导读:本文包含了非依赖途径论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:LPS,脓毒血症,TLR4,Kupffer细胞
非依赖途径论文文献综述
冯盼盼,朱韦,陈楠,李培志,何堃[1]（2018）在《组织蛋白酶B通过TLR4非依赖途径调控小鼠肝脏Kupffer细胞内炎症的激活》一文中研究指出目的研究组织蛋白酶B在LPS引发小鼠脓毒血症中的作用。方法动物生存实验观察:采用腹腔注射致死剂量LPS(54 mg/kg)法,WT小鼠随机分为3组,TLR4-/-小鼠随机分为3组,两种小鼠的各组均依次分为生理盐水对照组、致死剂量组(LPS)及组织蛋白酶B抑制剂—CA-074预处理组(CA-074+LPS),观察小鼠生存时间及生存率;脓毒血症实验采:用大剂量LPS(20 mg/kg)腹腔注射法,其余处理及分组同前,各组小鼠造模结束后:(1)肝脏HE染色检测肝脏病理变化;(2)检测肝脏Kupffer细胞胞质内组织蛋白酶B的蛋白水平及活性;(3)检测血清中IL-1α、IL-1β、TNF-α、IL-18等炎症因子水平。结果经致死量LPS打击后,TLR4-/-小鼠生存时间延长至84 h,明显长于WT小鼠,但仍无法完全抵抗致死量LPS的打击,CA-074预处理可分别延长WT和TLR4-/-小鼠的生存时间至60和132 h。大剂量LPS刺激后,WT及TLR4-/-小鼠肝细胞变性坏死明显,Kupffer细胞胞质中组织蛋白酶B蛋白水平无明显变化,但其在胞质的活性显着增加(P?0.05);血清中IL-1α、IL-1β、TNF-α以及IL-18等炎症因子水平增高(P?0.05);各CA-074预处理组,肝细胞坏死减轻,Kupffer细胞中组织蛋白酶B蛋白水平无明显变化,胞质内活性明显降低(P?0.05);血清中IL-1α、IL-1β、TNF-α以及IL-18等炎症因子水平明显低于单纯大剂量LPS刺激组(P?0.05)。结论在大剂量LPS诱导的脓毒血症中,存在非依赖TLR4受体的炎症通路的激活过程,组织蛋白酶B在这个过程中具有重要作用。(本文来源于《南方医科大学学报》期刊2018年12期）
许艳芳,方宇露,陈慧[2]（2018）在《顺铂通过TNFα依赖和非依赖途径诱导细胞坏死的机制》一文中研究指出目的:顺铂是广泛应用于治疗实体瘤的化疗药物,其最重要的副作用是其对肾小管的直接毒性而导致的肾损伤,但其如何诱导细胞死亡的作用机制不明,本研究拟探讨顺铂诱导细胞死亡的机制。方法:采用cas9基因敲除技术,获得RIP1/RIP3/MLKL/Cyclophilin-D基因敲除的不同细胞株;从基因敲除小鼠中原代分离肾小管上皮细胞、和骨髓源性的巨噬细胞;观察顺铂干预后对细胞死亡以及TNFα分泌的影响;观察TNFα中和抗体是否介导顺铂诱导的程序性坏死小体RIP1/RIP3/MLKL的产生。(本文来源于《中国中西医结合学会肾脏疾病专业委员会2018年学术年会论文摘要汇编》期刊2018-10-11）
王国慧,谷永红,朱晒红,付华[3]（2018）在《TGF-β1通过SMAD非依赖途径诱导胃癌细胞fascin1基因表达的研究》一文中研究指出目的转化生长因子-β1(TGF-β1)对转移相关基因fascin1表达的作用及机制的研究。方法以胃癌细胞系MKN45为研究对象,采用蛋白质印迹法检测TGF-β1(10 ng/ml)不同作用时间fascin1表达变化。瞬时转染SMAD2和SMAD4的干扰小RNA(siRNA),检测SMAD依赖信号通路在TGF-β1诱导fascin1表达中的作用。应用ERK、JNK和p38信号通路的特异性阻断药,检测SMAD非依赖途径是否参与TGF-β1诱导fascin1表达。结果TGF-β1(10 ng/ml)作用MKN45细胞24、48 h后,fascin1表达水平明显高于未处理前(0 h),差异有统计学意义(P﹤0.05)。RT-PCR和蛋白质印迹瞬时转染SMAD siRNA,SMAD2和SMAD4基因表达下调,而HK几乎不影响SMAD2和SMAD4基因表达。有效地抑制SMAD2和SMAD4表达后,TGF-β1处理对fascin1表达无明显影响。ERK和JNK信号通路的特异性阻断药PD98095和SP600125处理MKN45细胞后,TGF-β1诱导fascin1表达的作用明显降低;而p38信号通路的特异性阻断药SB203580作用前后,TGF-β1对fascin1表达无明显影响。结论TGF-β1可以通过ERK和JNK信号通路调节转移相关基因fascin1的表达。(本文来源于《癌症进展》期刊2018年02期）
