导读:本文包含了腺病毒包装论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:端粒酶,腺病毒,细胞重编程,载体构建
腺病毒包装论文文献综述
贺小英,荆乾鸽,姜欣颖,袁婷,吴宪[1]（2019）在《端粒酶基因的腺病毒包装条件优化及其活性功能验证》一文中研究指出【目的】构建携带人类端粒酶催化亚基基因(hTERT)的腺病毒载体并优化其包装条件,为进一步探究端粒酶与细胞重编程调控间的作用机理提供参考依据。【方法】利用腺病毒载体pAdEasy-1构建携带hTERT基因的重组腺病毒载体,分别采用脂质体法和电转法及不同浓度胎牛血清在HKE293A细胞中进行包装,筛选出最佳病毒包装条件,收集重组腺病毒rAd-hTERT并体外感染小鼠胎儿成纤维细胞,验证重组腺病毒rAd-hTERT的活性功能。【结果】以腺病毒载体pAdEasy-1为骨架质粒,成功构建获得携带hTERT基因的重组腺病毒载体(pAd-hTERT),其最佳病毒包装条件是采用脂质体法结合15%胎牛血清,此条件下收集获得的病毒滴度最高(1×1011IFU/mL)。以携带hTERT基因的腺病毒rAd-h TERT感染小鼠胎儿成纤维细胞72 h后,可扩增出片段大小约3450 bp的目的基因条带,即hTERT基因在小鼠胎儿成纤维细胞中成功表达。【结论】采用脂质体法结合15%胎牛血清包装获得的携带hTERT基因重组腺病毒具有较高病毒滴度,感染小鼠胎儿成纤维细胞能成功表达hTERT基因,进一步证实端粒酶具有蛋白功能的生物学活性。(本文来源于《南方农业学报》期刊2019年06期）
张本斯,李庄,卞思源,杨桂,李艳娇[2]（2018）在《携带EphrinA1-caspase-3基因的重组腺病毒载体的构建和包装》一文中研究指出目的:构建携带ephrinA1-caspase-3基因的重组腺病毒载体,通过包装、扩增、鉴定,为后续开展目的基因靶向治疗乳腺癌研究奠定基础。方法:以pMD18T-Casp3、pMD18T-EphrinA1为模板扩增caspase-3、EphrinA1基因,以pET28a为载体,通过双酶切、连接、转化、测序鉴定,构建pET28a-EphrinA1-Casp3。然后以质粒pEC3.1(+)为载体,获得pEC3.1-EphrinA1-Casp3。采用LR体外同源重组,构建pAd-EphrinA1-Casp3,以HEK293包装和放大培养。结果:成功将PCR扩增的EphrinA1胞外端基因和人活性型caspase-3基因定向克隆入质粒pET28a,并将EphrinA1-caspase-3融合基因转移到穿梭质粒pEC3.1(+),获得pEC3.1-EphrinA1-Casp3载体;经过体外同源重组,成功构建携带EphrinA1-caspase-3基因的重组腺病毒载体pAd-EphrinA1-Casp3;并在HEK 293细胞中完成包装和扩增;获得重组腺病毒rAd-EphrinA1-Casp3。结论:利用GatewayTM技术成功构建重组腺病毒载体pAd-EphrinA1-Casp3,经HEK293细胞包装,获得重组腺病毒rAdEphrinA1-Casp3。(本文来源于《解剖学杂志》期刊2018年04期）
涂文娟,朱彤,谈志丽,刘亮明[3]（2016）在《IRF3 shRNA腺病毒包装及其对RAW264.7细胞IRF3表达的抑制效应》一文中研究指出目的重组并包装干扰素调节因子3(interferon regulator factor 3,IRF3)短发夹RNA(short hairpin RNA,sh RNA)腺病毒,研究该病毒对RAW264.7细胞IRF3基因表达及对细胞增殖活性和吞噬功能的影响。方法采用酶切和连接方法构建p Adeno-U6-CMV-EGFP-IRF3 sh RNA质粒;借助Ad MaxTM病毒包装系统完成IRF3基因干扰腺病毒的重组与包装;IRF3基因表达分别采用real-time PCR和Western blot分析方法检测;RAW264.7细胞的增殖活性和吞噬功能分别采用CCK8分析和吞墨试验检测。结果 IRF3基因的干扰片段及对照序列被正确插入p Adeno-U6-CMV-EGFP质粒AgeⅠ和Eco RⅠ酶切位点之间,经PCR扩增及DNA测序证实;RAW264.7细胞组成性表达IRF3基因,针对IRF3基因后部序列的干扰腺病毒Y2147明显抑制了IRF3 m RNA和蛋白质的表达,而针对IRF3基因前部及中部序列及对照序的干扰腺病毒对IRF3的表达无明显沉默或封闭效应;腺病毒Y2147对RAW264.7细胞的增殖活性及吞噬功能无明显不良影响。结论成功构建并包装了IRF3 sh RNA腺病毒,该病毒能有效抑制RAW264.7细胞IRF3 m RNA和蛋白表达,且对细胞的增殖活性和吞噬能力无不良影响。(本文来源于《免疫学杂志》期刊2016年10期）
