SWU1细胞中BrdU标记率明显下降,表明过表达BmCKI-L和BmCKI-S抑制DNA复制;过表达BmCKI-L和BmCKI-S的BmN-SWU1细胞增殖活性显着下降,表明过表达BmCKI-L和BmCKI-S抑制细胞增殖。同时,在BmN-SWU1细胞系中,分别进行了干涉BmCKI-L和BmCKI-S的实验研究。干涉BmCKI-L和BmCKI-S的实验组中,G2/M期细胞显着增加,S期和G1期细胞显着减少,表明干涉BmCKI-L和BmCKI-S使细胞积累于G2/M期;在干涉BmCKI-L和BmCKI-S的细胞中BrdU标记率显着上升,表明干涉BmCKI-L和BmCKI-S促进DNA复制;干涉BmCKI-L和BmCKI-S的BmN-SWU1细胞增殖活性显着上升,表明干涉BmCKI-L和BmCKI-S促进细胞增殖。综上表明,BmCKI-L和BmCKI-S参与细胞周期调控。为了探究BmCKI调控细胞周期的机制,我们利用qRT-PCR分别检测了过表达和干涉BmCKI后各周期调控因子的相对表达量。结果显示,过表达BmCKI-L和BmCKI-S后,周期蛋白cyclin A、cyclin B、cyclin D和cyclin E以及周期蛋白依赖性激酶CDK2和CDK4表达量显着下调,说明过表达BmCKI-L和BmCKI-S抑制G1和S期各周期调控因子的表达;干涉BmCKI-L和BmCKI-S后,周期蛋白cyclin A和cyclin B以及周期蛋白依赖性激酶CDK1表达量显着上调,说明干涉BmCKI-L和BmCKI-S促进G2和M期周期调控因子的表达。3.BmCKI对家蚕个体生长发育的调控为了在个体水平上鉴定BmCKI的功能,我们利用家蚕转基因技术,创制了全蚕过表达BmCKI-L的转基因品系,命名为BmCKI-L-OE。对BmCKI-L-OE品系G1代的蚕卵进行观察,发现约2/3的胚胎致死,1/3的胚胎能成功孵化。相较于同龄期正常大造,BmCKI-L-OE幼虫体型小且存在不同程度的发育迟缓,此外在饲养过程中BmCKI-L-OE幼虫逐渐死亡。我们对BmCKI-L-OE品系在胚胎期和幼虫期的存活率进行统计分析,结果显示在家蚕中过表达BmCKI-L会引起胚胎及幼虫致死。解剖BmCKI-L-OE品系5龄幼虫,发现BmCKI-L-OE品系幼虫多个组织的发育存在异常,比如:马氏管萎缩;气管分支显着减少且长度严重缩短;丝腺显着变小;脂肪体很少。以上结果表明,BmCKI参与家蚕生长发育的调控。4.BmCKI对家蚕丝腺核内周期的调控为了鉴定BmCKI是否参与丝腺细胞核内周期调控,我们利用家蚕转基因技术,创制了丝腺组织特异性过表达BmCKI-L的转基因品系,命名为Ser1~P-BmCKI-L-OE。表型分析结果显示Ser1~P-BmCKI-L-OE幼虫相比于正常大造体型明显要小,体重明显要轻;以及其丝腺的大小、长度、直径和重量都要明显小于大造幼虫的,表明在家蚕丝腺组织中过表达BmCKI-L会抑制丝腺的生长发育。经济性状分析结果显示,Ser1~P-BmCKI-L-OE品系的全茧量、蛹重、茧层量相比于正常大造都显着减轻;同时,Ser1~P-BmCKI-L-OE品系的茧层率相比于正常大造显着减小。利用冷冻切片和DAPI染色检测丝腺细胞DNA含量的变化,结果发现,Ser1~P-BmCKI-L-OE品系前部、中部和后部丝腺的DAPI标记量均显着低于大造组,说明Ser1~P-BmCKI-L-OE品系DNA含量比大造组少;对Ser1~P-BmCKI-L-OE品系的丝腺体外进行BrdU标记以测定丝腺DNA复制情况,结果显示,Ser1~P-BmCKI-L-OE品系前部、中部和后部丝腺BrdU标记率均低于大造组,说明Ser1~P-BmCKI-L-OE品系丝腺DNA复制相较于大造品系减弱。以上结果表明,在丝腺组织中特异性过表达BmCKI-L抑制丝腺细胞的核内周期。5.BmCKI相互作用蛋白的鉴定及作用机制研究为了鉴定BmCKI的作用机制,我们首先通过酵母双杂交技术,以BmCKI-L蛋白为诱饵筛选到3个与BmCKI-L可能存在相互作用的蛋白,分别是BmPCNA、BmRACK1和BmSTMN。通过酵母双杂交回转实验,免疫荧光共定位以及免疫共沉淀技术证实这3个蛋白与BmCKI-L都具有相互作用。PCNA是DNA聚合酶的辅助因子,在DNA复制和修复中起到重要作用。RACK1是一个具有7个色氨酸-天冬氨酸重复序列的支架蛋白,在细胞不同区域分别结合各种蛋白,从而在许多基本生理过程中都发挥重要的作用。STMN是一种微管不稳定蛋白,存在于胞质中,与微管解聚有关。qRT-PCR分析这3个基因的组织表达谱,结果显示BmPCNA基因在丝腺中特异性高表达,BmSTMN基因在丝腺特异性中低表达,而BmRACK1基因在各个组织中均有较高的表达。流式检测BmPCNA过表达和干涉对细胞周期的影响,结果显示过表达BmPCNA后,S期细胞增加,而干涉BmPCNA后,S期细胞减少。推测,过表达BmPCNA抑制DNA的复制从而导致S期细胞减少;反之,干涉BmPCNA促进DNA的复制从而引起S期细胞增加。qRT-PCR结果表明,BmCKI-L处于BmPCNA的上游,并抑制BmPCNA的表达。推测,BmCKI-L可能通过抑制BmPCNA,调控DNA复制,从而调控细胞周期。流式结果显示过表达BmRACK1,G1期细胞增加,G2/M期细胞减少;而干涉BmRACK1,G2/M期细胞增加,G1期细胞减少。