浦路桥[4]（2017）在《营养剥夺通过BNIP3诱导Caspase-3非依赖途径介导软骨终板干细胞凋亡研究》一文中研究指出一、研究背景椎间盘(Intervertebral disc,IVD)是人体重要的组织,由软骨终板,髓核及纤维环叁个部分组成。IVD随着年龄的增长会发生不同程度的退变,继发引起多种临床疾病如椎管狭窄、椎间盘突出和脊柱节段不稳等,给患者和社会造成极大的经济和心理负担。IVD退变是多种因素共同作用的结果,引起其发病的原因大致可分为遗传因素、年龄因素、营养及生物力学因素等。在成年人体内,IVD是一种无血管的结缔组织,其营养来源主要是依靠软骨终板和纤维环的渗透作用。相关研究证实,营养剥夺能够诱导软骨终板细胞凋亡,进而导致软骨终板退变,最终引起整个IVD退行性改变,并且在兔髓核细胞中,营养剥夺可通过上调BNIP3(Bcl-2/adenovirus E1B 19-k Da-interacting protein 3)的表达诱导细胞凋亡进而引起IVD退变。然而营养剥夺诱导软骨终板退变过程中的分子机制尚未阐明。因此,明确营养剥夺引起软骨终板退变过程的分子机制对于防治IVD退变有重要的科学意义和社会价值。二、研究目的通过模拟椎体血供及椎体外周微循环受损的环境,在体外建立营养剥夺的细胞培养模型,研究营养剥夺对软骨终板干细胞(cartilage endplate-derived stem cells,CESCs)的影响及BNIP3信号通路在其中的可能作用,从而进一步阐明IVD的退变机制。叁、研究方法在临床上获取8例退变的椎间盘软骨终板标本,从中分离提取终板的软骨细胞,用纤维连结蛋白(Fibronectin,FN)筛选获取CESCs,进行干细胞表面抗原标志物鉴定后扩大培养,选取第叁代的细胞进行实验,其中对照组在正常培养条件下(DMEMF12、5m M葡萄糖、21%O2、10%血清)培养,实验组在营养剥夺条件(DMEMF12、无糖、1%O2、无血清)分别培养24 h和48 h。细胞处理后,应用流式细胞仪对细胞凋亡率进行检测,实时荧光定量PCR和Western Blot分别检测BNIP3基因和蛋白表达水平的变化,免疫荧光染色检测BNIP3蛋白与CESCs线粒体的结合情况,JC-1染色法检测线粒体膜电位(mitochondrial transmembrane potential,MMP)的变化,Caspase-3活性检测试剂盒检测Caspase-3酶的活性。进一步使用BNIP3 si RNA沉默CESCs中BNIP3基因表达,转染24 h后将细胞分别在正常条件和营养剥夺条件下培养48 h,同时设置阴性干扰对照组(使用Scramble si RNA),再次对细胞凋亡率及BNIP3的表达情况进行检测。四、研究结果1.细胞鉴定结果:使用纤维链接蛋白筛选获取CESCs,并进行表面抗原标记物检测,其中CD90、CD105、CD73和CD44为阳性,而Neg CKT(包含有HLA-DR、CD19、CD34、CD11b和CD45)为阴性,结果说明:CESCs具备干细胞的特性。2.细胞凋亡率及BNIP3表达的检测结果:实验组CESCs的凋亡率(24 h:24.47%±0.97%,48 h:28.98%±0.47%)显着高于对照组(17.26%±1.84%,p<0.05);BNIP3基因及蛋白表达水平实验组显着高于对照组(p<0.05),结果说明:营养剥夺可上调BNIP3的表达,诱导CESCs的凋亡率增加。3.干扰BNIP3基因的表达后,再次检测细胞凋亡率及BNIP3表达情况:干扰BNIP3表达的实验组CESCs凋亡率(23.72%±1.21%)显着低于对照si RNA实验组(34.05%±1.43%,p<0.05);干扰组与对照si RNA组相比,BNIP3蛋白表达明显下调,结果说明:干扰BNIP3基因能够部分抑制由营养剥夺所导致的细胞凋亡。4.免疫荧光的结果:营养剥夺能够上调BNIP3蛋白的表达,并促进其与线粒体结合,导致线粒体膜电位下降。5.Caspase-3酶活性检测:组间的Caspase-3酶活性无统计学意义(p>0.05),结果说明:营养剥夺诱导细胞凋亡是通过Caspase-3非依赖性途径发挥作用。五、结论营养剥夺通过上调CESCs中BNIP3基因和蛋白的表达水平,促进BNIP3蛋白与线粒体结合导致MMP下降,最终通过Caspase-3非依赖性途径介导CESCs的凋亡。(本文来源于《第叁军医大学》期刊2017-05-01）
