张和平樊雷廖华伟张捷徐丹（川北医学院附属医院肾内科637000）
【摘要】目的：研究氯沙坦钾对糖尿病大鼠肾脏PINCH-1(particularyinterestingnewcysteine-histidinerichprotein-1)表达的影响。方法：建立糖尿病大鼠模型，利用荧光实时定量PCR和Westernblot检测经氯沙坦钾治疗后糖尿病大鼠肾脏组织中PINCH-1mRNA和蛋白表达水平的变化。结果：荧光实时定量PCR结果显示糖尿病大鼠组肾脏组织中PINCH-1mRNA（1.537．5±0.04）明显较正常大鼠组（1.128±0.03）升高，而氯沙坦钾治疗组大鼠肾脏PINCH-1的mRNA（1.246±0.02）较糖尿病大鼠组明显降低，组间比较差异均具有统计学意义（P＜0.05）。Westernblot结果显示氯沙坦钾治疗组大鼠肾脏中PINCH-1蛋白的相对表达量为1.159±0.03，明显低于糖尿病模型组（P＜0.05）。结论：氯沙坦钾能够下调糖尿病大鼠肾脏组织中PINCH-1的表达。
【关键词】氯沙坦钾；糖尿病；PINCH-1【中图分类号】R2【文献标号】A【文章编号】1671-8725（2014）11-0145-02DownregulationoftheExpressionofPINCH-1intheKidneyTissuebyLosartaninDiabetesMellitusRatZHANGHe-ping，FANLei,LIAOHua-wei,ZHANGJie,XUDan（DepartmentofNephrology,AffiliatedhospitalofNorthSichuanMedicalCollege,Nanchong637000China）abstract:Objective:ToinvestigatedtheeffectoflosartaninregulatingtheexpressionofPINCH-1inthekidneytissueofdiabetesmellitusratusingdiabetesmellitusratmodel.Methods:Afterestablishingratmodelofdiabetesmellitus,real-timepolymerasechainreaction(RT-PCR)andWesternblotwereappliedtodetecttheexpressionofPINC-1inthekidneytissueofdiabetesmellitusratafterlosartantreatment.Results:RT-PCRshownthePINCH-1mRNAexpressionindiabetesmellitusrat(1.537．5±0.04)washigherthaninthenormalrat(1.128±0.03),anddecreasedafterthetreatmentoflosartan(1.246±0.02)(P＜0.05).WesternblotshowntheexpressionofPINCH-1inthekidneytissueofdiabetesmellitusratwithlosartantreatment(1.159±0.03),(P＞0.05).Conclusion:losartancoulddownregulatetheexpressionofPINCH-1inthekidneytissueofdiabetesmellitusrat.KeyWords:Losartan;DiabetesMellitus:PINCH-1
随着社会经济的持续发展和人口的老龄化，我国糖尿病患病率近年来呈急剧升高趋势，已成为严重的公共卫生问题。糖尿病肾病是糖尿病的严重慢性并发症之一，严重危害着人类的健康及生命。糖尿病肾病的发病机制比较复杂，已经证明生长因子/细胞因子、糖基化作用、血流动力学改变等均参与糖尿病肾病的发病[1，2]。PINCH-1(particularyinterestingnewcysteine-histidinerichprotein-1)蛋白是新近发现的LIM家族的一个成员，含有5个LIM结构域和1个核定位信号。PINCH-1在整合素和生长因子信号传导通路中处于一个关键的“十字”交汇点处，提供整合素信号系统与生长因子信号系统之间的联系[3]。研究表明PINCH-1蛋白通过多种途径参与了多种肾脏疾病的发生发展，目前对于PINCH-1蛋白在糖尿病肾病肾组织中的表达情况及氯沙坦钾对其表达影响的报道甚少，本研究利用糖尿病肾病大鼠模型，观察了糖尿病肾病肾组织中的PINCH-1表达及氯沙坦钾对其表达的影响，1材料与方法1.1实验材料1.1.1实验动物清洁级3月龄雄性Wistar大鼠，购于四川大学实验动物中心，体重在180－200ｇ之间。
1.1.2主要试剂及用药链脲佐菌素（STZ）购于Sigma公司。氯沙坦钾由扬子江药业提供。第一链cDNA合成试剂盒购于Fergment公司，SYBRgreenMIX购于TaKaRa公司。小鼠抗大鼠PINCH-1单克隆抗体购于武汉武汉博士德生物工程有限公司。HRP标记的羊抗鼠二抗购于北京中杉金桥生物技术有限公司。ECL显影液购于碧云天生物技术公司。
1.2实验方法1.2.1动物饲养大鼠饲养于实验动物中心清洁级动物室。动物室温度控制在20－24℃，12h交替照明。大鼠自由饮水，进食，保持垫料干燥，每天换垫料2次。
1.2.2糖尿病大鼠模型的建立造模前，大鼠禁食12h，链脲佐菌素（STZ）临用前用0.1mol/L，ph4.0的枸橼酸缓冲液配成1%的浓度，按照55mg/kg体重的剂量灌胃，72后检测空腹血糖尿糖水平，以血糖＞13.7mmol/L且尿糖检测在++－+++以上作为模型入选。正常组给予等量的枸橼酸缓冲液。