qRT-PCR结果表明,BmRACK1可能处于BmCKI-L的上游,并促进BmCKI-L的表达。推测,过表达BmRACK1,引起BmCKI-L表达量上升,从而导致G1期细胞增多,G2/M期细胞减少;反之干涉BmRACK1,降低了BmCKI-L的表达量,使得G2/M期细胞增加,G1期细胞减少。流式结果显示,无论过表达还是干涉BmSTMN都会引起G2/M期细胞增加,G1期细胞减少。推测,持续过表达或干涉BmSTMN,都会导致纺锤体无法顺利组装,从而将细胞周期阻滞在M期。qRT-PCR结果显示,BmCKI-L处于BmSTMN的上游,并抑制BmSTMN的表达。推测,BmCKI-L可通过抑制BmSTMN,调控细胞骨架网络,从而调控细胞周期。综上,我们构建了可能的BmCKI调控细胞周期网络。BmCKI可通过多种途径参与正常有丝分裂周期和丝腺核内周期的调控:BmCKI与cyclin-CDK复合物结合并抑制复合物的活性,参与细胞周期调控;BmCKI通过结合并抑制BmPCNA,调控DNA复制,参与细胞周期调控;BmCKI通过结合并抑制BmSTMN,调控细胞骨架动力学,参与细胞周期调控;此外,BmRACK1影响BmCKI的表达。(本文来源于《西南大学》期刊2018-05-14）
程小瑜,胡佳欢,李金鑫,薛彬,田江海[3]（2017）在《家蚕丝腺对辛硫磷的富集及其通过PI3K/Akt信号通路调节解毒酶基因的转录》一文中研究指出家蚕丝腺是合成与分泌丝蛋白的主要器官,辛硫磷中毒导致家蚕吐丝障碍直接影响蚕丝业的发展。为了研究家蚕丝腺对辛硫磷的富集及其解毒酶相关基因的表达特征和酶活性变化,本研究用HPLC(高效液相色谱法)测定了家蚕丝腺和血淋巴在添食辛硫磷后的富集程度,通过qRT-PCR分析PI3K/Akt信号通路关键基因和解毒酶相关基因的转录水平,并且用相关解毒酶检测试剂盒测定了叁种解毒酶活性。结果表明,和血淋巴中辛硫磷含量相比,丝腺中含量呈上升趋势,在48 h达最高值(1.58μg/mL),表明丝腺对辛硫磷具有明显的富集作用;基因转录水平结果表明,丝腺中PI3K/Akt信号通路关键基因Akt、Tor1、p70s6k和4e-bp的相对表达量分别上调6.919、1.358、10.766和7.708倍。除此之外,解毒酶系相关基因CYP6AB、CYP306A、Care2、GST1和GSTd1的相对表达量也呈上升趋势,分别上调1.731、1.221、1.366、1.376和6.591倍,其中GSTd1上调水平最明显。CYP450,CarE和GST的酶活性在48 h高于24 h。该结果为研究辛硫磷对家蚕丝腺的损伤以及PI3K/Akt通路介导的丝腺解毒机制提供参考。(本文来源于《中国蚕学会第九届青年学术研讨会论文集（摘要汇编）》期刊2017-10-26）
常怀普[4]（2017）在《家蚕丝腺组学分析及丝腺表皮蛋白功能研究》一文中研究指出家蚕是重要的鳞翅目模式昆虫,因其重要的生物学价值和经济价值而被人们广泛研究,并已有比较清楚的遗传学背景。家蚕丝腺拥有精巧的生物学构造和强大的蛋白合成与分泌功能,这些生物学特性是家蚕合成蚕丝并实现其重要价值的基本前提。然而,截至目前,决定家蚕丝腺特异性构造以及蛋白合成和分泌的分子机理仍未被全面揭示,这严重影响了家蚕作为模式昆虫的应用范畴,严重制约了人们改良蚕丝属性和培育高产家蚕品种的效率,严重阻碍了家蚕生物反应器的实践进度以及家蚕在医疗、美容、材料等领域的应用进程。本研究即是围绕这一科学问题展开的。本研究着眼于家蚕丝腺合成和分泌蛋白的分子机理和时空调控机制,采用转录组学、蛋白质组学、Western Blot、荧光定量PCR技术等分子生物学策略对家蚕丝腺进行了系统研究,以期获得充分的基因转录和蛋白表达数据,为家蚕丝腺相关研究提供重要的理论支持和完善的数据支撑。本研究获得以下主要结果。1.采用RNA-Seq等方法对雌雄家蚕丝腺不同区段转录组进行了系统分析本研究测定了5龄3天雌雄家蚕丝腺前部、中部前区、中部中区、中部后区和后部丝腺的转录组数据(SRA accession number:PRJNA284192),发现在测定的丝腺10个样品中,至少在1个样品有表达的基因共有7419个;其中,在雌雄家蚕前部丝腺中有表达的基因分别为5339个和5592个。前部丝腺相对于其他部位在雌雄家蚕中均上调表达的基因282个,对它们进行功能分析发现,这些基因的功能主要集中到氢离子转运、表皮蛋白合成、丝氨酸蛋白酶抑制剂合成和糖酵解等方面。研究表明,离子转运的发生是丝蛋白在前部丝腺发生构象转变的重要前提,这个过程是由ATP驱动的耗能过程,而前部丝腺鉴定到的糖酵解相关蛋白为这一过程提供了必要的ATP。表皮蛋白可能参与构成了丝腺的表皮层,而丝氨酸蛋白酶抑制剂则保护丝蛋白在丝腺贮存过程中不被降解。2.采用LC-MS/MS等技术对家蚕丝腺不同区段蛋白质组进行了系统鉴定本研究检测了5龄3天家蚕丝腺前部、中部前区、中部中区、中部后区和后部丝腺的蛋白质组数据,在丝腺前部、中部前区、中部中区、中部后区和后部丝腺中分别鉴定到了1615、2060、2139、2105和2132个蛋白质。其中,有1078个蛋白质是在5个区段中都被鉴定到的共有蛋白质,5个丝腺区段中特异高量表达的蛋白质数分别为364、181、117、138和344个。通过比较蛋白质组分析和GO分析,发现前部丝腺中拥有很多特异表达的蛋白质,主要包括表皮蛋白、离子通道蛋白和糖酵解蛋白这3大类,这个结果和转录组分析结果一致。