胡少宇,童国军,孟越,郝松,李威[5]（2016）在《甲状旁腺激素通过非依赖PLC的PKC途径抑制成骨细胞的凋亡》一文中研究指出目的观察甲状旁腺激素的非依赖PLC的PKC转导通路(PTH/non PLC/PKC)是否会对成骨细胞(MC3T3-E1)的凋亡以及细胞数量具有影响。方法培养MC3T3-E1细胞,以1.5×104密度接种到96孔板,然后置于培养箱培养3 d直到细胞达到汇合状态,随机分为5组:按100 nmol/L[Gly1,Arg19]h PTH(1-28);100 nmol/L[Gly1,Arg19]h PTH(1-34);100 nmol/L[Gly1,Arg19]h PTH(1-34)+1μmol/L Go6983,1μmol/L Go6983;空白对照组加入等体积的去离子水,分别刺激细胞1、24、48 h,然后使用细胞计数试剂盒(CCK-8)和Caspase-Glo®3/7试剂盒(caspase-3)检测细胞的细胞数量与凋亡。结果 CCK-8检测结果显示,[Gly1,Arg19]h PTH(1-34)组与[Gly1,Arg19]h PTH(1-34)+Go6983组相比,在1 h和24 h具有提高细胞数量的趋势,但结果并没有统计学差异,48 h[Gly1,Arg19]h PTH(1-34)组与[Gly1,Arg19]h PTH(1-28)组相比,可以明显提高细胞的数量(P<0.05)。进一步的研究发现在[Gly1,Arg19]h PTH(1-34)组添加抑制剂Go6983后,细胞数量增多的效应消失(P<0.05)。Caspase-3检测凋亡结果显示,[Gly1,Arg19]h PTH(1-34)组与[Gly1,Arg19]h PTH(1-34)+Go6983组相比,在1 h和24 h具有抑制细胞凋亡(细胞凋亡受到抑制),但是差异无统计学意义。48 h检测细胞凋亡显示,[Gly1,Arg19]h PTH(1-34)组与[Gly1,Arg19]h PTH(1-28)组相比,前者可以明显抑制细胞凋亡(P<0.05),给予PKC抑制剂Go6983后,其抑制凋亡现象消失。结论 PTH的non PLC/PKC信号转导通路可能在长时间(48 h)作用于MC3T3-E1细胞时,可抑制细胞凋亡,提高细胞的数量。(本文来源于《南方医科大学学报》期刊2016年06期）
恽喻喻[6]（2016）在《CD147通过非依赖p53途径促进卵巢癌细胞糖代谢重编程的机制研究》一文中研究指出能量代谢异常是肿瘤细胞的基本特征,在肿瘤发生与演进中发挥了关键作用。糖代谢重编程是肿瘤细胞能量代谢失调的主要方面,在生物合成与氧化还原反应中提供能量和物质前体,但肿瘤细胞这种低效供能方式的分子机制尚不明确。既往研究表明,CD147通过p53途径促进人肝癌细胞糖酵解与增殖。p53失活是人类恶性肿瘤细胞中的普遍现象,约60%的卵巢癌患者存在p53突变。然而,CD147能否通过非依赖p53途径促进卵巢癌细胞糖代谢重编程及其具体的分子机制尚不明确。本课题在既往研究基础上,借助p53缺失型卵巢癌细胞系,深入研究CD147参与卵巢癌细胞糖代谢重编程的生物学作用,系统分析CD147通过非依赖p53途径促进卵巢癌细胞有氧糖酵解的分子网络调控机制。这些研究可进一步加深对卵巢癌能量代谢异常的理解,也为CD147作为卵巢癌治疗靶点提供更为丰富的分子理论基础。本研究主要分为以下叁个部分第一部分:CD147通过非依赖p53途径促进卵巢癌细胞糖酵解的作用研究为阐明CD147在卵巢癌细胞糖代谢过程中的作用,我们构建了稳定干涉CD147的卵巢癌细胞系。我们发现无论是在p53野生型的A2780细胞中,还是在p53缺失型的SKOV3细胞中,干涉CD147的表达均会降低细胞糖摄取、糖酵解速率和乳酸排出,而氧消耗则有所升高。小动物PET/CT成像系统显示干涉CD147的表达会显着降低裸鼠移植瘤的18F-FDG摄取能力,且移植瘤的细胞增殖速度有所降低。