1.2.3实验分组及动物给药实验分为正常大鼠组、糖尿病大鼠组、以及氯沙坦钾治疗组。每组10只。确定造模大鼠达到模型标准后，稳定3d后开始给药，氯沙坦钾治疗组予以氯沙坦灌胃，剂量20mg/kg·d，可自由进食。正常大鼠组以及糖尿病大鼠组每天自由进食。
1.2.4标本收集动物饲养2周后，迅速用无菌剪刀摘取肾脏后，用预冷的生理盐水冲洗，冲洗后切取1/3肾脏按照0.1kg/L置于TRLZOL溶液中，电动匀浆器研磨后-80℃保存。剩余2/3肾脏按照0.1KG/l加入1×的SDS-PAGE上样缓冲液中用电动匀浆器研磨后100℃煮沸5min，8000ｒ/min，5min离心后取上清，-20℃保存备用。
1.2.5荧光实时定量PCR检测肾脏组织中PINCH－１的表达总RNA的提取按照TRLZOL说明书中的方法进行。逆转录过程按照第一链cDNA合成试剂盒说明书进行。荧光实时定量PCR反应体系按SYBRgreenMIX说明书进行，将DNA标准品按10，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5进行倍比稀释以制作标准曲线，PCR反应条件为94℃预变性10min，然后94℃，10ｓ；56℃，20ｓ；72℃，20ｓ共40个循环，PCR结束后将产物进行DNA琼脂糖凝胶电泳分析，结合溶解曲线确定PCR过程无非特异性扩增，再根据标准曲线计算出每组样品cDNA含量，将PINCH-1的cDNA含量除以相应内参β-actin的cDNA含量，得到PINCH-1的相对表达量。引物由上海生工公司合成。
1.2.6Westernblot检测肾脏组织中PINCH-1蛋白的表达将各组蛋白样品以15％分离胶常规SDS-PAGE电泳后转印至PVDF膜上，用封闭液（含50g/L脱脂奶粉的TBST）室温震荡封闭2h，加入抗PINCH-1的抗体（1:2000）或者抗大鼠β-actin抗体（1:2000）室温反应1h，再加入辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG（1:3000），室温反应1h，ECL显色后，观察结果。
1.3统计学方法应用SPSS11.0统计学软件进行数据处理，组间比较采用方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。
２结果2.1实时荧光定量PCR显示氯沙坦钾能明显降低糖尿病肾脏组织中PINCH-1的mRNA表达结果显示糖尿病大鼠组肾脏PINCH-1mRNA明显较正常大鼠组升高，而氯沙坦钾治疗组大鼠肾脏PINCH-1mRNA较糖尿病大鼠组明显降低，组间比较差异具有统计学意义（P＜0.05）（表1）。
表1三组PINCH-1mRNA和蛋白表达水平
2.2Westernblot显示氯沙坦钾能降低糖尿病大鼠肾脏中PINCH-1蛋白的表达Westernblot结果显示，氯沙坦钾治疗组大鼠肾脏中PINCH-1蛋白的表达量明显低于糖尿病模型组，差异具有统计学意义（P＜0.05）（表1）。
３讨论随着经济的发展和人民生活水平的提高，中国已经成为全球糖尿病第一大国[4]。糖尿病是一种严重的慢性、进展性疾病，严重地危害着人类的健康。糖尿病肾病（DiabetesNephrology，ＤＮ）是糖尿病最常见的并发症之一，不久的将来，糖尿病肾病在我国必将成为导致终末期肾衰的最主要原因之一。探究糖尿病肾病的发病机制和早期防治药物有着重要的临床意义和社会价值。
目前研究发现细胞因子及炎性因子参与了2型糖尿病肾病的发生发展，糖尿病肾病早期就存在着间质纤维化改变。PINCH是一种广泛表达的黏着斑蛋白，PINCH蛋白均含有5个LIM结构域和1个核定位信号，PINCH-1借其第一个LIM结构域的双锌指结构与ILK的N端的ANK重复序列相结和,而ILK的C端则可与整合素的胞浆域相结合。这样PINCH便与ILK和整合素共同形成信号复合物来参与整合素的信号传导通路。PINCH-1蛋白还可借助它的第4个LIM结构域的双锌指结构与Nck-2相结合从而参与生长因子信号传导系统。PINCH-1在整合素和生长因子信号传导通路中处于一个关键的“十字”交汇点处，提供整合素信号系统与生长因子信号系统之间的联系。氯沙坦是AngⅡ受体拮抗药，通过选择性地阻断AngⅡ与AT1受体的结合，能够降低肾小球滤过率、改善肾内血流动力学，促进细胞外基质的降解，抑制系膜细胞、成纤维细胞和巨噬细胞的活性，改善滤过膜通透性，减少尿蛋白，而成为糖尿病肾病患者常用治疗药物。
本研究结果显示，在正常肾间质中仅有极少量PINCH-l表达，糖尿病肾病肾组织中PINCH-I表达量明显增加。氯沙坦钾能够下调糖尿病大鼠肾脏组织中PINCH-1的表达，从而减轻TGF-β1等细胞因子导致的系膜细胞增殖和系膜基质沉积[5]。这可能是治疗糖尿病肾病、肪治肾间质纤维化发生发展的一种重要手段。
参考文献[1]刘艳春，刘佳.糖尿病肾病的发病机制及治疗［J］.国际内分泌代谢杂志，2011，31(2):84-86.[2]刘海霞，刘奔，刘丹丹，等.慢性炎症标志物检测对于2型糖尿病早期肾脏病诊断的临床意义［J］.中国糖尿病杂志，2012，20(2):108-110.[3]VelyvisA,YangYW,WuCY,etal.SolutionstructureofthefocaladhesionadaptorPINCH-LIM1domainandcharacterizationofitsinteractionwiththeintegrin-linkedkinaseankyrinrepeatdomain.JBiolChem,2001,276(6):4932-4939.[4]薄虹，黄颂敏，吴蔚华，等.糖尿病肾病的现状及对策［J］.中华肾脏病杂志，2011，27(6):464-465.[5]GuoL,WuC.RegulationoffibronectinmatrixdepositionandcellproliferationbythePINCH-ILK-CH-ILKBPcomplex.FASEBJ,2002,16(10):1298-1300.