推测这叁个通路在丝蛋白构象转变和丝纤维形成过程中均发挥巨大的作用。3.利用qRT-PCR等技术研究了家蚕丝腺表皮蛋白的种类、分布和功能本研究结合家蚕转录组和蛋白质组数据,筛选到在5龄3天家蚕前部丝腺特异高量表达的56个表皮蛋白。染色体位置分析发现,32个表皮蛋白基因串联分布于叁条染色体的四个区段。这四群表皮蛋白的序列同源性很高,暗示它们是通过基因复制进化而来的。在转录水平上,42个表皮蛋白在前部丝腺的表达量比在丝腺其它区段中的表达量高100倍以上;在蛋白水平上,19个表皮蛋白只能在前部丝腺中检测到,而在丝腺其它区段中检测不到。通过家族保守性分析发现,这56个表皮蛋白中,有31个属于CPR家族;其余25个包含14个CPH家族、5个CPAP家族、3个CPG家族、2个CPT家族和1个Chitin_bind_3家族。由于CPH和CPG家族的保守基序很短,我们对其中的基因进行了保守基序的提取和重新命名,新发现了8个新的表皮蛋白家族,为揭示不同家族的表皮蛋白在丝腺中的分工和协同进化奠定了基础。4.采用Western Blot等技术研究了家蚕丝腺特异基序表皮蛋白的功能本研究采用Western Blot技术测定了4个表皮蛋白CPR90、CPR68、CPAP3-G和CPAP 3-J在5龄3天的表达情况,以及4龄到5龄的动态表达规律,进一步证实CPR家族的表皮蛋白在4龄和5龄的食桑期高量表达,在眠期表达量很低;CPAP家族的表皮蛋白表达情况却与CPR家族的表皮蛋白不同,而是在眠期表达量更高,但到了食桑期表达量迅速降低。利用免疫组化等技术对CPAP3-G在前部丝腺中的定位和时期动态表达规律进行了检测,结果发现CPAP3-G与几丁质具有相同的定位,表明其分布于几丁质层中;同时,CPAP3-G的时期表达规律与Western Blot检测结果高度一致。研究还发现了家蚕丝腺中特异表达的8个CPAP蛋白,结合NCBI网站资源分析,获得这8个CPAP蛋白的结构域,并进一步命名(或归类)为CPAP3-I、CPAP3-G、CPAP3-H、CPAP1-Q、2个chitinases和2个chitin deacetylases。结合本研究结果,本文就丝腺内表皮层在眠期的更新过程作出如下推断:CPR表皮蛋白是4龄前部丝腺主要的表皮蛋白,4龄前部丝腺中的几丁质层是完整的,进入4眠期之后,丝腺的几丁质层开始了降解和重生的更新过程,伴随着CPR表皮蛋白的含量迅速降低,CPAP表皮蛋白和含有CPAP结构域的几丁质降解酶的含量急剧提高,几丁质被降解为中间代谢产物,CPR蛋白也被蛋白水解酶所降解。在5龄早期,几丁质中间代谢产物在一系列酶的催化下又重新生成了几丁质,和新表达的CPR表皮蛋白结合在前部丝腺的腔内生成了新的表皮层,与此同时,完成使命的CPAP蛋白也逐渐被降解,前部丝腺内表皮层也就完成了在眠期的更新过程。(本文来源于《西南大学》期刊2017-10-10）
杜国玉[5]（2017）在《BmGeminin1对家蚕丝腺细胞核内周期的影响研究》一文中研究指出核内复制是生物体内广泛存在的一类只进行DNA复制但不进行细胞分裂的特殊细胞周期类型,在不同生物体内执行着不同的功能。核内周期独特的周期现象受到广泛关注,研究发现植物中的核内周期广泛参与胚芽、根、果实等组织的形成与发育;哺乳动物核内周期广泛参与到细胞损伤修复、组织生长发育等生物学过程。家蚕丝腺具有典型的核内周期特征,在胚胎期发生次数有限的有丝分裂后,幼虫期丝腺细胞进行持续的核内复制,表现为细胞DNA重复复制,细胞体积增大。以家蚕丝腺作为对象进行研究,为解析家蚕丝腺高效合成蚕丝蛋白的机制奠定基础,可望为生物体核内周期调控机制研究提供线索。本实验室先前已鉴定出两个Geminin基因,并命名为BmGeminin1(BmGem1)和BmGeminin2(BmGem2)。研究其功能时发现,干涉该基因则引发细胞DNA重复复制、DNA异倍化,而过表达BmGem1能够使细胞阻滞在S期,不能引起细胞DNA异倍化。。为了探究BmGem1在家蚕丝腺核内周期中的作用以及解析其对丝腺核内周期的调控机制,本研究通过构建BmGem1干涉和过表达转基因载体,利用家蚕转基因技术创制家蚕转基因品系素材,观察转基因品系蚕体和丝腺组织表型特征,分析转基因品系丝腺细胞DNA含量变化和DNA重复复制变化情况,并利用转录组学研究方法分析转基因品系丝腺差异基因,筛选出可能参与丝腺细胞核内周期调控的关键基因。主要研究结果如下:1、BmGeminin1转基因品系的创制与鉴定利用丝腺特异性启动子Ser1Promoter和Ser1pA构建BmGem1干涉和过表达转基因载体,通过显微注射等转基因技术,获得在丝腺组织中特异性干涉或过表达BmGeminin1的BmGem1-RNAi和BmGem1-OE两种转基因品系。进一步对插入位点进行验证和BmGem1表达水平检测,结果显示BmGem1-RNAi品系中BmGeminin1-RNAi片段单拷贝插入13号染色体nscaf1898上,BmGem1表达水平显着下调;BmGem1-OE品系中BmGeminin1片段单拷贝插入19号染色体nscaf2204上,BmGem1表达水平显着上调。2、转基因品系表型观察及分析通过观察BmGem1-RNAi和BmGem1-OE的蚕体表型,统计分析发现BmGem1-RNAi品系蚕体体长增长、体重增加,BmGem1-OE品系蚕体体长变短、体重减轻。进一步解剖蚕体,统计分析丝腺表型,结果显示BmGem1-RNAi品系蚕的丝腺增大,而BmGem1-OE品系蚕的丝腺减小。