导读:本文包含了基因保守序列论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:谷子,PT2基因,生长调节因子,籽粒性状
基因保守序列论文文献综述
李燕,杨致荣,高建华[1]（2018）在《谷子PT2基因保守序列的克隆与分析》一文中研究指出谷子是重要的杂粮作物之一,具有很高的营养价值,因此,对谷子的研究和推广成为当前研究的热点。其中,培育高产优质的谷子新品种是谷子研究的重要方向。从改善谷子产量性状的角度出发,对一个与谷子籽粒多种性状相关的基因PT2(Panicle Traits 2)进行了分析。结果表明,该基因在水稻中能够调控籽粒形状、大小和落粒性等性状。根据水稻PT2基因编码的氨基酸序列(Os GRF4),通过生物信息学的方法,在谷子基因组中筛选出潜在的对应基因(Seita.1G287100)。然后预测了该基因的启动子潜在元件,结果发现,其启动子存在多种环境响应元件,暗示该基因参与多种代谢的调控。m RNA检测结果也显示,该基因在谷子苗和穗均有表达。最后,分析了43种谷子品系和3种狗尾草资源中PT2基因的保守性,结果发现,该基因在谷子和狗尾草中的序列基本一致,只有一个导致氨基酸改变(T190A)的SNP。通过生物信息学的方法,确定了谷子和狗尾草的PT2基因。但是谷子和狗尾草中的PT2基因及其启动子的高度保守性,暗示2种植物籽粒相关性状的差异由其他基因决定。(本文来源于《山西农业科学》期刊2018年06期）
杨植[2]（2015）在《含结核特异CDR3保守序列TCR基因的构建及其修饰T细胞抗结核活性研究》一文中研究指出背景结核病(TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)引起的传染性疾病。全球约1/3的人口感染MTB,其中约5-10%罹患活动性结核病,每年约900万例新增活动性肺结核报告。近年来,由于耐多药(MDR)和广泛耐药(XDR)菌株的流行、人类免疫缺陷病毒(HIV)与MTB伴发感染,使结核病成为死亡人数最高的传染病。传统结核病的治疗仍以基于抗生素的化疗为主,但由于疗程长、副作用大、以及耐药性等问题,导致结核病患者久治不愈、治疗效果欠佳。MTB属于胞内寄生菌,体液免疫难以对其发挥作用,抗结核感染的免疫机制主要是细胞免疫,作用最关键的是特异性CD4+Th和CD8+CTL。T细胞过继免疫治疗可以作为对结核免疫缺陷患者和耐药患者有效的治疗方法。T细胞过继免疫治疗是体外培养、扩增、并利用抗原特异T细胞表面受体(TCR)基因修饰T细胞,赋予T细胞抗原识别特异性,回输体内从而使机体获得大量效应T细胞,以发挥清除MTB作用。本研究所已证实MTB抗原特异TCR基因修饰的CD4+、CD8+T细胞在具有良好的抗结核活性。然而,自体T细胞过继免疫治疗适用范围窄,需针对病例个体进行结核特异性抗原刺激T细胞、筛选抗原特异T细胞,建立并筛选T细胞克隆、抗原特异性TCR构建、基因修饰T细胞等过程,其筛选的TCR基因不具有广泛适用性,仅针对个体适用,且周期长。有研究表明流感病毒、人类疱疹病毒(EBV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)和巨细胞病毒(CMV)等病毒感染的病例间可观察到TCR的偏好取用,即限制性取用特定α链可变区基因(Vα)、p链可变区基因(Vβ)或互补决定区3(CDR3)区序列,具有保守的TCR基因。这些保守TCR基因具有高活性及敏感性,对抑制病毒复制起到重要作用。在本研究中,通过CDR3谱型分析,找到86例结核初治患者中保守的CDR3序列,从GeneBank中获取高频使用V基因、J基因片段,以及C基因片段的序列,首次构建含CDR3保守序列的TCR,对其进行构象预测,进而构建了其重组逆转录病毒表达载体,制备重组逆转录病毒,转染2例结核患者CD4+和CD8+T细胞,分别与负载灭活H37Rv菌株的DC共培养,检测TCR基因修饰CD4+T细胞的增殖与IFN-γ、TNF-α、IL-4分泌水平,TCR基因修饰CD8+T细胞IFN-γ、 TNF-α、GrB分泌水平,及其对靶细胞的杀伤作用,证实含结核特异CDR3保守序列的TCR基因修饰的T细胞具有一定的抗结核活性。目的找到结核特异CDR3保守序列,构建含保守序列的TCR,研究其修饰患者T细胞的体外抗结核活性,为下一步动物实验奠定基础,为含结核特异CDR3保守序列的TCR基因修饰T细胞应用于结核患者群体化过继免疫治疗提供依据。方法1.通过CDR3谱型分析找到结核特异CDR3保守序列①采用淋巴细胞分离液分离结核患者和健康志愿者外周血单个核细胞(PBMC);②分别磁珠分选出CD4+、CD8+T细胞,提取CD4+和CD8+T细胞mRNA,逆转录为cDNA；③CDR3谱型分析检测CDR3谱型,并选择在CD4+、CD8+T细胞中,呈单克隆扩增的抗原特异TCR α、β基因家族测序分析,分析病例间结核特异CDR3保守序列及优势表达的V基因家族、J基因片段；④利用CDR3谱型复杂性评分系统对结核患者和健康志愿者进行评分,并比较差异；⑤利用相对复杂性评分系统分析结核患者间CDR3区基因多样性差异。