刘雷,黄星华,李坚伟,周建华,陈统权[4]（2016）在《DD3启动子调控TRAIL过表达载体的构建及腺病毒包装》一文中研究指出目的:构建DD3(PCA3)启动子调控的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体TRAIL过表达腺病毒载体,并对其进行病毒包装及滴度测定。方法:将DD3启动子用分子克隆技术替换掉穿梭质粒p HBAd-U6-GFP原有启动子U6,再用Age I单酶切将制备的重组质粒p HBAd-DD3-GFP线性化,将TRAIL基因片段克隆至线性化p HBAd-DD3-GFP上,经抗性筛选后PCR及测序鉴定为p HBAd-DD3-TRAIL载体。将其连同病毒骨架质粒p HBAd-BHG共同转染至HEK293细胞包装成病毒并扩增,测定病毒感染性滴度。结果:经PCR及测序验证证实成功构建DD3启动子调控的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体TRAIL过表达腺病毒载体p HBAd-DD3-TRAIL并包装扩增,病毒滴度为1.58×1010PFU/ml。结论:构建DD3启动子调控的凋亡配体TRAIL过表达重组腺病毒,可用于下一步在前列腺癌细胞中特异性地表达及诱导细胞凋亡杀伤靶细胞效应研究中。(本文来源于《现代肿瘤医学》期刊2016年17期）
蓝海兵,罗亮,齐协飞,龚园其,陈玉[5]（2016）在《重组MIF腺病毒载体的构建、包装与纯化及其意义》一文中研究指出目的采用分子生物学技术构建人巨噬细胞移动抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF)基因腺病毒表达载体,检测AD-MIF腺病毒转染人气道平滑肌细胞(airway smooth muscle cell,ASMC)后蛋白表达。方法用凝胶电泳、测序、Western blotting等方法鉴定MIF质粒。用PCR技术扩增MIF基因,构建MIF-EGFP基因载体,重组到p Ad腺病毒,转染HEK293细胞后扩增病毒,经3轮扩增后病毒达到合适的滴度,Western blotting检测到腺病毒感染的气道平滑肌细胞内MIF蛋白表达明显增高。结果凝胶电泳、测序和Western blotting检测MIF基因分子量、序列以及蛋白表达正确,并且成功构建MIF腺病毒,病毒浓度达2E+9PFU/ml。结论成功构建MIF腺病毒,为MIF基因治疗支气管哮喘提供了实验基础。(本文来源于《江西医药》期刊2016年06期）
赵芳[6]（2015）在《携带EGFP绿色荧光蛋白标记的腺病毒的构建及其在293A细胞中的包装与表达》一文中研究指出目的:构建显示EGFP绿色荧光蛋白的腺病毒质粒,在293细胞中包装表达重组腺病毒颗粒。方法:以p Eentry-Ghrh-P2A-EGFP为模板,双酶切出目的基因EGFP,将其与腺病毒穿梭载体Pentry-Trcp1连接为p Eentry-P2A-EGFP质粒;腺病毒骨架载体质粒PAd-DEST再与p Eentry-P2AEGFP质粒同源重组为PAd--P2A-EGFP质粒;用PEI介导转染将PAd--P2A-EGFP质粒转染到293A细胞,包装成重组腺病毒颗粒。结果:PAd--P2AEGFP转染到293A细胞中,合成荧光蛋白,荧光显微镜下细胞发绿色荧光。再次感染293A细胞,90%以上的细胞脱落,并且能见到绿色荧光。结论:显示EGFP绿色荧光蛋白的腺病毒载体构建成功,并能在293A细胞中完整包装成重组腺病毒颗粒,为研究腺病毒载体特性提供参考依据。(本文来源于《生物技术世界》期刊2015年12期）