总之,我们的实验结果表明CD147具有促进卵巢癌细胞糖酵解的作用,并有可能成为基于能量代谢失调的靶点,从而制定新的抗肿瘤策略。第二部分:CD147在卵巢癌细胞中调控FOXM1的机制研究为明确CD147促进卵巢癌细胞糖酵解的分子机制,我们使用shRNA技术在卵巢癌细胞A2780和SKOV3中干涉了CD147的表达。Western blot结果显示,在卵巢癌细胞A2780和SKOV3中下调CD147会明显降低CD147,pAKT、pSTAT3和FOXM1的表达。Real time PCR结果显示,在卵巢癌细胞A2780和SKOV3中下调CD147会明显降低FOXM1 mRNA的表达水平。另一方面,AKT抑制剂LY294002和STAT3抑制剂S3I-201在卵巢癌细胞中会显着降低过表达CD147对FOXM1的上调作用。激光共聚焦成像结果显示,CD147和CD44在卵巢癌细胞中共定位。通过免疫组织化学染色检测,我们发现CD147、pAKT、pSTAT3和FOXM1在卵巢癌组织中共表达。第叁部分:转录因子FOXM1促进卵巢癌细胞糖代谢重编程的机制研究我们首先筛选了转录因子FOXM1可能调控的糖酵解关键酶,在卵巢癌细胞中干涉FOXM1的表达后,发现GLUT1和HK2的表达水平也随之下降,且细胞糖酵解和增殖明显受到抑制。进一步研究发现,GLUT1和HK2的DNA启动子序列存在转录因子FOXM1的结合位点,FOXM1能在卵巢癌细胞中激活GLUT1和HK2的转录与表达。我们还发现FOXM1、GLUT1和HK2在卵巢癌组织中的表达水平远高于正常卵巢组织,且FOXM1在卵巢癌组织中的表达分别与GLUT1和HK2的表达正相关。(本文来源于《第四军医大学》期刊2016-05-01）
霍炳杰,常靓,刘羽,李梅,刘亚娴[7]（2016）在《不同煎煮时间银翘散含药血清对甲型流感病毒刺激巨噬细胞Toll样受体及其下游MyD88依赖和非依赖途径的影响》一文中研究指出目的探讨银翘散抗甲型流感病毒的最佳煎煮时间。方法将银翘散药粉分别制备成浓度为0.25(低)、0.50(中)、1.00 g/ml(高)的溶液,加热到100℃时开始计时,分别煎煮至3、6、12 min,4℃保存备用。55只SD大鼠随机分为正常对照组、流感病毒组、3 min组(高、中、低浓度)、6 min组(高、中、低浓度)、12 min组(高、中、低浓度)。3、6、12 min组大鼠给予相应浓度的银翘散溶液灌胃,正常对照组及流感病毒组给予等量生理盐水,每天2次,每次2 ml,共5天,腹主动脉取血制备含药血清。用甲型流感病毒鼠肺适应株FM1刺激小鼠巨噬细胞株Ana-1,同时给予不同煎煮时间下的银翘散含药血清进行干预,培养24 h后吸取上清,检测Toll样受体3、4型(TLR3、TLR4)mRNA和蛋白表达,及其下游髓样分化因子(My D88)依赖和非依赖途径相关因子(My D88、TRAF-6、TRIF、TRAM)mRNA的表达。结果与正常对照组比较,流感病毒组TLR3、TLR4、My D88、TRAF-6、TRAM、TRIF mRNA的表达水平均明显升高(P<0.05);经不同煎煮时间、不同浓度银翘散干预后,各治疗组细胞的TLR3、TLR4、My D88、TRAF-6、TRAM和TRIF mRNA均明显下降(P<0.05),尤以3 min组中、高浓度下降最为明显,较12 min组同浓度差异有统计学意义(P<0.05)。与流感病毒组比较,6 min组中浓度组对TLR3蛋白的表达有显着抑制作用(P<0.05),3 min组和6 min组各浓度均可降低TLR4蛋白含量(P<0.05)。与12 min组同浓度比较,3 min组高浓度和6 min组中、高浓度对TLR4蛋白的表达有显着抑制作用(P<0.05)。结论银翘散抗甲型流感病毒作用的最佳煎煮时间可能为煮沸后3~6 min。(本文来源于《中医杂志》期刊2016年07期）
冯晔囡,张幼怡,肖晗[8]（2015）在《二甲双胍通过AMPK依赖及非依赖途径抑制肾脏纤维化》一文中研究指出目的:明确二甲双胍是否通过腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)依赖的方式抑制单侧输尿管梗阻(UUO)诱导的肾间质纤维化。方法:采用WT及AMPKα2-/-小鼠,UUO手术制备肾间质纤维化模型。手术组术前3 d及术后7 d皮下注射二甲双胍0.2 g·kg-1·d-1。利用组化染色、肾功能检测、Western blot、ELISA等方法评价模型。结果:(1)WT小鼠,二甲双胍能够抑制(本文来源于《中国病理生理杂志》期刊2015年10期）
