张继华李晓张毅蔡远玲高明周云春（云南省玉溪市人民医院653100）
【摘要】目的检测单侧肺部孤立小结节患者四种标本p16基因甲基化状态，探讨其在肺部孤立小结节病灶早期诊断中的价值。方法采用MSP法检测79例单侧肺部孤立小结节（Ⅰ期以内肺癌），并接受手术切除的肺癌患者的血清、痰标本、肺泡灌洗液、组织中P16基因甲基化情况。结果经病理证实为NSCLC中腺癌患者四种标本中P16基因甲基化率分别为50.00%，52.77%，58.33%，58.33%；鳞癌患者对应的四种标本中P16基因甲基化率分别为54.54%，54.54%，54.54%，59.09%；而SCLC患者对应的四种标本中P16基因甲基化率分别为0%，15.38%，15.38%，15.38%。结论P16基因甲基化检测对肺部孤立小结节病灶的早期诊断有重要价值，其对NSCLC患者早期诊断及筛查价值高于SCLC。
【关键词】DNA甲基化P16基因孤立小结节肺癌
【中图分类号】R563【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2013）45-0086-02
TheearlydiagnosisapplicationofP16genemethylationinthesolitarypulmonarynodules
ZhangJiHuaLiXiaoZhangYiCaiYuanLingGaoMingZhouYunChun
【Abstract】ObjectiveUsingMSPtodetectisolatedunilateralpulmonarynodulesinpatientswithp16genemethylationstatus,toinvestigateitsearlydiagnosisvalue.MethodUsingMSPtodetect79casesofunilateralsolitarypulmonarynodules(lessⅠlungcancer),andaccepttheserumofpatientswithsurgicalresectionoflungcancer,sputum,bronchoalveolarlavagefluid.ResultsPathologicallyconfirmedNSCLCpatientswithadenocarcinomainFourkindsofspecimensP16genemethylationratewas50.00%,52.77%,58.33%,58.33%;carcinomaspecimenscorrespondingratesofwere54.54%,54.54%,54.54%,59.09%;whileSCLCspecimenscorrespondingrateswere0%,15.38%,15.38%,15.38%.ConclusionP16genemethylationdetectionofsmallsolitarypulmonarynodulesearlydiagnosishaveacertainvalue,itsvalueforearlydiagnosisandscreeningofNSCLCpatientsishigherthantheSCLC.
【KeyWords】genemethylationP16genesolitarynoduleslungcancer
肺癌目前缺乏理想的早期筛查手段，胸片和痰细胞学检测已用于肺癌的筛查，具有经济和方便的优势，但其敏感性很低，在高危人群进行筛查并不能降低肺癌的死亡率。有研究显示低剂量螺旋CT发现的非钙化结节中实际为肿瘤的结节不到2%，而确定这些结节的良恶性需要定期的CT随访检查、活检或者手术，对大部分良性结节患者这将造成较大的身体创伤、承受手术风险以及巨大的精神、经济负担。
P16抑癌基因又称MTS1基因或CDKN2基因，是人们发现的第一个直接作用细胞周期抑制细胞分裂的抑癌基因。现有国内外研究均表明，P16基因甲基化与非小细胞肺癌（NSCLC）中关系密切，但其在小细胞肺癌（SCLC）中的诊断价值未见明确结论[1]。Zhang等研究认为，在非小细胞肺癌（NSCLC）中吸烟与p16基因的甲基化关系密切。当抑癌基因p16发生突变，它的编码蛋白表达水平将会下降或消失，失去原有的生物学功能，导致肿瘤的发生[2]。
资料与方法
一、研究对象
收集2009-2013年间本院及昆明医科大学第一附属医院单侧肺部孤立占位病灶，并接受手术切除的患者79例，术前留取患者外周血、痰液、支气管肺泡灌洗液标本，进行甲基化检测；术后进行病理分析，同时组织标本进行DNA甲基化检测。入组条件：可疑Ⅰ期以内肺癌患者（遵照肺癌TNM国际分析），肺部CT检查为单侧肺部孤立占位，病灶直径8-15mm，未见到同侧或对侧淋巴结肿大，纤支镜检查未见增生阻塞，经过常规检查不能明确占位性质，愿意接受手术治疗者。
二、方法
按照标准的标本采集方法分别对两组中的实验对象进行血清、痰、支气管肺泡灌洗液、活检组织或术后组织标本的采集；将采集来的标本提取DNA后用甲基化特异性PCR(methylationspecificpolemerasechainreaction，MSP)方法进行定性检测。
各组实验数据的计算方法如下：
甲基化率(%)=发生甲基化的标本数/总的标本数×100%
应用SPSS13.0统计软件对分类资料进行χ2检验，若P＜0.05，则差异有统计学意义，若P＞0.05，则差异无统计学意义。