张琼,姜碧杰,成功,刘扬,昝林森[7]（2015）在《秦川牛ADIG基因重组腺病毒过表达载体的构建与病毒包装》一文中研究指出【目的】构建秦川牛ADIG基因的重组腺病毒载体,包装并扩繁病毒,为下一步研究该基因在脂肪细胞分化过程中的分子作用机制和相关信号通路奠定基础。【方法】根据NCBI收录的家牛ADIG基因(NM_001113720.1)mRNA序列设计引物,以秦川牛组织样提取的总RNA反转录而成的cDNA为模板,通过RT-PCR和PCR扩增获得目的基因,将其连接到pMD19-T Simple载体并测序。质粒提取纯化后通过BglⅡ与SalⅠ双酶切,然后胶回收酶切产物,将其连接到穿梭载体pAdTrack/CMV上,构建重组穿梭质粒pAdTrack/CMV-ADIG。将pAdTrack/CMV-ADIG质粒用PmeⅠ酶切线性化,转化含有腺病毒骨架载体pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞中进行同源重组,构建重组腺病毒质粒pAD-ADIG,并用PacⅠ酶切鉴定,提取质粒后转化大肠杆菌Top10进行扩繁。用PacⅠ酶切线性化pAD-ADIG载体并回收质粒大片段,转染293A细胞进行病毒包装,然后完成病毒扩繁和病毒滴度的测定。【结果】PCR扩增获得了399bp ADIG基因CDS区;成功构建了重组穿梭质粒pAdTrack/CMVADIG和重组腺病毒质粒pAD-ADIG。经检测,ADIG重组腺病毒包装成功,扩繁后得到了高滴度的腺病毒(1×108PFU/mL)。【结论】成功构建了秦川牛ADIG基因的重组腺病毒表达载体pAD-ADIG,完成了病毒包装和扩繁。(本文来源于《西北农林科技大学学报(自然科学版)》期刊2015年08期）
王文彬[8]（2015）在《缺失E1区猪3型腺病毒包装细胞系的构建》一文中研究指出猪3型腺病毒(PAdV-3)于1964年从健康猪肠道首次分离。在猪用口服疫苗研究方面,PAdV-3在肠道嗜性、免疫原性和逃逸自身载体免疫方面,显着优于目前普遍使用的人5型腺病毒(HAdV-5)。此外,在人用疫苗研究方面,由于PAdV-3与HAdV-5无血清交叉反应,避免了人体普遍存在HAdV-5载体免疫的干扰和造成潜在的组织损伤,因此PAdV-3比HAdV-5也更具安全性。充分发挥PAdV-3以上优势的前提是具备缺失E1区猪3型腺病毒(PAdV-3ΔE1)的感染性克隆和高效包装细胞系。本实验室目前已拥有PAdV-3ΔE1感染性克隆,但是由于已报道包装PAdV-3ΔE1的细胞系VR1BL(稳定表达HAdV-5 E1和PAdV-3 E1Blarge的猪视网膜上皮细胞系)受到多达13项专利保护,因此,基于PAdV-3ΔE1的口服疫苗及基因递送系统研究受到了极大的限制。考虑到野生型PAdV-3除了可在VR1BL中增殖外,还可在猪睾丸(swine testicular,ST)细胞中高效增殖,本研究基于第二代重组慢病毒包装系统,构建可稳定表达PAdV-3 E1Blarge和I-SceI的细胞系——ST-E1-E1Blarge-ISceI。与专利保护的VR1BL细胞相比,ST-E1-E1Blarge-ISce I细胞可实现PAdV-3ΔE1的成功包装和高效增殖,病毒包装能力略低于VR1BL细胞,但96 h内病毒增殖能力比VR1BL细胞高100倍。本研究的主要内容和结果如下:1.第二代重组慢病毒的包装构建第二代慢病毒包装用克隆载体。在本实验室已构建的克隆载体的基础上,合成连接肽3HA-MCS1-2A-MCS2,将合成片段连接到克隆载体上构建成pTrip-CMV-3HA-MCS1-2A-MCS2-IRES-Hygro。在MSC1处插入3NLS-ISceI基因,在MSC2处插入His-E1Blarge基因序列。PCR、酶切鉴定及测序正确的载体,按照操作步骤将包装载体psPAX2、病毒衣壳载体pMD2.G、克隆载体共转染293T细胞,包装慢病毒后测定病毒滴度。进而从慢病毒抗性筛选和蛋白表达两个方面验证重组慢病毒包装成功。2.ST-E1-E1Blarge-ISceI细胞系的筛选10 MOI重组慢病毒转导ST-E1细胞,按照标准操作步骤进行潮霉素筛选细胞,连续筛选3轮后,挑取细胞单克隆传代培养,分别收集第5代、第10代和第30代细胞样品,用Western blot方法检测细胞中是否稳定表达PAdV-3 E1Blarge和I-SceI,分别用抗HA鼠单抗和抗His鼠单抗作为一抗。实验结果表明,ST-E1-E1Blarge-ISceI细胞筛选成功并能稳定表达PAdV-3 E1Blarge和I-SceI。