为了解析两品系间蚕体及丝腺的表型差异,对丝腺组织进行冷冻切片和免疫组化DAPI染色,统计分析结果表明BmGem1-RNAi品系蚕的丝腺细胞DNA含量减少,而BmGem1-OE品系蚕的丝腺细胞DNA含量增加。对两种品系的丝腺进行体外Brd U标记,统计分析丝腺细胞DNA的复制情况,结果显示BmGem1-RNAi品系中DNA重复复制得到增强,而BmGem1-OE品系中DNA的重复复制减弱。以上结果暗示,BmGem1能够调控丝腺细胞核内复制,影响DNA重复复制,引起DNA含量的变化,导致丝腺组织发生变化,进而影响蚕体表型。3、转基因品系的转录组差异分析为了探究BmGeminin1参与调控家蚕丝腺细胞核内周期的分子机制,本研究分析BmGem1-RNAi、BmGem1-OE和Dazao叁个品系的丝腺组织转录组。结果显示,相较于Dazao,BmGem1-RNAi品系中获得差异基因25个,均发生上调;在BmGem1-OE品系中获得差异基因26个,其中16个上调基因,10个下调基因。经过GO聚类注释,这些差异基因主要聚为分子组分和执行分子功能。KEGG pathway分析发现BmGem1-RNAi品系中差异基因主要参与内质网合成途径,BmGem1-OE品系中差异基因主要参与氧化磷酸化途径。进一步分析差异倍数较大的基因,发现3个参与能量代谢的差异基因:BGIBMGA006011(NADH dehydrogenase)和BGIBMGA006013(flavoprotein)和BGIBMGA009987(NADH dehydrogenase ubiquinone)。这些参与能量合成过程电子传递链中酶的编码基因可能影响电子传递链中电子传递,影响其DNA合成时所需能量正常供应,因而导致DNA重复复制异常。同时,筛选获得2个转录因子:BGIBMGA009027(Sp3)和BGIBMGA008965(bHLH)。Sp3基因在转录水平调控β-catenin基因的表达能够影响Wnt/β-catenin信号通路,推测其可能参与丝腺细胞核内周期调控。(本文来源于《西南大学》期刊2017-05-18）
郭亚新[6]（2017）在《家蚕丝腺转录因子SGF1核定位的调控机制研究》一文中研究指出家蚕(Bombyx mori)因其丝腺能够合成蚕丝而成为重要的经济昆虫,也作为鳞翅目昆虫的典型代表而成为变态和发育生物学研究的模式昆虫。后部丝腺(PSG)负责分泌合成丝素蛋白,而丝素蛋白是蚕丝蛋白的主效成分,直接决定着蚕丝蛋白的质量和产量。对家蚕丝素蛋白合成调控机制的阐明,将为今后蚕业分子育种提供重要的理论参考。家蚕丝腺转录因子SGF1(Silk Gland Factor 1)属于FOXA转录因子家族,是家蚕中首个被报道参与调控丝素蛋白转录的重要因子。合作实验室前期研究发现,Ras1cA转基因家蚕后部丝腺中SGF1肽段(EQEAAS*PTSALQR)的磷酸化水平升高,推测磷酸化升高的SGF1与转基因家蚕蚕丝产量升高相关,而SGF1磷酸化水平变化如何影响其对丝素蛋白相关基因的转录调控,且在该过程中如何受到Ras1下游Raf/MAPK或PI3K/AKT信号通路的调控,还有待探究。本研究运用生物信息软件对家蚕SGF1基因进行分析,并对SGF1肽段(EQEAAS*PTSALQR)的位点和调控的激酶进行预测;对制备的SGF1全长和磷酸化抗体进行体外验证和体内的PSG发育表达谱分析;运用Western blot和免疫荧光染色方法在体内初步明确SGF1的核定位与其调控丝素蛋白基因的功能呈正相关;利用Raf/MAPK或PI3K/AKT信号通路抑制剂对虫体进行处理以明确哪条信号通路对SGF1核定位起到主要作用;最终在家蚕和哺乳动物细胞系中进一步研究了 Raf/MAPK或PI3K/AKT抑制剂对SGF1和SGF1同源基因FoxA1核定位的影响是否通过磷酸化调控的方式实现。主要内容和结果如下:1.全长和磷酸化SGF1抗体的验证及SGF1在家蚕后部丝腺中的表达谱分析根据已知的SGF1全长和磷酸化肽段序列信息,制备全长和磷酸化抗体。构建pIEx4-SGF1-V5和pIEx4-SGF1s91A-V5两种质粒,在家蚕BmN细胞系中转染并进行Western Blot验证。随后,对家蚕后部丝腺SGF1基因时空表达模式进行分析,发现从4龄第4天(4L4D)开始一直到5龄第3天(5L3D),SGF1的转录水平逐渐增加,随后开始逐渐降低,对家蚕后部丝腺SGF1蛋白表达模式进行分析,发现从4龄第4天(4L4D)开始一直到5龄第7天(5L7D),其蛋白表达水平逐渐增加,而从5L7D开始,其蛋白表达水平迅速下降。2.家蚕体内SGF1的核定位与其丝素蛋白表达调控的相关性分析利用免疫荧光染色方法对SGF1在家蚕后部丝腺不同发育阶段的定位进行检测,结果表明在家蚕摄食期,SGF1普遍存在核定位现象。即在预蛹1天(PP1)之前SGF1 一直位于细胞核内,而在预蛹2天(PP2)时SGF1位于细胞核外,因此从PP1到PP2的过程中SGF1核定位发生改变,即由原来SGF1聚集在核内变化为弥散在核外。进一步实验以确证SGF1出核的时间窗口,发现其具体出核时间为上簇36h(W36h)。利用免疫荧光染色方法和Western Blot比较W36h时期Ras1CA转基因家蚕和野生型家蚕中SGF1定位和表达,发现与野生型家蚕相比,转基因家蚕的SGF1依旧定位在细胞核中且蛋白表达量较高。3.