结果
76例患者术后病理诊断证实为肺癌者71例（89.8%），其中腺癌36例（50.7%），鳞状细胞癌22例（31.0%），小细胞癌13例（18.3%）。术后经病理证实为NSCLC中腺癌患者血清、痰、支气管肺泡灌洗液、肺癌组织标本中P16基因甲基化率分别为50.00%，52.77%，58.33%，58.33%；鳞癌患者对应的四种标本中P16基因甲基化率分别为54.54%，54.54%，54.54%，59.09%；四种标本p16基因甲基化阳性率比较详见表一。13例SCLC患者对应的四种标本中P16基因甲基化率分别为0%，15.38%，15.38%，15.38%。肺部孤立小结节病灶术后诊断NSCLC患者，所有痰标本、血清、支气管肺泡灌洗液中检测到异常甲基化，其组织标本也能检测到相应基因的异常甲基化，配对χ2检验结果表明肺癌组织的p16基因甲基化率与痰、血清、支气管肺泡灌洗液标本p16基因甲基化率存在着较好的一致性，见表二。
表一肺部孤立小结节患者手术后四种标本p16基因甲基化阳性率
（%）比较
组别例数组织血液痰液肺泡灌洗液
阳性例数阳性率阳性例数阳性率阳性例数阳性率阳性例数阳性率
非小细胞肺癌腺癌362158.331850.001952.772158.33
鳞状细胞癌221359.091254.551254.541254.54
小细胞肺癌13215.3800215.38215.38
P<0.01<0.01<0.01<0.01
表二NSCLC患者术后痰液、肺泡灌洗液与组织标本P16基因
甲基化阳性率（%）比较
血液痰液肺泡灌洗液
阳性例数阴性例数阳性例数阴性例数阳性例数阴性例数
组织阳性例数304313331
阴性例数024024024
P0.1250.2501.000
Kappa0.8610.8950.965
讨论
世界卫生组织公布的资料显示，肺癌发病、死亡率均居全球癌症的首位，肺癌的早期诊断对肺癌的早期治疗及预后有着非常重要的意义。表观遗传学的研究表明，肿瘤的形成往往伴随着抑癌基因启动子区域CpG岛的异常甲基化修饰[3]。DNA甲基化检测尤其是p16、MGMT等基因甲基化检测已成为肺癌诊断研究中的热点之一[4]。大量的研究结果已经表明，P16基因甲基化检测有望成为非小细胞早期诊断的重要指标之一[5]。
本实验采用MSP法检测患者血清、痰标本、肺泡灌洗液、组织中P16基因甲基化情况，结果显示：术后诊断非小细胞肺癌58例，该58例患者中术后病理明确诊断为腺癌36例，鳞癌22例，在58例NSCLC患者中，血清、痰液、支气管肺泡灌洗液、组织切除标本中P16基因甲基化率均在50%左右，存在较好的一致性，表明P16基因甲基化检测对NSCLC的诊断意义较大，与其他研究学者实验研究结果一致。早期的研究SterlacciW以383例手术切除非小细胞肺癌为基础进行研究分析，P16基因表达损失在非小细胞肺癌（232/365，64%）中是常见的现象，尤其是在鳞状细胞癌（97/115，84%）与腺癌（93/186，50%）的相对比中，是表达缺失的常见原因[6]。BuckinghamL等的研究也表明P16基因发生在鳞癌的而启动子异常甲基化甲基化率高于腺癌[7]。血清，痰液中基因甲基化程度对肺部肿瘤早期的检测相关研究亦有不少报道，TanSH等研究表明在非小细胞癌血清中P16基因表达的甲基化频率为10/20（50%）[8]。彭再梅等的研究表明在诱导痰中P16基因启动子区甲基化检出率为48.8%[9]。Belinsky[10]等通过研究表明随着痰液中多基因启动子甲基化的表达增加，肺癌的发生风险也相应的增加，p16异常甲基化是肺癌发生时的早期事件。Belinsky[10]用甲基化特异性PCR技术检测鼠肺癌模型及人肺鳞癌的肿瘤进展情况，发现p16基因在细胞增生时，其甲基化水平为17%，鳞状上皮化生时为24%，发展为原位癌时为50%，这说明p16基因的异常甲基化发生在肺癌的早期，随着肿瘤进展而增高。研究表明P16基因甲基化在非小细胞癌的发生发展中起着重要作用[11]。
本实验中，小细胞肺癌13例标本中检测到DNA甲基化2例，与非小细胞癌患者有显著统计学差异。相关研究表明，应用5-Aza-dC作用发现该药物能成功逆转hMLH-1基因启动子的甲基化状态，使该基因得以重新表达，说明DNA甲基化也在小细胞肺癌的发生发展中亦起着重要作用[12]。但本实验中P16基因甲基化检出率在SCLC患者标本中较NSCLC患者标本中低，显示出该项检验在早期诊断非小细胞肺癌方面的优势。有文献报道，P16基因甲基化检测在63例NSCLC组织标本中27例(43%)发现p16基因甲基化,6例小细胞肺癌组织标本中发现1例(17%),两者差异无统计学意义(V2=01661,P>0105)[13]。但此实验小细胞肺癌的标本数更少。
总之，实验MSP结果表明P16基因的甲基化是肺癌发生发展中的重要事件，肺癌患者P16基因甲基化检测为肺癌的早期诊断提供了有价值的参考意义，尤其是对非小细胞癌患者的参考意义更大，增大样本数的研究可能能为其在小细胞肺癌中的诊断意义提供更大的依据，对P16基因的研究可能为我们队肺癌的早期诊断和治疗提供更好的思路。
参考文献
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[2]!!!INVALIDCITATION!!!
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