陈小娱[9]（2015）在《APJ受体羧基末端磷酸化位点对G蛋白非依赖信号途径的影响》一文中研究指出研究背景及目的G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors,GPCRs)是目前已知最大的细胞膜表面受体超家族,可将胞外的多种信号分子(如气味、光、多肽、脂质、激素等)传至细胞内部,从而调节和维持生物体的稳态。GPCRs在人体内广泛表达,其信号传导通路的失调与多种疾病的发生发展密切相关。目前,临床上超过50%的药物以GPCRs作为靶点。GPCRs与配体结合后激活并启动细胞内的信号传导途径。除了传统的G蛋白依赖的信号通路,活化的GPCRs与许多胞内其他蛋白结合增加了信号传导的多样性,这些蛋白包括G蛋白偶联受体激酶(G protein-coupled receptor kinases, GRKs)和p-抑制蛋白(P-arrestin)。在此过程中,配体的结合引起GPCRs发生磷酸化,随后胞内的β-arrestin被募集到GRKs磷酸化的受体。作为细胞内的信号衔接蛋白和支架蛋白,β-arrestin在GPCRs的脱敏、内吞、运输过程中发挥重要的作用,并以G蛋白非依赖的方式传导下游的信号瀑布。Apeli n是Tatemoto等利用反向药理学方法从牛胃分泌物中提取并纯化出的一种新的心血管活性肽,为孤儿G蛋白偶联受体—血管紧张素受体AT1相关的受体蛋白(putative receptor protein related to the angiotensin receptor AT1,APJ)的内源性配体。Apelin/APJ系统在体内广泛分布,参与机体多种生理功能的调节。Apelin/APJ系统有望成为心衰、高血压和糖尿病的治疗靶点。APJ受体的信号传导机制目前仍在研究之中。不同的刺激方式激活APJ受体后,G蛋白依赖的和G蛋白非依赖的信号途径在心肌肥厚的发病过程中发挥双重功能。与大多数GPCRs相似,APJ受体羧基末端结构域的磷酸化或棕榈酰化对受体的脱敏和内吞发挥重要作用。但是,APJ受体如何调节G蛋白依赖的或G蛋白非依赖的信号通路,目前并不清楚。APJ受体的羧基末端存在多个可能的磷酸化位点,其功能尚有待观察。本研究旨在阐明APJ羧基末端确切的磷酸化位点,观察这些位点对APJ受体的脱敏、内吞和G蛋白非依赖的信号途径的影响,进而为心血管系统药物的筛选提供新的实验依据和思路。研究方法1.细胞培养和转染：采用人胚胎肾细胞(HEK293)作为研究对象；脂质体Lipofectamine 2000为转染试剂转染细胞。2.质谱检测：提取APJ受体蛋白,通过烷基化和富集处理后,LC-MS/MS质谱分析APJ受体的磷酸化位点。3.点突变及真核表达载体的构建：重迭延伸PCR技术将APJ受体羧基末端335、345和348位点的丝氨酸(S)用丙氨酸(A)替代；限制性内切酶EcoRI和Xho I双酶切扩增产物和载体、连接、转化、质粒提取、酶切鉴定、基因测序鉴定,构建人APJ受体羧基末端磷酸化位点突变的真核表达载体。4.酶联免疫吸附实验：检测细胞膜表面野生型APJ受体及APJ突变体的表达量；检测细胞内cAMP的含量。5.放射性配体结合实验：检测野生型APJ受体或构建的APJ突变体与配体的结合力。6.激光共聚焦共聚焦实验：检测野生型APJ受体及APJ突变体在细胞膜表面的定位及受体内吞过程。7.剂量反应和实时动态BRET实验：检测野生型APJ受体或APJ突变体与GRK2/5或β-arrestin1/2相互作用的剂量反应和实时动态关系。8.免疫共沉淀实验：检测APJ受体与β-arrestin1或β-arrestin2之间的相互作用。9.细胞内钙离子检测实验：Fluo-4 NW检测激动剂刺激对细胞内钙离子含量变化的影响。10.Western blot实验：检测激动剂对细胞内ERK1/2磷酸化水平的影响。11.统计学分析：所有数据采用均数士标准误(Mean±SEM)表示,采用GraphPad Prism 5.0软件进行统计学分析。研究结果1.APJ受体羧基末端磷酸化位点的鉴定NetPhos 2.0分析软件预测APJ受体蛋白序列的磷酸化位点分别为ser 335、ser345和ser 348。