2.构建含结核特异CDR3保守序列TCR基因的重组逆转录病毒表达载体①获取高频使用V基因片段,以及C基因片段的序列,构建含CDR3保守序列的TCR,对其进行构象预测,分析TCR a链和β链排列组合而成的异二聚体结构的稳定性,确定需构建的TCR基因：②根据人α链和β链基因家族可变区(variable region, V)和恒定区(constant region, C)基因序列设计引物,扩增含结核特异CDR3保守序列的TCR的α链和p链全长基因；③采用本实验室已经构建好的最小突变C区(其中C区9个氨基酸位点替换)替换α链和β链全长基因的C区：④利用重组PCR技术,将已最小突变TCRα链和β链基因通过自剪切多肽2A连接,并克隆至pGEM-T载体测序鉴定；⑤将测序正确的TCR全长基因插入逆转录病毒载体pMX-IRES-GFP,酶切鉴定；⑥采用磷酸钙转染法,包装逆转录病毒,超速离心法浓缩病毒；⑦重组病毒转染NIH3T3细胞,流式细胞术测定感染性滴度,计算公式：病毒感染滴度(IU/ml)=NIH3T3细胞总数×GFP阳性率/病毒浓缩液量(ml)。3.含结核特异CDR3保守序列TCR基因修饰T细胞的抗结核活性IL-2和抗CD3单抗活化T细胞后,以MOI=10将重组病毒pMX-β-2A-α-IRES-GFP转染T细胞,通过流式细胞术检测GFP阳性细胞百分比。按一定效靶比(effector:target, E:T),将TCR基因修饰T细胞与负载灭活H37Rv菌株的DC混合培养,以未转染和空载体转染的T细胞为阴性对照,以鸡卵白蛋白(ovalbumin, OVA)为非特异性抗原对照；酶联免疫吸附分析法(ELISA)检测一定时间TCR基因修饰CD4+T细胞培养上清中IFNγ、TNF-α、IL-4分泌水平,利用WST-8法检测TCR基因修饰CD4+T细胞的增殖：ELISA检测一定时间TCR基因修饰CD8+T细胞培养上清中IFNγ、TNF-α、GrB分泌水平,利用时间分辨荧光免疫分析技术(TRFIA)技术,检测TCR基因修饰CD8+T细胞对负载MTB的DC的杀伤活性。4.统计学分析利用配对T检验方法比较健康志愿者与结核患者CD4+、CD8+T细胞亚群的CDR3谱型复杂性评分：利用单因素方差分析比较3组结核患者病例组组间相对复杂性评分；利用多个独立样本非参数检验评估患者年龄、型别、卡介苗接种史、结核菌素皮肤试验、结核病史或接触史、吸烟状况、结核病种类间差异；利用斯皮尔曼相关性分析检测相对复杂性评分和疾病严重程度以及其他临床指标的相关性。CD4+T、CD8+T细胞的细胞因子分泌水平的差异、CD8+T杀伤率应用单因素方差分析(One-Way ANOVA),方差不齐时用Welch校正,各组间两两比较方差齐时采用LSD法,方差不齐时采用Dunnett's T3法,采用析因设计资料的方差分析CD4+T细胞增殖水平。检验水准a=0.05,双侧检验。采用SPSS 13.0 for windows统计软件包进行数据分析。结果1.通过CDR3谱型分析找到结核特异CDR3保守序列检测86例结核患者CDR3谱型,对单克隆增生T细胞进行TCR基因测序,结果显示：86例病例中V基因片段高频使用Va7 (43.02%). Va9 (48.84%)、Vα17 (50%)、Vα32(41.86%)、Vβ19(86.5%)、Vβ24 (62.79%)基因家族。分析其CDR3区基因序列,结果显示：J基因片段中Jα34, Jα57, Jβ2-1出现频率较高；Vα链和Vβ链CDR3区存在保守序列,其中TCR Vα链CDR3区中存在GGGGNKLI. GGGNEQYF. APDTGSGAF保守序列,TCR Vβ链中存在GGGNKLI、TNKUI、 SADKLI保守序列。2.构建含结核特异CDR3保守序列TCR基因的逆转录病毒表达载体从GeneBank中获取高频使用V、J基因片段、以及C基因片段的序列,将CDR3保守序列与V、J、C基因片段拼接成全长α、β链基因序列,并对α、β链随机搭配组合形成的TCR进行构象预测,选出稳定性较佳的TCR Vβ19. Va7双链。成功扩增出经最小突变的含有结核特异CDR3保守序列的TCRβ及a链全长基因,经TA克隆后测序,Vβ19、Va7基因序列与预期的V区序列完全一致,C区的基因序列与预期相符。利用自剪切多肽2A,通过重组PCR,扩增出T细胞的hVp 19mCβ-2 A-hVa7mC融合基因,将其插入pMX-IRES-GFP,构建重组逆转录病毒表达载体pMX-hVp19mCβ-2A-hVa7mCa-IRES-GFP,酶切鉴定证实基因片段插入正确。将其与包膜蛋白质粒VSV-G共转染包装细胞GP2-29 3,48h后取病毒上清,浓缩纯化后感染NIH3T3细胞,检测病毒感染滴度。3.检测含CDR3保守序列TCR基因修饰CD4+T细胞的抗结核活性①检测TCR基因修饰CD4+T细胞的IFN-γ、TNF-α、IL-4分泌按E：T=7,将含结核特异CDR3保守序列TCR基因修饰CD4+T细胞和负载灭活MTB的DC混合培养18h,ELISA检测上清中IFN-y的分泌水平。