3.检测PAdV-3ΔE1在VR1BL和ST-E1-E1Blarge-ISceI上拯救和增殖能力将本实验室已有的PAd V-3ΔE1基因组载体,经Pac I酶切线性化,使用Lipofectin reagent转染VR1BL和ST-E1-E1Blarge-ISceI细胞,包装E1区表达绿色荧光的PAdV-3病毒(PAdV219),观察转染效率和测定包装病毒的滴度。实验结果表明,本实验室筛选的细胞可以包装PAd V-3ΔE1,但病毒基因组转染效率和病毒包装效率略低于VR1BL细胞。在病毒增殖能力方面,72 h内本文构建细胞与VR1BL细胞具有相似增殖能力。但在72-96 h之间,由于本文构建细胞存活率仍接近50%,而VR1BL细胞全部脱落死亡,所以本文构建细胞病毒增殖滴度比VR1BL细胞高出100倍。综合以上实验结果表明,本实验室筛选细胞系具有高效PAdV-3ΔE1包装和增殖能力,并有望极大促进基于PAdV-3ΔE1口服载体疫苗和基因递送系统的研究。(本文来源于《西北农林科技大学》期刊2015-05-01）
张毅[9]（2015）在《Oct4、Sox2、C-Myc、Klf4-腺病毒载体的构建与包装及感染小鼠的胚胎成纤维细胞的实验研究》一文中研究指出背景：诱导性多能干细胞(Induced pluripotent stem cells, iPSCs)是选用某些特异的转录因子,将体细胞重编程为具有多能性的干细胞。由多种体细胞建立的iPSCs,如今已成为生命科学领域不可或缺的研究素材,其拥广阔的应用前景。本实验为提高iPSCs建系效率、降低诱导成本、把握质量控制关键点为参考条件,以促进其在临床应用中的发展。在分化的成体细胞表达的目的转录因子-Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc,并将其体细胞重编程为诱导多功能干细胞,这一革命性的研究策略很快吸引了公众和科学界的注意,是因为此技术很好的避免了干细胞应用中的伦理道德约束和免疫排斥问题。病人特异的iPSCs的应用为遗传性疾病和退行性疾病的临床治疗带来了新的希望。目的：(1)本实验构建携带Oct4. Sox2、Klf4、c-Myc四个目的基因的质粒,并通过质粒的提取和纯化成功包装能同时表达这4种转录因子的腺病毒(Adenovirus vector),并通过目的基因过表达腺病毒颗粒感染小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse embryonic fibroblasts MEF),目的在于探讨诱导多功能干细胞成功诱导提供方法。方法：(1)从携带Oct4、Sox2、C-Myc、Klf4的四个质粒中获取目的基因,然后将酶切线性化后的腺病毒载体与目的基因进行精准连接,利用酶切及PCR方法测定病毒载体的正确性,对培养出的阳性克隆予以序列检测,序列正确且一致表明成功构建质粒,并对质粒进行提取和纯化,观察病毒感染HEK293细胞二十四小时后的表达情况,测定病毒的功能及滴度。(2)用胰蛋白酶消化法在体外培养分离MEF,对MEF细胞的生长状态进行观察,用不同胎龄的小鼠,不同浓度胰蛋白酶作用时间对MEF培养的影响进行观察对比研究；(3)利用腺病毒空病毒颗粒感染MEF,并以不同MOI值腺病毒分别感染MEF,并得出感染最佳值。(4)将生长状态良好的MEF细胞随机分成a、b、c叁组,用携带目的基因的腺病毒感染a组、空病毒颗粒腺病毒感染b组、无病毒感染的c组,在倒置显微镜下观察期形态变化,最终得出最佳的实验条件。结果：(1)载体酶切线性化后成功与目的基因PCR酶切产物对接,其阳性克隆产物鉴定后证实腺病毒载建立成功,且测序结果与目标序列一致,腺病毒滴度为1×1010PFU/ml; (2)采用胰蛋白酶分次消化法培养MEF,13.5 d胎龄鼠胚的MEF分离培养为最佳,MEF培养24小时后大部分贴壁生长,细胞传代至第叁代较为旺盛。(3)摸索出腺病毒感染MEF的最佳区间为20-100,将携带目的基因感染组与正常对照组及空病毒感染组对比分析,a组细胞出现了由长梭形变成类似球形和不规则形生长,相同条件下b、c两组未出现明显变化。结论：本实验成功建立了高质量的Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4-腺病毒载体,并成功进行了MEF的原代及传代培养,并感染了小鼠胚胎成纤维细胞,观察诱导MEF的形态变化,探讨了iPSCs技术的关键问题。(本文来源于《四川医科大学》期刊2015-04-01）