随后,质谱分析法明确apelin-13刺激后,APJ受体确定的磷酸化位点为ser 345和ser 348。2.APJ受体突变体真核表达载体的构建将APJ受体羧基末端335、345和348位点的丝氨酸(S)用丙氨酸(A)替代。构建人APJ受体羧基末端磷酸化位点突变的真核表达载体,测序证实突变体重组质粒构建正确。3.野生型APJ受体和APJ受体突变体的亚细胞定位分析ELISA和BRET实验发现APJ-S335A、APJ-S345A和APJ-S348A突变体与野生型APJ受体表达量相当,点突变对APJ受体的细胞膜表面表达没有产生明显的影响,差异无统计学意义。4.野生型APJ受体或APJ受体突变体对配体结合力的影响放射配体结合分析技术证实APJ受体羧基末端磷酸化位点的突变并不影响配体的结合。至少,ser335、345和348并不是apelin-13结合的关键位点。5.野生型APJ受体和APJ受体突变体的功能鉴定稳定表达野生型APJ受体或APJ受体突变体的HEK293细胞中,APJ-S335A、 APJ-S345A和APJ-S348A叁种突变体都以剂量依赖性的方式抑制了弗司可林(forskolin,FSK)诱导的cAMP生成。同样,apelin-13均能诱导叁种突变体胞内Ca2+释放的显着性增加,与野生型APJ受体基本一致。6.APJ受体丝氨酸348位点对apelin-13诱导的受体内吞的影响在稳定表达APJ受体的HEK293细胞,apelin-13(100nM)刺激5 min后受体内吞开始。激动剂作用30 min,大约有50%的受体离开细胞膜表面发生内吞。激动剂持续60 min后,大约70%的受体回到细胞膜表面。与野生型APJ受体比较,apelin-13诱导的APJ-S335A和APJ-S345A突变体内吞没有发生明显改变。然而,ser348位点的突变使受体的内吞作用受到明显抑制。激光共聚焦实验发现,野生型APJ受体和APJ-S335A、APJ-S345A、 APJ-S348A突变体清晰的表达在细胞膜的表面。激动剂的作用下,APJ-S335A和APJ-S345A突变体的内吞过程与野生型受体相似。然而,在apelin-13的刺激下,APJ-S348A突变体失去了向胞浆移位的能力,不能与胞浆中的β-arrestin1或P-arrestin2蛋白发生共定位。7. APJ受体丝氨酸348位点对GRK2/5或p-arrestinl/2集的影响BRET2检测apelin-13对APJ与G RK2/5相互作用的剂量反应关系。研究表明,GRK2被招募到激动剂活化的受体。EC50值分别为：6.58±0.58nM(WTAPJ), 6.20±1.56 nM(APJ-S335A),5.69±1.42 nM(APJ-S345A)。同样,APJ与GRK5相互作用的ECso值分别为：9.45±2.58 nM(WT APJ),8.20±1.85 nM (APJ-S335A),7.34±1.17nM(APJ-S345A).然而,在不同浓度激动剂的作用下,APJ-S348A突变体均失去了与GRK2或GRK5相互作用的能力。BRET1检测apelin-13对APJ与β-arrestin1/2相互作用的剂量反应关系。研究表明,β-arrestin1与野生型受体或突变体相互作用的ECso值分别为：5.69士0.71nM (WT APJ),5.06±1.05 nM(APJ-S335A),5.55±0.94 nM(APJ-S345A)。 β-arrestin2与野生型受体或突变体相互作用的ECso值分别为：8.29±1.25nM(WT APJ),7.25±0.73 nM(APJ-S335A),7.55±1.03 nM (APJ-S345A)。APJ-S348A突变体均失去了与β-arrestinl或β-arrestin2相互作用的能力。免疫共沉淀实验发现只有在FLAG-β-arrestin1 (或FLAG-β-arrestin2)和HA-APJ共转染的细胞样品中,显示出HA抗体沉淀下来的抗FLAG抗体反应的条带。而在FLAG-β-arrestin1(或FLAG-β-arrestin2)和HA-APJ-S348A共转染的细胞样品及对照组中,均未发现HA抗体沉淀下来的抗FLAG抗体反应免疫条带。