结果显示,患者1的Td+MTB组IFN-y分泌水平显着高于UnTd+DC组(P<0.001),略高于另外叁组但差异不显着；患者2的Td+MTB组IFN-y分泌水平显着高于其他各组(P<0.05)。按E：T=20,将含结核特异CDR3保守序列TCR基因修饰CD4+T细胞和负载灭活MTB的DC混合培养24h,ELISA检测上清中TNF-α的分泌水平。结果显示,2例患者Td+MTB组的TNF-a分泌水平均显着高于其他各组(P<0.001)。按E：T=15,将含结核特异CDR3保守序列TCR基因修饰CD4+T细胞和负载灭活MTB的DC混合培养24h, ELISA检测上清中IL-4的分泌水平。结果显示,患者1的Td+MTB组IL-4分泌水平显着低于UnTd+DC组、EmTd+MTB组和Td+OVA组(P<0.001),略低于UnTd+MTB组但差异不显着；患者2的Td+MTB组IL-4分泌水平显着低于其他各组(P<0.05)。②检测TCR基因修饰CD4+T细胞的增殖按E：T=7,将含结核特异CDR3保守序列TCR基因修饰CD4+T细胞和负载灭活MTB的DC混合培养,测定第7天各组CD4+T细胞的增殖水平。结果显示,患者1的Td+MTB组增殖水平显着高于UnTd+DC组和UnTd+MTB组(P<0.05),略高于其它两组但差异不显着；患者2各组间增殖水平无统计学差异(P>0.05),但Td+MTB组T细胞增殖水平略高于其它各组。4.检测含CDR3保守序列TCR基因修饰CD8+T细胞的抗结核活性①检测TCR基因修饰CD8+T细胞的IFN-γ、TNF-α、GrB分泌按E：T=7,将含结核特异CDR3保守序列TCR基因修饰CD8+T细胞和负载灭活MTB的DC混合培养18h, ELISA检测上清中IFN-y的分泌水平。结果显示,患者1的Td+MTB组IFN-γ分泌水平显著高于Td+OVA组(P<0.05),略高于其它叁组但差异不显着；患者2的Td+MTB组IFN-γ分泌水平显著高于其他各组(P<0.05)。按E：T=20,将含保守CDR3序列TCR基因修饰CD8+T细胞和负载灭活MTB的DC混合培养24h,ELISA检测上清中TNF-α的分泌水平。结果显示,患者1的Td+MTB组TNF-α分泌水平显著高于UnTd+DC组、UnTd+MTB组和Td+OVA组(P<0.05),略高于EmTd+MTB组但差异不显着；患者2的Td+MTB组TNF-α分泌水平显著高于其他各组(P<0.05)。按E：T=20,将含结核特异CDR3保守序列TCR基因修饰CD8+T细胞和负载灭活MTB的DC混合培养24h,ELISA检测上清中GrB的分泌水平。结果显示,患者1的Td+MTB组GrB分泌水平显着高于其他各组(P<0.001);患者2的Td+MTB组GrB分泌水平显着高于UnTd+DC组、UnTd+MTB组和Td+OVA组(P<0.05),略高于EmTd+MTB组但差异不显着。②检测TCR基因修饰CD8+T细胞的杀伤活性按E：T=30,将含结核特异CDR3保守序列TCR基因修饰CD8+T细胞和负载灭活MTB的DC混合培养,检测各组CD8+T细胞对靶细胞的杀伤作用。结果显示,患者1的Td+MTB组的杀伤率显着高于UnTd+DC组、UnTd+MTB组和EmTd+MTB组(P<0.05),略高于Td+OVA组但差异不显着；患者2的Td+MTB组的杀伤率显着高于其他各组(P<0.05)。结论在本研究中,通过CDR3谱型分析,找到86例结核初治患者中保守的CDR3序列,从GeneBank中获取高频使用V基因、J基因片段,以及C基因片段的序列,首次构建含CDR3保守序列的TCR,对其进行构象预测,进而构建了其重组逆转录病毒表达载体,制备重组逆转录病毒,转染2例结核患者CD4+和CD8+T细胞,证实其具有一定的体外抗结核活性,为含结核特异CDR3保守序列的TCR基因修饰T细胞应用于结核患者群体化过继免疫治疗奠定了基础。(本文来源于《南方医科大学》期刊2015-05-27）
李亚超,王玉玲,朱晨,钟天秀,谢琦[3]（2014）在《日本结缕草(Zoysia japonica)磷脂酶D基因部分保守序列的克隆及其对机械损伤的响应》一文中研究指出以日本结缕草Zenith为材料,通过同源克隆的方法克隆出其磷脂酶D(PLD)基因部分保守序列,序列长399 bp,并通过实时荧光定量PCR检测PLD基因在机械损伤胁迫下随时间变化的表达模式。结果表明,磷脂酶D在胁迫2 h内大量表达,随后逐渐降低,在9 h已接近于对照水平,说明PLD基因在损伤初期大量参与了应对机械损伤胁迫的防御与修复过程,在损伤后期其作用减弱或被代替;电导率的测定结果表明,细胞膜结构在胁迫初期遭到极大程度的破坏,胁迫9 h后膜损伤程度开始减轻。结合PLD基因和电导率的表达模式,推测PLD基因在6 h内会激活一系列感受信号及下游信号分子,9 h后其相应防御机制发挥作用来减轻胁迫造成的损害。(本文来源于《广东农业科学》期刊2014年24期）