李艳君,李永明,赵勇,田国忠,黄昕艳[10]（2014）在《包装重组腺病毒Adncam1及其体外转染神经干细胞》一文中研究指出目的构建腺病毒载体,将目的基因NCAM1转染入神经干细胞(NSCs)。方法制备重组质粒,完成后与大骨架质粒结合对293A细胞转染,包装成重组腺病毒载体Adncam1。对进行两次扩增,并检测滴度值。利用Adncam1转染NSCs,转染后应用QPCR、Western blot对NSCs中的NCAM1进行过表达鉴定。结果Adncam1包装成功,两次扩增后,检测滴度值为1×1010 PFU/m L。Adncam1对NSCs转染效果明显。进行过表达鉴定,QPCR检测Adncam1转染效果为对照转染的15倍以上,Western blot检测转染效果为3倍以上。结论重组腺病毒Ad Ncam1成功的将目的基因NCAM1转入NSCs。(本文来源于《解剖学研究》期刊2014年05期）
腺病毒包装论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
目的:构建携带ephrinA1-caspase-3基因的重组腺病毒载体,通过包装、扩增、鉴定,为后续开展目的基因靶向治疗乳腺癌研究奠定基础。方法:以pMD18T-Casp3、pMD18T-EphrinA1为模板扩增caspase-3、EphrinA1基因,以pET28a为载体,通过双酶切、连接、转化、测序鉴定,构建pET28a-EphrinA1-Casp3。然后以质粒pEC3.1(+)为载体,获得pEC3.1-EphrinA1-Casp3。采用LR体外同源重组,构建pAd-EphrinA1-Casp3,以HEK293包装和放大培养。结果:成功将PCR扩增的EphrinA1胞外端基因和人活性型caspase-3基因定向克隆入质粒pET28a,并将EphrinA1-caspase-3融合基因转移到穿梭质粒pEC3.1(+),获得pEC3.1-EphrinA1-Casp3载体;经过体外同源重组,成功构建携带EphrinA1-caspase-3基因的重组腺病毒载体pAd-EphrinA1-Casp3;并在HEK 293细胞中完成包装和扩增;获得重组腺病毒rAd-EphrinA1-Casp3。结论:利用GatewayTM技术成功构建重组腺病毒载体pAd-EphrinA1-Casp3,经HEK293细胞包装,获得重组腺病毒rAdEphrinA1-Casp3。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
腺病毒包装论文参考文献
[1].贺小英,荆乾鸽,姜欣颖,袁婷,吴宪.端粒酶基因的腺病毒包装条件优化及其活性功能验证[J].南方农业学报.2019
[2].张本斯,李庄,卞思源,杨桂,李艳娇.携带EphrinA1-caspase-3基因的重组腺病毒载体的构建和包装[J].解剖学杂志.2018
[3].涂文娟,朱彤,谈志丽,刘亮明.IRF3shRNA腺病毒包装及其对RAW264.7细胞IRF3表达的抑制效应[J].免疫学杂志.2016
[4].刘雷,黄星华,李坚伟,周建华,陈统权.DD3启动子调控TRAIL过表达载体的构建及腺病毒包装[J].现代肿瘤医学.2016
[5].蓝海兵,罗亮,齐协飞,龚园其,陈玉.重组MIF腺病毒载体的构建、包装与纯化及其意义[J].江西医药.2016
[6].赵芳.携带EGFP绿色荧光蛋白标记的腺病毒的构建及其在293A细胞中的包装与表达[J].生物技术世界.2015
[7].张琼,姜碧杰,成功,刘扬,昝林森.秦川牛ADIG基因重组腺病毒过表达载体的构建与病毒包装[J].西北农林科技大学学报(自然科学版).2015
[8].王文彬.缺失E1区猪3型腺病毒包装细胞系的构建[D].西北农林科技大学.2015
[9].张毅.Oct4、Sox2、C-Myc、Klf4-腺病毒载体的构建与包装及感染小鼠的胚胎成纤维细胞的实验研究[D].四川医科大学.2015
[10].李艳君,李永明,赵勇,田国忠,黄昕艳.包装重组腺病毒Adncam1及其体外转染神经干细胞[J].解剖学研究.2014