体内研究Raf/MAPK或PI3K/AKT通路对SGF1核定位的影响为分析Ras下游Raf/MAPK或PI3K/AKT通路如何影响SGF1的表达和定位。本研究采用Raf/MAPK抑制剂为PLX和PD60,PI3K/AKT/TORC1的抑制剂为Wort、Rapa和LY294。在家蚕虫体水平进行抑制剂处理,经免疫组织化学染色实验和Western Blot实验结果表明,处理后的SGF1表达量减少并且不在核内,因此说明这两种信号通路参与调控其核定位过程。4.体外研究Raf/MAPK或PI3K/AKT通路对SGF1核定位的影响在BrnN细胞中通过抑制剂处理和点突变实验进一步验证Raf/MAPK或PI3K/AKT通路通过调控SGF1 Ser91位点影响其核定位功能。为明晰该调控机制是否存在进化上的保守性,构建SGF1的同源基因FoxA1的野生型和点突变载体,利用免疫组织化学染色实验和Western Blot研究FoxA1的可能磷酸化位点以及所受信号通路调控,结果发现FoxA1磷酸化位点与核定位无关,但其核定位功能受Raf/MAPK信号通路调控。综上所述,家蚕后部丝腺中的SGF1核定位受到Raf/MAPK和PI3K/AKT/TORC1信号通路的调控,且与SGF1对丝素蛋白合成调控正相关。(本文来源于《华东师范大学》期刊2017-05-01）
邢瑞,张允虎,陈学东,李凯乐,司马杨虎[7]（2016）在《氨基酸修饰提高了纳米量子点对家蚕丝腺的靶向转运效率》一文中研究指出纳米量子点(quantum dots,QDs)在生物成像应用和靶向给药等方面呈现出巨大的发展潜力,但组织靶向效率有待提高。本文中,我们根据丝腺组织的氨基酸使用偏好性,将丝蛋白质中含量最丰富的甘氨酸或丙氨酸连接CdTe QDs,显着提高了QDs在无脊椎模型动物家蚕体内的组织靶向转移效率和生物安全性。经口暴露QDs530-Ala or QDs530-Gly后24h,进入循环系统的效率分别比QDs530提高了2.6±0.31倍和1.5±0.29倍。进一步进入靶标组织丝腺,一种蛋白质快速合成和外分泌组织的量,分别提高了7.8±0.89倍和2.88±0.22倍;而进入非靶标组织脂肪体,一种功能类似人类肝脏的量,分别降低了(68.4±4.35)%和(46.7±9.05)%。在组织中QDs530-Ala比QDs530-Gly的纳米颗粒结构完整性更好。背脉管暴露QDs530-Ala,其在循环系统存留时间比QDs530延长,而进入非靶标循环血细胞的速度显着降低。同时,QDs530-Ala有效降低了组织中QDs诱发的ROS量,显着降低了Cd Te QDs对血细胞和生物体的毒性。(本文来源于《第十二届家（柞）蚕遗传育种暨良种繁育学术研讨会论文集（摘要汇编）》期刊2016-07-01）
王永峰,陈学东,王欢,王玉龙,吴成家[8]（2016）在《依赖caspase信号途径的家蚕丝腺退化延迟发育模型中30K蛋白质的合成变化》一文中研究指出家蚕丝腺是高度特化的专一合成丝蛋白的器官。幼虫-蛹变态期的退化丝腺细胞中,出现了大量合成30K蛋白的功能转换。本文使用了一种家蚕后部丝腺发育突变体模型,比较其丝腺退化过程中的PCD调控信号及其30K蛋白质合成的变化。结果显示,突变体在幼虫-蛹变态过程中,20-羟基蜕皮酮引发的PCD启动提前,但PCD进程缓慢,导致整个丝腺退化过程较野生型延长了约1倍。突变体丝腺细胞中Dronc调控的依赖细胞凋亡蛋白酶的通路信号显着减弱,而Atg家族调控的PCD启动信号未推迟或减弱,PCD相关的赖氨酸甲基化、乙酰化和琥珀酰化,以及酪氨酸磷酸化修饰也发生了很大变化。突变体退化过程中,即使在未检测到caspase蛋白的PP1期丝腺细胞中,也一直在高效合成30K蛋白质。家蚕丝腺的退化是一种自噬和凋亡可能都参与的PCD过程,退化进程受到依赖细胞凋亡蛋白酶的信号通路调控,伴随丝腺退化进程的30K合成可能不完全依赖于caspase信号。(本文来源于《第十二届家（柞）蚕遗传育种暨良种繁育学术研讨会论文集（摘要汇编）》期刊2016-07-01）
张薇薇[9]（2016）在《家蚕丝腺几丁质结合蛋白的鉴定及表皮蛋白BmCPAP3的功能初探》一文中研究指出家蚕(Bombyx mori)作为鳞翅目昆虫的模式生物,因其能够吐丝结茧,所以具有非常重要的经济价值。丝腺是家蚕唯一的吐丝器官,根据其结构和功能分为前部丝腺、中部丝腺、后部丝腺,后部丝腺分泌丝素蛋白,中部丝腺分泌丝胶蛋白,前部丝腺不分泌蛋白。从丝腺横切面来看,丝腺细胞内侧有一层内膜结构,这层结构主要由几丁质和蛋白质构成,在前部丝腺较厚,中部丝腺和后部丝腺较薄。内膜上面有孔道,细胞分泌的蛋白通过孔道进入丝腺腔内,丝素蛋白由后部丝腺分泌往前运输到中部丝腺,丝胶蛋白裹在丝素蛋白的外侧一起运输通过前部丝腺而分泌出丝腺转变为丝纤维。丝蛋白在向前部丝腺的运输的过程中,丝腺内膜能够为丝蛋白的构象转变提供巨大的剪切力,同时保护丝腺细胞不受到剪切力的破坏。目前的研究发现丝腺内膜的主要组成成分是几丁质和蛋白质,但是关于其中蛋白质的成分以及蛋白质与几丁质相互作用的研究很少。有研究者分别通过转录组学和蛋白质组学技术在前部丝腺鉴定到了53个和33个表皮蛋白,但作者并没有验证这些蛋白质能否与几丁质结合,和中部丝腺以及后部丝腺相比,前部丝腺内膜的蛋白质组分有什么不同之处呢?家蚕表皮和围食膜也是典型的由几丁质和蛋白共同作用形成的膜结构,它们与前部丝腺的内膜结构有什么差异?