康现江,吴江立,穆淑梅,张朝晖[4]（2014）在《中华绒螯蟹组蛋白H3基因保守序列的克隆、表达及抗体制备》一文中研究指出为了研究组蛋白H3在中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)精子发生中的动态特征,采用PCR技术扩增中华绒螯蟹H3基因编码区的DNA片段,将其重组至含有6个His标签序列的原核表达质粒pET-30a(+)上,转化入大肠杆菌(Escherichia coli)Rosetta(DE3)感受态细胞中,以0.2 mmol/L的异丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导产生pET-30a-H3重组蛋白。SDS-PAGE表明,重组菌成功表达出了分子量约为21 ku的目标蛋白质,融合蛋白以上清和包涵体的形式存在。采用镍柱亲和层析的方法纯化目的蛋白,免疫新西兰大白兔(Oryctolagus cuniculus),制备兔抗血清。Western blot结果表明,制备的多克隆抗体具有较好的特异性。至此,成功地克隆了中华绒螯蟹H3编码区基因并制备了多克隆抗体,为进一步研究其在精子发生中的动态特征提供了基础。(本文来源于《动物学杂志》期刊2014年02期）
高乐,宋英培,李凯,章红运,沈颖超[5]（2013）在《大豆花叶病毒HC-Pro基因保守序列克隆及其RNAi载体的构建》一文中研究指出大豆花叶病毒(soybean mosaic virus,SMV)病是全球最主要的大豆病害之一,严重危害大豆的产量和品质。RNA干扰(RNA interference,RNAi)能够在mRNA水平特异性沉默同源靶基因,为抗病毒作物的培育提供了新的途径。本研究对国内外11个不同SMV流行株系的HC-Pro基因进行了核苷酸序列比对,并以SC3株系的cDNA为模板克隆出高度保守的268 bp的基因片段,进而利用GATEWAY技术构建了适合农杆菌介导大豆转化的RNAi表达载体pB7GWIWG2(II)-HC-Proi。并对BP反应和LR反应的纯化产物进行了测序鉴定,测得序列在NCBI上进行比对,匹配度为100%;以35S启动子和终止子设计引物,扩增得到464和478 bp两个片段,说明HC-Proi基因与pB7GWIWG2(II)重组形成反向重复结构,载体构建成功。结果为利用RNA干扰技术改良大豆对大豆花叶病毒的抗性奠定了基础。(本文来源于《大豆科学》期刊2013年06期）
刘艳丽[6]（2012）在《真菌β-葡萄糖醛酸苷酶基因克隆及其非保守序列对酶学特性的影响》一文中研究指出真菌P. purpurogenum Li-3，A. terreus Li-20和A. ustus Li-62分别能催化甘草酸生成单葡萄糖醛酸基甘草次酸GAMG，GAMG与甘草次酸GA以及GA。本文克隆了来自A. terreusLi-20和A. ustus Li-62的3个β-葡萄糖醛酸苷酶基因，并研究了A. terreus Li-20的β-葡萄糖醛酸苷酶非保守序列及其特性对酶学特性的影响，主要研究结果如下：克隆得到一个来自A. terreus Li-20的β-葡萄糖醛酸苷酶基因Atgus，全长1974bp，编码657aa；克隆得到两个来自A. ustus Li-62的β-葡萄糖醛酸苷酶基因Augus1和Augus2，二者分别由1917bp和1827bp组成，编码628aa和608aa。所克隆的β-葡萄糖醛酸苷酶基因所编码的蛋白质同源性较高，AtGUS的C-末端非保守序列最长（65aa），位于催化结构域的稳定面一侧以及亚基结合位置，与PGUS（P. purpurogenum Li-3的β-葡萄糖醛酸苷酶）、AuGUS1和AuGUS2的非保守序列差异较大，预测其与酶蛋白催化特性相关。为了研究非保守序列对于AtGUS催化特性的影响，扩增截除非保守序列的Atgus(-3t)，研究二者在大肠杆菌表达系统中表达蛋白质AtGUS-E和AtGUS(-3t)-E酶学特性及蛋白构象的差异。二者最适温度均为55℃，最适pH分别为6.6和7.0，AtGUS(-3t)-E热稳定性提高；Co~(2+)，Ca~(2+)和Ni~(2+)对于二者酶活的激活/抑制差异较大；AtGUS(-3t)-E（Km=1.95mM）对于底物甘草酸的亲和力比AtGUS-E（Km=12.9mM）高，且AtGUS(-3t)-E（Kcat/Km=7.16mM）的催化效率是AtGUS-E（Kcat/Km=2.24mM）的3.2倍；两者二级结构变化明显。根据AtGUS的非保守区肽段的亲/疏水分析结果，确定两个非保守序列截除位点，进行克隆，基因命名为Atgus(-t1)（1~604aa）和Atgus(-t2)（1~633aa），对其在大肠杆菌表达系统中表达蛋白质AtGUS(-t1)-E和AtGUS(-t2)-E的酶学特性和蛋白质结构进行研究。