8.APJ受体丝氨酸348位点对受体脱敏和复敏的影响受体脱敏实验发现,稳转APJ受体的HEK293细胞,apelin-13预处理3h诱导受体持续脱敏,胞内cAMP表达下降。然而,APJ-S348A稳转细胞未表现出激动剂诱导的受体脱敏和cAMP浓度的下降。受体复敏实验发现,100 nM apelin-13预处理APJ稳转细胞3h(诱导受体最大程度脱敏),洗脱激动剂,使细胞静置30 min后,大约有70%的受体重新回到细胞膜表面,而细胞静置2h后,几乎全部受体完成复敏过程。然而,APJ-S348A稳转细胞未观察到这一动态改变。9.APJ受体丝氨酸348位点对G蛋白结合的影响在共转染EGFP-APJ和Rluc-Gaq的HEK293细胞,apelin-13诱导快速明显增加的BRET信号,BRET信号在激动剂作用5 min达到峰值,随后迅速下降。APJ-S335A、APJ-S345A和APJ-S348A突变体观察到了同样的结果。同样,在共转染EGFP-APJ和Rluc-Gαi2的HEK293细胞,野生型APJ受体和叁种突变体都能募集Gαi2蛋白到活化的受体。10.APJ受体丝氨酸348位点对ERK1/2信号途径的影响时间依赖的ERK1/2磷酸化实验显示：HEK293-APJ细胞中,apelin-13作用2 min后,ERK1/2开始激活,最大激活在5 min,在60min内ERK1/2依然处在高水平的磷酸化状态。相比较,在HEK293-APJ-S348A细胞中,apelin-13作用5 min后,ERK1/2的磷酸化与野生型受体相似。然后,在激动剂作用15 min后,ERK1/2的磷酸化快速下降到基础水平。浓度依赖的ERK1/2磷酸化实验显示：不同浓度的apeli n-13作用15 min, HEK293-APJ细胞表现出浓度依赖的ERK1/2磷酸化。然而,激动剂作用HEK293-APJ-S348A细胞相同的时间,各种浓度的apelin-13均未诱导出ERK1/2的磷酸化。继而缩短激动剂的作用时间,观察apelin-13刺激5min, HEK293-APJ细胞和HEK293-APJ-S348A细胞引起ERK1/2磷酸化的剂量依赖关系,结果并未发现两组细胞表现出统计学的差异。PTX预处理阻断Gai/o蛋白后,结果发现HEK293-APJ细胞和HEK293-APJ-S348A细胞,apelin-13诱导的ERK1/2磷酸化均表现出明显的降低。转染特异的shRNA抑制胞内的β-arrestin表达,观察apelin-13诱导的ERK1/2磷酸化过程。结果发现,转染shRNA对照组的HEK293-APJ细胞,apelin-13诱导的ERK1/2磷酸化与未转染组完全一致。然而,HEK293-APJ细胞分别转染P-arrestinl shRNA或β-arrestin2 shRNA, apelin-13作用15 min后的ERK1/2磷酸化水平明显降低。HEK293-APJ348细胞中转染β-arrestin shRNA后,apelin-13诱导的晚期ERK1/2磷酸化同样处于极低的水平,与野生型受体比较无显着性差异。结论APJ受体的348位氨基酸是GRKs和β-arrestin结合的关键位点,其突变影响了受体的脱敏、内吞、复敏过程以及G蛋白非依赖的ERK1/2磷酸化。然而,APJ受体ser348位点的突变并不影响G蛋白的活化以及G蛋白下游的信号通路。因此,APJ-S348A突变体表现出偏向性受体的特性,其产生的偏向性信号有助于新的药物设计和研发。(本文来源于《山东大学》期刊2015-04-07）
刘咸筠[10]（2015）在《HIV-1 Vpr蛋白以非依赖CRL4(DCAF1)泛素连接酶途径抑制CMV启动子活性的研究》一文中研究指出自猴免疫缺陷病毒进化到人免疫缺陷病毒，进而演变成全球范围的重大传染性疾病之后，艾滋病引起了整个临床医学与基础研究领域的重视。早在二十年前，研究者们已经将病毒的基因结构组成与颗粒蛋白组分分析出来，由此认识到病毒辅助蛋白在病毒复制、感染、入侵等一系列生命活动中都起着重要作用。其中病毒辅助蛋白Vpr扮演着多重角色，如诱导宿主细胞周期阻滞或凋亡，参与病毒颗粒组装，协助病毒DNA进核整合到染色体上，以及激活HIV LTR基因组和部分宿主蛋白的转录表达。本课题在研究Vpr的转录激活作用的过程中，首次发现Vpr具有抑制CMV病毒启动子转录表达的功能，这促使我们思考是否可以将Vpr蛋白发展成为一种CMV病毒的抑制剂。