为了阐明这些问题,本研究首先通过扫描电镜和免疫荧光技术对丝腺前、中、后各个区段的内膜结构进行了观察;利用几丁质亲和层析和LC-MS/MS技术对丝腺几丁质结合蛋白进行了提取和鉴定,并与表皮和围食膜的几丁质结合蛋白进行对比,揭示了丝腺内膜的特殊之处;根据质谱结果分析选择了CPAP家族的表皮蛋白BmCPAP3进行了深入的研究:进行生物信息分析,克隆表达,并制备了多克隆抗体,对其进行了组织和时期表达特征分析,测定了其与几丁质的结合方式。主要研究结果如下:1.家蚕丝腺内膜结构的观察我们首先利用扫描电镜技术对家蚕五龄第5天丝腺的五个区段(前部丝腺、中部丝腺前区、中部丝腺中区、中部丝腺后区、后部丝腺)进行了观察,在前部丝腺的细胞层内侧能看到一层致密的结构,并且由前部丝腺的前端到后端这层结构越来越薄,在中部丝腺和后部丝腺看不到这层结构。随后,通过免疫荧光的技术对丝腺的几丁质进行染色,同样发现前部丝腺的内膜结构比较厚,位于细胞层内侧,而在中部丝腺和后部丝腺也能看到在细胞层内侧有很薄的几丁质层。2.家蚕不同丝腺几丁质结合蛋白的提取、鉴定通过几丁质亲和层析的技术对不同区段的丝腺的几丁质结合蛋白进行了提取,并利用lc-ms/ms技术对这些蛋白进行了鉴定。结果显示,在家蚕丝腺中能与几丁质结合的蛋白主要为表皮蛋白,还包括一些酶类、未知功能蛋白等。表皮蛋白主要包括cpr家族、cpap家族、cph家族、cpg家族,其中cpr家族的表皮蛋白在数量和结合丰度上都最高,其次是cpap家族。从丝腺的不同区段来看,前部丝腺几丁质结合蛋白的相对丰度相比于中部丝腺和后部丝腺要高很多。从不同家族的表皮蛋白来看,r&r-2结构域和cpap家族的表皮蛋白在前部丝腺丰度比较高,在中部丝腺和后部丝腺很低,而r&r-1结构域的表皮蛋白在中部丝腺较高,在前部丝腺中很低。通过将丝腺的几丁质结合组分与表皮、围食膜的对比发现,丝腺几丁质结合蛋白的种类与表皮更为相似,而与围食膜的差异很大。有研究发现,r&r-2结构域的表皮蛋白参与了硬表皮的形成,r&r-1结构域的表皮蛋白参与了软表皮的形成,而cpap家族的表皮蛋白与r&r-2结构域的表皮蛋白的定位情况高度一致,因此,我们推测前部丝腺腔内的r&r-2和cpap家族的表皮蛋白通过与几丁质结合形成了前部丝腺的内膜,赋予了其较高的硬度,为丝蛋白构象的转变提供了剪切力,也为前部丝腺的细胞提供了有效的保护。3.bmcpap3的原核表达与纯化、表达特征分析及与几丁质结合方式探究通过对bmcpap3基因进行生物信息学分析,发现其具有信号肽,分子量为27kda,等电点为4.82,由叁个相同的chtbd2结构域组成。根据bmcpap3的序列设计引物进行克隆,将片段连接到pet28a载体上构建原核表达载体,将载体转入表达菌株transetta中进行原核表达,获得了有活性的bmcpap3重组蛋白,经过质谱鉴定是目的蛋白后,制备了多克隆抗体。利用rt-pcr和westernblotting的方法对BmCPAP3的组织和时期表达谱进行了检测,发现转录水平和蛋白水平的结果一致,从各组织表达特征来看,BmCPAP3在丝腺中的表达量比在头和表皮中的表达量低;从不同时期的丝腺的表达特征看,在眠期和起蚕期表达量最高,在其余时期的表达量均比较低;从不同时期的表皮表达特征来看,随着家蚕幼虫的发育BmCPAP3的表达量呈逐渐下降的趋势。为了探索CPAP家族的表皮蛋白是如何与几丁质进行结合的,我们对BmCPAP3蛋白进行分析,其由3个相同的结构域构成,我们分别对其结构域进行原核表达,表达出了有活性的结构域3、结构域1-2、结构域2-3,并将原核表达的结构域进行几丁质亲和层析验证。结果显示,结构域3、结构域1-2、结构域2-3均能够与几丁质进行结合,但是结合能力有差异,两个结构域比单个结构域结合几丁质的结合能力要强很多。(本文来源于《西南大学》期刊2016-05-23）
王叶菁,刘莉娜,高春雁,李珍珍,常怀普[10]（2016）在《家蚕丝腺因子SGF-1的基因克隆及序列结构和表达特征与亚细胞定位》一文中研究指出Fox类转录因子在细胞生长、增殖、分化和胚胎发育等过程中发挥重要功能,SGF-1是家蚕丝腺细胞转录因子,属于Fox类转录因子家族。家蚕SGF-1(BGIBMGA005101-TA)基因位于第25号染色体nscaf2823:112743~113792(+strand),含有1个外显子,CDS全长1 050 bp,编码349个氨基酸。家蚕品种大造5龄第3天幼虫的基因芯片表达谱显示,SGF-1基因在大多数组织中有表达,在丝腺中高量表达,其中在前部和中部丝腺的表达量略高于后部丝腺,在雄蚕中的表达量略高于雌蚕。氨基酸组成分析显示,SGF-1蛋白富含脯氨酸、丝氨酸、丙氨酸和亮氨酸,且多数为亲水性氨基酸。序列结构分析表明,SGF-1包含典型的Forkhead结构域,其两端分别为Forkhead_N末端结构域和HNF3_C末端结构域,其中大多数氨基酸残基形成了无规则卷曲结构,α-螺旋与β-折迭结构分别约占18.0%和0.6%。从家蚕后部丝腺克隆了SGF-1基因,并构建麦芽糖结合蛋白标签融合表达载体,表达并纯化了重组SGF-1蛋白。通过RT-PCR与Western blotting检测分别从基因转录水平和蛋白质表达水平上证实,SGF-1在家蚕5龄第3天幼虫丝腺中高量表达。亚细胞定位实验显示SGF-1定位于细胞核中。这些结果为深入研究SGF-1的结构和功能提供了有益的基础信息。(本文来源于《蚕业科学》期刊2016年02期）