二者最适温度均为55℃，最适pH均为5.0；金属离子对于AtGUS(-t1)-E和AtGUS(-t2)-E具有相似激活/抑制的作用；AtGUS(-t1)-E（Km=11.52mM）和AtGUS(-t2)-E（Km=10.46mM）与底物的亲和力比AtGUS-E高，AtGUS(-t2)-E（Kcat/Km=8.31mM~(-1)s~(-1)）催化效率显着高于AtGUS-E；AtGUS(-t1)-E和AtGUS(-t2)-E的二级结构变化明显，叁级结构变化不明显。为研究极性氨基酸组成的非保守序列对于AtGUS的影响，克隆截除非保守序列的非极性氨基酸仅保留极性氨基酸的基因Atgus(-△NP)，通过大肠杆菌表达系统表达蛋白质AtGUS(-△NP)-E，研究非保守区极性氨基酸对于酶学特性以及蛋白质构象的影响：其最适温度均为50℃，最适pH均为5.6；Mg~(2+)、Mn~(2+)、Co~(2+)、Ca~(2+)和Ni~(2+)对AtGUS(-△NP)-E具有激活作用；AtGUS(-△NP)-E对甘草酸反应动力学常数Km为4.85mM，催化效率（Kcat/Km）为1.90mM~(-1)s~(-1)；AtGUS(-△NP)-E的二级结构与AtGUS-E差异明显，叁级结构变化不明显。因此，我们可以得出非保守序列及其特性对于β-葡萄糖醛酸苷酶的催化特性以及蛋白质结构具有重要的作用。理性设计非保守序列氨基酸组成，对β-葡萄糖醛酸苷酶的定向进化具有重要意义。(本文来源于《天津大学》期刊2012-06-01）
罗翠平,李金华,谢烨明,曾万勇[7]（2012）在《cry基因保守序列克隆及其在大肠杆菌Rosetta(DE3)中的表达(英文)》一文中研究指出[目的]对 cry 基因保守序列进行克隆,并使其在大肠杆菌 Rosetta(DE3)中进行表达。[方法]根据 NCBI 数据库信息设计引物序列,采用PCR 技术从抗虫棉基因组 DNA 中扩增出抗虫基因 cry 的保守序列,构建重组载体并转化到大肠杆菌 Rosetta(DE3)菌株中,利用 pGEX 原核表达系统诱导蛋白表达。同时,分析了不同 IPTG 浓度及不同诱导时间对蛋白表达量的影响。[结果]扩增出抗虫基因 cry 的两段保守序列,长度分别为304 和 853 bp;SDSPAGE 检测结果显示,经 IPTG 诱导后重组质粒 pGEX4t1304 和 pGEX4t1853 成功地表达了大量 GST 融合蛋白,分子量分别为39 和 62.4 kDa,与预期结果一致;确定了 IPTG 最佳诱导浓度为 0.15 mmol/L,最佳诱导时间为 7 h。[结论]为今后检测转 Bt 基因农作物奠定了基础。(本文来源于《Agricultural Science & Technology》期刊2012年05期）
罗翠平,李金华,谢烨明,曾万勇[8]（2012）在《cry基因保守序列克隆及其在大肠杆菌Rosetta(DE3)中的表达》一文中研究指出[目的]对cry基因保守序列进行克隆,并使其在大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行表达。[方法]根据NCBI数据库信息设计引物序列,采用PCR技术从抗虫棉基因组DNA中扩增出抗虫基因cry的保守序列,构建重组载体并转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株中,利用pGEX原核表达系统诱导蛋白表达。同时,分析了不同IPTG浓度及不同诱导时间对蛋白表达量的影响。[结果]扩增出抗虫基因cry的两段保守序列,长度分别为304和853 bp;SDS-PAGE检测结果显示,经IPTG诱导后重组质粒pGEX-4t-1-304和pGEX-4t-1-853成功地表达了大量GST融合蛋白,分子量分别为39和62.4 kDa,与预期结果一致;确定了IPTG最佳诱导浓度为0.15 mmol/L,最佳诱导时间为7h。[结论]为今后检测转Bt基因农作物奠定了基础。(本文来源于《安徽农业科学》期刊2012年02期）
马冬芹[9]（2011）在《油葵PEPC基因保守序列的克隆及RNAi载体的构建》一文中研究指出油葵(Helianthus annuus L.)是我国五大油料作物之一,具有耐寒耐旱,耐盐碱耐瘠薄,适应性广,对土壤要求不高等特性。早在本世纪50年代,品质遗传学家就有报道称,油菜籽中蛋白质的含量与油脂含量呈高度的负相关关系,在其中起重要作用的关键酶则是磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)。现在在油菜和大豆上已经有PEPC敲除实例,其对产油量确实产生了一定的促进作用。鉴于油葵PEPC基因未知,本研究根据亲缘较近物种的PEPC基因同源克隆了油葵PEPC基因mRNA的部分序列,同源比对找到两个进化保守区,构建RNAi表达载体,以期能够提高油葵的含油量。本研究得到实验结果如下:(1)用同源克隆的方法得到了油葵PEPC基因以及mRNA的部分序列。由于油葵中对该基因的研究还没有报道,因此需要以此序列再到GENEBANK中进行比对。