巨细胞病毒是可以感染从人至哺乳动物的致死性病毒，在器官移植、胎儿先天性畸形及感染免疫缺陷患者的病例中比较常见，治疗过程非常棘手，而且目前没有找到一种切实可行的防治药物。本研究中所采用的启动子负责调控CMV MIE期的转录活性，具有较强的转录启动能力，对于调控整个HCMV基因组表达发挥了重要作用。由于这段启动子上DNA组成和结构较为复杂，因而它的作用机制尚不明确，而本课题的研究则有助于探索CMV启动子的调控途径。我们在实验过程中发现了针对CMV启动子转录表达起负调节作用的外源因子，当将Vpr蛋白与CMV启动子表达质粒共同转染进入到人胚胎肾细胞中，分别使用荧光素酶报告基因和绿色荧光蛋白两种不同的标签标记CMV启动子，再选择相应的检测系统进行鉴定，都可以发现Vpr蛋白在转录水平上明显的抑制了CMV启动子的表达，极大程度上的说明了Vpr蛋白具有开发成为抵抗巨细胞病毒的药物的潜力，由此反映出本课题研究的第一重要意义。现阶段，研究者们还不清楚Vpr调节HIV LTR转录活性的具体途径，本课题在研究Vpr抑制CMV启动子转录表达的作用机制时，首先考虑到经典的CRL4(DCAF1)泛素连接酶途径，泛素化是常见的HIV病毒蛋白特异性降解宿主限制性因子的作用方式，已知病毒蛋白Vif、Vpx、Vpr都有各自固定的泛素化连接酶降解系统，但是本实验中叁种不同方法的验证结果都强有力的说明Vpr的新功能不依赖该途径。同时，我们发现了一个显着的突变点A30/V31丧失了对CMV启动子的功能，A30/V31位于Vpr空间结构中的第一个α螺旋区域中，通过比对不同种属和不同亚型的序列可知这个点具有高度保守性，之前的数据显示A30/V31也丧失了诱导细胞周期阻滞的作用。接下来我们验证了Vpr对宿主内源因子UNG2启动子的转录调控作用，A30/V31同样对UNG2启动子丧失了调控作用。可见A30/V31是Vpr行使转录调控功能的重要区域，关于突变点丧失功能的机制还尚未清楚，将在后续实验中进行深入研究，可以考虑是否与细胞周期有关。而这一区域将是阻止Vpr发挥转录调控作用的重要靶点，对于抑制HIV的复制周期具有极大的指示作用，由此体现了本课题研究的第二个意义所在。结合已有报道Vpr结合宿主内转录因子NFkB、C/EBP等，我们模拟出一个Vpr介导转录调控的作用模型，其关键机制在于Vpr蛋白因竞争性的结合了转录调控元件，正向调节或者负向调节宿主内受调控基因的表达，从而以利于病毒自身基因组的转录活性。若找到这些关键的内源转录因子，对其进行修饰或者加工，则可发展成为抵抗HIV病毒的抑制剂，将基础研发转化为临床应用，此项研究是本课题的第叁项意义体现。基于前期研究中构建的病毒蛋白与宿主蛋白呈军备式进化关系的作用模型，结合已知Vpr的功能，我们发现HIV-1Vpr对CMV启动子的调控作用具有种属特异性，部分SIV Vpr不表现出调控CMV启动子的能力，这一发现揭示了Vpr的新功能是由病毒与宿主拮抗性进化过程中筛选而来，具有进化选择性，对于探索Vpr的功能机制起到促进作用，此项研究成为本文的第四个研究意义。因此，从Vpr抑制CMV启动子的转录活性出发，结合已知重要功能区，深入研究其作用机制，有助于研发抗病毒药物及实现攻克并抵制病毒的感染。(本文来源于《吉林大学》期刊2015-04-01）
非依赖途径论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
目的:顺铂是广泛应用于治疗实体瘤的化疗药物,其最重要的副作用是其对肾小管的直接毒性而导致的肾损伤,但其如何诱导细胞死亡的作用机制不明,本研究拟探讨顺铂诱导细胞死亡的机制。方法:采用cas9基因敲除技术,获得RIP1/RIP3/MLKL/Cyclophilin-D基因敲除的不同细胞株;从基因敲除小鼠中原代分离肾小管上皮细胞、和骨髓源性的巨噬细胞;观察顺铂干预后对细胞死亡以及TNFα分泌的影响;观察TNFα中和抗体是否介导顺铂诱导的程序性坏死小体RIP1/RIP3/MLKL的产生。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
非依赖途径论文参考文献
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