家蚕丝腺论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
家蚕(Bombyx mori)是重要的泌丝经济昆虫。丝腺是家蚕幼虫特有的泌丝器官,丝蛋白大量合成的前提是丝腺细胞进行核内周期(endocycle)。核内周期,也称为核内复制周期,是正常有丝分裂细胞周期的变异形式,即细胞只进行DNA复制而不发生胞质分裂,从而形成了多倍体细胞。家蚕丝腺细胞仅在胚胎期发生约10次有丝分裂,形成了包含前部丝腺、中部丝腺和后部丝腺约1080个细胞。自此之后,丝腺细胞进入核内周期,只进行DNA的合成和细胞体积的增大。在幼虫期,丝腺细胞经历持续的17~19轮核内周期,使得DNA含量达到正常二倍体细胞的约40万倍,这为吐丝期丝蛋白的大规模合成奠定了遗传基础。果蝇和小鼠中核内周期的研究表明,核内周期的运转是由细胞周期依赖性激酶(cyclin-dependent kinase,CDK)活性的周期性振荡驱动的。细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(cyclin-dependent kinase inhibitors,CKIs)是CDK的主要负调节因子,它能与细胞周期蛋白(cyclin)和CDK结合并抑制CDK的激酶活性。与自然界其它进行核内周期的细胞相比,家蚕丝腺细胞发生核内复制的时间跨度更长,DNA复制效率更高效,是研究核内周期的理想材料,阐明丝腺细胞核内周期的调控机制,可为完善家蚕细胞周期调控机制提供重要线索,也可为丝腺遗传改良提供重要的理论依据。本研究对家蚕CKI进行了克隆和鉴定,并分析了该基因参与调控丝腺核内周期的作用机制,为家蚕丝腺细胞核内周期机制的解析和家蚕丝腺遗传改良提供了有利依据。主要研究结果和结论如下:1.BmCKI基因的鉴定及特征分析家蚕基因组中仅存在一个Cip/Kip家族同源基因,将该基因命名为BmCKI。BmCKI有两个剪切体,分别命名为BmCKI-L和BmCKI-S。这两个剪切体具有不同的5’非编码区(5’untranslated region,5’UTR),BmCKI-S从第二个外显子处的起始密码子进行翻译。BmCKI-L的编码区(coding sequence,CDS)全长654 bp,编码217个氨基酸(amino acid,aa),而BmCKI-S的CDS长度为579 bp,编码192个氨基酸,两者的CDS仅在5’端相差75 bp。序列分析显示,BmCKI-L和BmCKI-S存在Cip/Kip家族保守的结构域,该结构域包含cyclin结合位点和CDK结合位点。系统发生树分析显示,家蚕BmCKI蛋白与果蝇的同源蛋白聚在一支,两者同源性最高。免疫荧光分析BmCKI-L和BmCKI-S的亚细胞定位,结果显示两者均定位于细胞核。为了鉴定BmCKI的核定位信号,我们构建了一系列BmCKI-L的截短突变,并通过免疫荧光分析其定位情况。结果表明,181-210 aa区域是BmCKI-L核定位序列所在之处,该区域存在一个非典型的二元核定位信号,该核定位信号前后由两簇基本氨基酸组成,中间由16 aa连接,连接区域富含弱碱性的组氨酸。用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)分析了BmCKI-L和BmCKI-S的组织表达模式,发现BmCKI-L在表皮和卵巢的表达量较高,而在精巢的表达量较低;BmCKI-S在中肠的表达量比较高,而在丝腺的表达量最低,表明BmCKI-L和BmCKI-S存在不同的表达模式。2.BmCKI对家蚕细胞周期的调控为了在细胞水平上鉴定BmCKI的功能,我们首先在BmN-SWU1细胞系中,分别进行了过表达BmCKI-L和BmCKI-S的实验研究。过表达BmCKI-L和BmCKI-S的实验组中,G1期细胞显着增加,S期和G2期细胞显着减少,表明过表达BmCKI-L和BmCKI-S导致细胞周期阻滞在G1期;在过表达BmCKI-L和BmCKI-S的BmN-SWU1细胞中BrdU标记率明显下降,表明过表达BmCKI-L和BmCKI-S抑制DNA复制;过表达BmCKI-L和BmCKI-S的BmN-SWU1细胞增殖活性显着下降,表明过表达BmCKI-L和BmCKI-S抑制细胞增殖。同时,在BmN-SWU1细胞系中,分别进行了干涉BmCKI-L和BmCKI-S的实验研究。干涉BmCKI-L和BmCKI-S的实验组中,G2/M期细胞显着增加,S期和G1期细胞显着减少,表明干涉BmCKI-L和BmCKI-S使细胞积累于G2/M期;在干涉BmCKI-L和BmCKI-S的细胞中BrdU标记率显着上升,表明干涉BmCKI-L和BmCKI-S促进DNA复制;干涉BmCKI-L和BmCKI-S的BmN-SWU1细胞增殖活性显着上升,表明干涉BmCKI-L和BmCKI-S促进细胞增殖。综上表明,BmCKI-L和BmCKI-S参与细胞周期调控。为了探究BmCKI调控细胞周期的机制,我们利用qRT-PCR分别检测了过表达和干涉BmCKI后各周期调控因子的相对表达量。结果显示,过表达BmCKI-L和BmCKI-S后,周期蛋白cyclin A、cyclin B、cyclin D和cyclin E以及周期蛋白依赖性激酶CDK2和CDK4表达量显着下调,说明过表达BmCKI-L和BmCKI-S抑制G1和S期各周期调控因子的表达;干涉BmCKI-L和BmCKI-S后,周期蛋白cyclin A和cyclin B以及周期蛋白依赖性激酶CDK1表达量显着上调,说明干涉BmCKI-L和BmCKI-S促进G2和M期周期调控因子的表达。