比对结果显示,所扩增片段与GENEBANK中其他物种PEPC序列同源性极高,尤其是与油葵同科植物黄花菊属和青蒿的同源性为最高,与黄花菊属中不同植物的PEPC基因相似度达到92%以上,说明所得序列可以判断为油葵PEPC基因部分序列。(2)在油葵PEPC基因中通过比对找到两个保守区,根据RNAi要求dsRNA的大小,以及pTCK-303载体中的酶切位点,设计引物,克隆这两个片段,并连入了T载体测序无误。分别正反向连入载体pTCK-303,成功构建油葵PEPC基因的RNAi载体pTCK303-FP1-RP1和pTCK303-FP2-RP2。(3)通过比较,确定油葵的组织培养植株再生的最佳外植体为茎尖周缘分生区。其愈伤诱导率和不定芽的诱导率都高于其他外植体。最佳不定芽诱导培养基为MS +IAA(0.03 mg·L~(-1))+6-BA(1.4～1.6 mg·L~(-1)),诱导率可达76.67%。在培养基1/2MS + NAA(0.3 mg·L~(-1))上进行生根培养,所有不定芽均可生根,且须根较多,利于组培苗的移栽成活。经过油葵花粉管通道法转化的探索,确定其可以得到阳性种子,为下一步研究奠定基础。(本文来源于《河北科技大学》期刊2011-05-01）
林碧英,钱昆,肖宇,胡鸢蕾[10]（2011）在《几种植物白藜芦醇合酶基因保守序列的克隆与分析》一文中研究指出克隆并分析几种植物中白藜芦醇合酶基因(resveratrol synthase,RS)的片段。根据GenBank中已知的RS基因保守序列设计引物,采用PCR技术从葡萄科植物(蛇葡萄、叁叶爬山虎、五叶爬山虎和云南爬山虎)、桑科植物(桑树)和豆科植物(花生)的幼嫩叶片中扩增出该基因的DNA片段。测序结果表明,片段长635bp,6个片段均不含内含子,分别编码211个氨基酸,均包含白藜芦醇合酶基因的特异片段和芪合酶(stilbene synthase,STS)家族特异性信号序列。利用DNAMAN软件构建系统进化树,结果显示这6种植物与GenBank中已发表的川鄂爬山虎的RS同源性高达94%。成功获得了6种植物的RS基因片段,并对其进行了同源性分析,为进一步克隆RS全长基因及分析其表达特性奠定基础。(本文来源于《中国农学通报》期刊2011年04期）
基因保守序列论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
背景结核病(TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)引起的传染性疾病。全球约1/3的人口感染MTB,其中约5-10%罹患活动性结核病,每年约900万例新增活动性肺结核报告。近年来,由于耐多药(MDR)和广泛耐药(XDR)菌株的流行、人类免疫缺陷病毒(HIV)与MTB伴发感染,使结核病成为死亡人数最高的传染病。传统结核病的治疗仍以基于抗生素的化疗为主,但由于疗程长、副作用大、以及耐药性等问题,导致结核病患者久治不愈、治疗效果欠佳。MTB属于胞内寄生菌,体液免疫难以对其发挥作用,抗结核感染的免疫机制主要是细胞免疫,作用最关键的是特异性CD4+Th和CD8+CTL。T细胞过继免疫治疗可以作为对结核免疫缺陷患者和耐药患者有效的治疗方法。T细胞过继免疫治疗是体外培养、扩增、并利用抗原特异T细胞表面受体(TCR)基因修饰T细胞,赋予T细胞抗原识别特异性,回输体内从而使机体获得大量效应T细胞,以发挥清除MTB作用。本研究所已证实MTB抗原特异TCR基因修饰的CD4+、CD8+T细胞在具有良好的抗结核活性。然而,自体T细胞过继免疫治疗适用范围窄,需针对病例个体进行结核特异性抗原刺激T细胞、筛选抗原特异T细胞,建立并筛选T细胞克隆、抗原特异性TCR构建、基因修饰T细胞等过程,其筛选的TCR基因不具有广泛适用性,仅针对个体适用,且周期长。有研究表明流感病毒、人类疱疹病毒(EBV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)和巨细胞病毒(CMV)等病毒感染的病例间可观察到TCR的偏好取用,即限制性取用特定α链可变区基因(Vα)、p链可变区基因(Vβ)或互补决定区3(CDR3)区序列,具有保守的TCR基因。这些保守TCR基因具有高活性及敏感性,对抑制病毒复制起到重要作用。在本研究中,通过CDR3谱型分析,找到86例结核初治患者中保守的CDR3序列,从GeneBank中获取高频使用V基因、J基因片段,以及C基因片段的序列,首次构建含CDR3保守序列的TCR,对其进行构象预测,进而构建了其重组逆转录病毒表达载体,制备重组逆转录病毒,转染2例结核患者CD4+和CD8+T细胞,分别与负载灭活H37Rv菌株的DC共培养,检测TCR基因修饰CD4+T细胞的增殖与IFN-γ、TNF-α、IL-4分泌水平,TCR基因修饰CD8+T细胞IFN-γ、 TNF-α、GrB分泌水平,及其对靶细胞的杀伤作用,证实含结核特异CDR3保守序列的TCR基因修饰的T细胞具有一定的抗结核活性。目的找到结核特异CDR3保守序列,构建含保守序列的TCR,研究其修饰患者T细胞的体外抗结核活性,为下一步动物实验奠定基础,为含结核特异CDR3保守序列的TCR基因修饰T细胞应用于结核患者群体化过继免疫治疗提供依据。方法1.通过CDR3谱型分析找到结核特异CDR3保守序列①采用淋巴细胞分离液分离结核患者和健康志愿者外周血单个核细胞(PBMC);②分别磁珠分选出CD4+、CD8+T细胞,提取CD4+和CD8+T细胞mRNA,逆转录为cDNA；③CDR3谱型分析检测CDR3谱型,并选择在CD4+、CD8+T细胞中,呈单克隆扩增的抗原特异TCR α、β基因家族测序分析,分析病例间结核特异CDR3保守序列及优势表达的V基因家族、J基因片段；④利用CDR3谱型复杂性评分系统对结核患者和健康志愿者进行评分,并比较差异；⑤利用相对复杂性评分系统分析结核患者间CDR3区基因多样性差异。2.构建含结核特异CDR3保守序列TCR基因的重组逆转录病毒表达载体①获取高频使用V基因片段,以及C基因片段的序列,构建含CDR3保守序列的TCR,对其进行构象预测,分析TCR a链和β链排列组合而成的异二聚体结构的稳定性,确定需构建的TCR基因：②根据人α链和β链基因家族可变区(variable region, V)和恒定区(constant region, C)基因序列设计引物,扩增含结核特异CDR3保守序列的TCR的α链和p链全长基因；③采用本实验室已经构建好的最小突变C区(其中C区9个氨基酸位点替换)替换α链和β链全长基因的C区：④利用重组PCR技术,将已最小突变TCRα链和β链基因通过自剪切多肽2A连接,并克隆至pGEM-T载体测序鉴定；⑤将测序正确的TCR全长基因插入逆转录病毒载体pMX-IRES-GFP,酶切鉴定；⑥采用磷酸钙转染法,包装逆转录病毒,超速离心法浓缩病毒；⑦重组病毒转染NIH3T3细胞,流式细胞术测定感染性滴度,计算公式：病毒感染滴度(IU/ml)=NIH3T3细胞总数×GFP阳性率/病毒浓缩液量(ml)。3.含结核特异CDR3保守序列TCR基因修饰T细胞的抗结核活性IL-2和抗CD3单抗活化T细胞后,以MOI=10将重组病毒pMX-β-2A-α-IRES-GFP转染T细胞,通过流式细胞术检测GFP阳性细胞百分比。按一定效靶比(effector:target, E:T),将TCR基因修饰T细胞与负载灭活H37Rv菌株的DC混合培养,以未转染和空载体转染的T细胞为阴性对照,以鸡卵白蛋白(ovalbumin, OVA)为非特异性抗原对照；酶联免疫吸附分析法(ELISA)检测一定时间TCR基因修饰CD4+T细胞培养上清中IFNγ、TNF-α、IL-4分泌水平,利用WST-8法检测TCR基因修饰CD4+T细胞的增殖：ELISA检测一定时间TCR基因修饰CD8+T细胞培养上清中IFNγ、TNF-α、GrB分泌水平,利用时间分辨荧光免疫分析技术(TRFIA)技术,检测TCR基因修饰CD8+T细胞对负载MTB的DC的杀伤活性。4.统计学分析利用配对T检验方法比较健康志愿者与结核患者CD4+、CD8+T细胞亚群的CDR3谱型复杂性评分：利用单因素方差分析比较3组结核患者病例组组间相对复杂性评分；利用多个独立样本非参数检验评估患者年龄、型别、卡介苗接种史、结核菌素皮肤试验、结核病史或接触史、吸烟状况、结核病种类间差异；利用斯皮尔曼相关性分析检测相对复杂性评分和疾病严重程度以及其他临床指标的相关性。CD4+T、CD8+T细胞的细胞因子分泌水平的差异、CD8+T杀伤率应用单因素方差分析(One-Way ANOVA),方差不齐时用Welch校正,各组间两两比较方差齐时采用LSD法,方差不齐时采用Dunnett's T3法,采用析因设计资料的方差分析CD4+T细胞增殖水平。检验水准a=0.05,双侧检验。采用SPSS 13.0 for windows统计软件包进行数据分析。结果1.通过CDR3谱型分析找到结核特异CDR3保守序列检测86例结核患者CDR3谱型,对单克隆增生T细胞进行TCR基因测序,结果显示：86例病例中V基因片段高频使用Va7 (43.02%). Va9 (48.84%)、Vα17 (50%)、Vα32(41.86%)、Vβ19(86.5%)、Vβ24 (62.79%)基因家族。分析其CDR3区基因序列,结果显示：J基因片段中Jα34, Jα57, Jβ2-1出现频率较高；Vα链和Vβ链CDR3区存在保守序列,其中TCR Vα链CDR3区中存在GGGGNKLI. GGGNEQYF. APDTGSGAF保守序列,TCR Vβ链中存在GGGNKLI、TNKUI、 SADKLI保守序列。2.构建含结核特异CDR3保守序列TCR基因的逆转录病毒表达载体从GeneBank中获取高频使用V、J基因片段、以及C基因片段的序列,将CDR3保守序列与V、J、C基因片段拼接成全长α、β链基因序列,并对α、β链随机搭配组合形成的TCR进行构象预测,选出稳定性较佳的TCR Vβ19. Va7双链。成功扩增出经最小突变的含有结核特异CDR3保守序列的TCRβ及a链全长基因,经TA克隆后测序,Vβ19、Va7基因序列与预期的V区序列完全一致,C区的基因序列与预期相符。