3.BmCKI对家蚕个体生长发育的调控为了在个体水平上鉴定BmCKI的功能,我们利用家蚕转基因技术,创制了全蚕过表达BmCKI-L的转基因品系,命名为BmCKI-L-OE。对BmCKI-L-OE品系G1代的蚕卵进行观察,发现约2/3的胚胎致死,1/3的胚胎能成功孵化。相较于同龄期正常大造,BmCKI-L-OE幼虫体型小且存在不同程度的发育迟缓,此外在饲养过程中BmCKI-L-OE幼虫逐渐死亡。我们对BmCKI-L-OE品系在胚胎期和幼虫期的存活率进行统计分析,结果显示在家蚕中过表达BmCKI-L会引起胚胎及幼虫致死。解剖BmCKI-L-OE品系5龄幼虫,发现BmCKI-L-OE品系幼虫多个组织的发育存在异常,比如:马氏管萎缩;气管分支显着减少且长度严重缩短;丝腺显着变小;脂肪体很少。以上结果表明,BmCKI参与家蚕生长发育的调控。4.BmCKI对家蚕丝腺核内周期的调控为了鉴定BmCKI是否参与丝腺细胞核内周期调控,我们利用家蚕转基因技术,创制了丝腺组织特异性过表达BmCKI-L的转基因品系,命名为Ser1~P-BmCKI-L-OE。表型分析结果显示Ser1~P-BmCKI-L-OE幼虫相比于正常大造体型明显要小,体重明显要轻;以及其丝腺的大小、长度、直径和重量都要明显小于大造幼虫的,表明在家蚕丝腺组织中过表达BmCKI-L会抑制丝腺的生长发育。经济性状分析结果显示,Ser1~P-BmCKI-L-OE品系的全茧量、蛹重、茧层量相比于正常大造都显着减轻;同时,Ser1~P-BmCKI-L-OE品系的茧层率相比于正常大造显着减小。利用冷冻切片和DAPI染色检测丝腺细胞DNA含量的变化,结果发现,Ser1~P-BmCKI-L-OE品系前部、中部和后部丝腺的DAPI标记量均显着低于大造组,说明Ser1~P-BmCKI-L-OE品系DNA含量比大造组少;对Ser1~P-BmCKI-L-OE品系的丝腺体外进行BrdU标记以测定丝腺DNA复制情况,结果显示,Ser1~P-BmCKI-L-OE品系前部、中部和后部丝腺BrdU标记率均低于大造组,说明Ser1~P-BmCKI-L-OE品系丝腺DNA复制相较于大造品系减弱。以上结果表明,在丝腺组织中特异性过表达BmCKI-L抑制丝腺细胞的核内周期。5.BmCKI相互作用蛋白的鉴定及作用机制研究为了鉴定BmCKI的作用机制,我们首先通过酵母双杂交技术,以BmCKI-L蛋白为诱饵筛选到3个与BmCKI-L可能存在相互作用的蛋白,分别是BmPCNA、BmRACK1和BmSTMN。通过酵母双杂交回转实验,免疫荧光共定位以及免疫共沉淀技术证实这3个蛋白与BmCKI-L都具有相互作用。PCNA是DNA聚合酶的辅助因子,在DNA复制和修复中起到重要作用。RACK1是一个具有7个色氨酸-天冬氨酸重复序列的支架蛋白,在细胞不同区域分别结合各种蛋白,从而在许多基本生理过程中都发挥重要的作用。STMN是一种微管不稳定蛋白,存在于胞质中,与微管解聚有关。qRT-PCR分析这3个基因的组织表达谱,结果显示BmPCNA基因在丝腺中特异性高表达,BmSTMN基因在丝腺特异性中低表达,而BmRACK1基因在各个组织中均有较高的表达。流式检测BmPCNA过表达和干涉对细胞周期的影响,结果显示过表达BmPCNA后,S期细胞增加,而干涉BmPCNA后,S期细胞减少。推测,过表达BmPCNA抑制DNA的复制从而导致S期细胞减少;反之,干涉BmPCNA促进DNA的复制从而引起S期细胞增加。qRT-PCR结果表明,BmCKI-L处于BmPCNA的上游,并抑制BmPCNA的表达。推测,BmCKI-L可能通过抑制BmPCNA,调控DNA复制,从而调控细胞周期。流式结果显示过表达BmRACK1,G1期细胞增加,G2/M期细胞减少;而干涉BmRACK1,G2/M期细胞增加,G1期细胞减少。qRT-PCR结果表明,BmRACK1可能处于BmCKI-L的上游,并促进BmCKI-L的表达。推测,过表达BmRACK1,引起BmCKI-L表达量上升,从而导致G1期细胞增多,G2/M期细胞减少;反之干涉BmRACK1,降低了BmCKI-L的表达量,使得G2/M期细胞增加,G1期细胞减少。流式结果显示,无论过表达还是干涉BmSTMN都会引起G2/M期细胞增加,G1期细胞减少。推测,持续过表达或干涉BmSTMN,都会导致纺锤体无法顺利组装,从而将细胞周期阻滞在M期。qRT-PCR结果显示,BmCKI-L处于BmSTMN的上游,并抑制BmSTMN的表达。推测,BmCKI-L可通过抑制BmSTMN,调控细胞骨架网络,从而调控细胞周期。综上,我们构建了可能的BmCKI调控细胞周期网络。BmCKI可通过多种途径参与正常有丝分裂周期和丝腺核内周期的调控:BmCKI与cyclin-CDK复合物结合并抑制复合物的活性,参与细胞周期调控;BmCKI通过结合并抑制BmPCNA,调控DNA复制,参与细胞周期调控;BmCKI通过结合并抑制BmSTMN,调控细胞骨架动力学,参与细胞周期调控;此外,BmRACK1影响BmCKI的表达。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
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