利用自剪切多肽2A,通过重组PCR,扩增出T细胞的hVp 19mCβ-2 A-hVa7mC融合基因,将其插入pMX-IRES-GFP,构建重组逆转录病毒表达载体pMX-hVp19mCβ-2A-hVa7mCa-IRES-GFP,酶切鉴定证实基因片段插入正确。将其与包膜蛋白质粒VSV-G共转染包装细胞GP2-29 3,48h后取病毒上清,浓缩纯化后感染NIH3T3细胞,检测病毒感染滴度。3.检测含CDR3保守序列TCR基因修饰CD4+T细胞的抗结核活性①检测TCR基因修饰CD4+T细胞的IFN-γ、TNF-α、IL-4分泌按E：T=7,将含结核特异CDR3保守序列TCR基因修饰CD4+T细胞和负载灭活MTB的DC混合培养18h,ELISA检测上清中IFN-y的分泌水平。结果显示,患者1的Td+MTB组IFN-y分泌水平显着高于UnTd+DC组(P<0.001),略高于另外叁组但差异不显着；患者2的Td+MTB组IFN-y分泌水平显着高于其他各组(P<0.05)。按E：T=20,将含结核特异CDR3保守序列TCR基因修饰CD4+T细胞和负载灭活MTB的DC混合培养24h,ELISA检测上清中TNF-α的分泌水平。结果显示,2例患者Td+MTB组的TNF-a分泌水平均显着高于其他各组(P<0.001)。按E：T=15,将含结核特异CDR3保守序列TCR基因修饰CD4+T细胞和负载灭活MTB的DC混合培养24h, ELISA检测上清中IL-4的分泌水平。结果显示,患者1的Td+MTB组IL-4分泌水平显着低于UnTd+DC组、EmTd+MTB组和Td+OVA组(P<0.001),略低于UnTd+MTB组但差异不显着；患者2的Td+MTB组IL-4分泌水平显着低于其他各组(P<0.05)。②检测TCR基因修饰CD4+T细胞的增殖按E：T=7,将含结核特异CDR3保守序列TCR基因修饰CD4+T细胞和负载灭活MTB的DC混合培养,测定第7天各组CD4+T细胞的增殖水平。结果显示,患者1的Td+MTB组增殖水平显着高于UnTd+DC组和UnTd+MTB组(P<0.05),略高于其它两组但差异不显着；患者2各组间增殖水平无统计学差异(P>0.05),但Td+MTB组T细胞增殖水平略高于其它各组。4.检测含CDR3保守序列TCR基因修饰CD8+T细胞的抗结核活性①检测TCR基因修饰CD8+T细胞的IFN-γ、TNF-α、GrB分泌按E：T=7,将含结核特异CDR3保守序列TCR基因修饰CD8+T细胞和负载灭活MTB的DC混合培养18h, ELISA检测上清中IFN-y的分泌水平。结果显示,患者1的Td+MTB组IFN-γ分泌水平显著高于Td+OVA组(P<0.05),略高于其它叁组但差异不显着；患者2的Td+MTB组IFN-γ分泌水平显著高于其他各组(P<0.05)。按E：T=20,将含保守CDR3序列TCR基因修饰CD8+T细胞和负载灭活MTB的DC混合培养24h,ELISA检测上清中TNF-α的分泌水平。结果显示,患者1的Td+MTB组TNF-α分泌水平显著高于UnTd+DC组、UnTd+MTB组和Td+OVA组(P<0.05),略高于EmTd+MTB组但差异不显着；患者2的Td+MTB组TNF-α分泌水平显著高于其他各组(P<0.05)。按E：T=20,将含结核特异CDR3保守序列TCR基因修饰CD8+T细胞和负载灭活MTB的DC混合培养24h,ELISA检测上清中GrB的分泌水平。结果显示,患者1的Td+MTB组GrB分泌水平显着高于其他各组(P<0.001);患者2的Td+MTB组GrB分泌水平显着高于UnTd+DC组、UnTd+MTB组和Td+OVA组(P<0.05),略高于EmTd+MTB组但差异不显着。②检测TCR基因修饰CD8+T细胞的杀伤活性按E：T=30,将含结核特异CDR3保守序列TCR基因修饰CD8+T细胞和负载灭活MTB的DC混合培养,检测各组CD8+T细胞对靶细胞的杀伤作用。结果显示,患者1的Td+MTB组的杀伤率显着高于UnTd+DC组、UnTd+MTB组和EmTd+MTB组(P<0.05),略高于Td+OVA组但差异不显着；患者2的Td+MTB组的杀伤率显着高于其他各组(P<0.05)。结论在本研究中,通过CDR3谱型分析,找到86例结核初治患者中保守的CDR3序列,从GeneBank中获取高频使用V基因、J基因片段,以及C基因片段的序列,首次构建含CDR3保守序列的TCR,对其进行构象预测,进而构建了其重组逆转录病毒表达载体,制备重组逆转录病毒,转染2例结核患者CD4+和CD8+T细胞,证实其具有一定的体外抗结核活性,为含结核特异CDR3保守序列的TCR基因修饰T细胞应用于结核患者群体化过继免疫治疗奠定了基础。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
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