本文主要研究内容
作者余桂珍（2019）在《融合超噬热菌Pyrococcus furiosus红素氧还蛋白提高靶蛋白热稳定性的研究》一文中研究指出：热稳定性是功能蛋白储存和使用的重要限制因子,特别对酶蛋白来说至关重要。许多商业酶因耐热性不能达到工业生产的热处理条件(通常超过45℃)而无法被采用。另外,植物中与光合作用有关的关键酶也受高温抑制,从而导致农作物产量下降。因此,对酶蛋白进行分子改良以提高其热稳定性,进而提升其功效和扩大其应用范围,具有重要的现实意义。目前用于蛋白质分子改良以提高其热稳定性的分子生物学手段主要有两种:一种是化学工程策略(即化学修饰),另一种是基因工程策略(DNA突变和蛋白融合策略)。其中,蛋白融合策略已成为近年来提高目标蛋白可溶性和热稳定性的重要手段,并主要取决于具有明显功效的融合标签或接头。因此,本工作选取三种热稳定性差、易聚集但具有重要功能的酶蛋白(小桐子抗坏血酸过氧化物酶1即JcAPX1、大肠杆菌高丝氨酸-O-转琥珀酰酶即EcMetA、假单胞菌亚磷酸盐脱氢酶即PsPtx)作为靶蛋白,以检验来自超噬热菌Pyrococcus furiosus的小分子量红素氧还蛋白(Rubredoxin)即PfRub能否作为热稳定性融合接头,提高大肠杆菌重组表达靶蛋白的可溶性、热稳定性及其活性耐热能力。取得的主要结果如下:(1)融合接头PfRub的基因合成及其原核融合表达载体的构建首先通过引物互补延伸法合成PfRub的DNA片段,纯化后经Sal I和Xho I双酶切,分别插入到载体pET(JcAPX1)、pET(EcMetA)、pET(PsPtx)上靶蛋白基因3’端后的Xho I位点,构建了三种原核融合表达载体并通过测序验证。(2)融合PfRub可提高JcAPX1的可溶性、热稳定性及其酶活耐热性由SDS-PAGE的结果可以看出C-端融合PfRub可将JcAPX1的可溶性由12%提高到94%左右。从热稳定性分析的结果可以看出,融合PfRub能显著增强重组JcAPX1的热稳定性。同时,JcAPX胶活性染色和分光光度法酶活测定的结果表明,融合PfRub还能使JcAPX1的酶活耐热能力至少提高了3℃。(3)融合PfRub可提高EcMetA的可溶性和热稳定性及其重组大肠杆菌的耐热性同样,C-端融合PfRub能有效提高EcMetA的可溶性(至少提高了20%)和热稳定性。另外,由细菌梯度稀释点板实验发现,在高温(42℃、48℃、52℃)胁迫2 h后,EcMetA-PfRub重组大肠杆菌在M9基本培养基上的菌落生长状况明显好于含单独EcMetA的重组菌,表明融合PfRub还能有效提高EcMetA重组大肠杆菌菌株的耐热性。(4)融合PfRub可提高PsPtx的可溶性、热稳定性和酶活耐热性由SDS-PAGE分析结果可以看出,C-端添加PfRub接头显著增强了重组PsPtx蛋白的可溶性和热稳定性。同时,从胶活性染色结果可以看出,PfRub接头的添加还能有效保护PsPtx免遭热失活,而且通过更灵敏的分光光度法酶活测定分析证实可以使PsPtx的酶活耐热性至少提高12℃。综上,PfRub作为融合接头不仅能提高靶蛋白的可溶性和热稳定性,而且能保护靶蛋白免遭热失活并赋予其重组菌更好的耐热性。PfRub来自于超噬热菌Pyrococcus furiosus,它的这种热稳定作用可能归因于它本身超高的热稳定性及其对融合靶蛋白的分子内顺式传递。因此,本工作看来为采取融合策略提高目标蛋白的热稳定性及其应用方面提供了一条新的有效途径。特别提及的是,这种方法应该也适用于植物转基因研究,为提高植物耐高温胁迫提供了可能。
Abstract
re wen ding xing shi gong neng dan bai chu cun he shi yong de chong yao xian zhi yin zi ,te bie dui mei dan bai lai shui zhi guan chong yao 。hu duo shang ye mei yin nai re xing bu neng da dao gong ye sheng chan de re chu li tiao jian (tong chang chao guo 45℃)er mo fa bei cai yong 。ling wai ,zhi wu zhong yu guang ge zuo yong you guan de guan jian mei ye shou gao wen yi zhi ,cong er dao zhi nong zuo wu chan liang xia jiang 。yin ci ,dui mei dan bai jin hang fen zi gai liang yi di gao ji re wen ding xing ,jin er di sheng ji gong xiao he kuo da ji ying yong fan wei ,ju you chong yao de xian shi yi yi 。mu qian yong yu dan bai zhi fen zi gai liang yi di gao ji re wen ding xing de fen zi sheng wu xue shou duan zhu yao you liang chong :yi chong shi hua xue gong cheng ce lve (ji hua xue xiu shi ),ling yi chong shi ji yin gong cheng ce lve (DNAtu bian he dan bai rong ge ce lve )。ji zhong ,dan bai rong ge ce lve yi cheng wei jin nian lai di gao mu biao dan bai ke rong xing he re wen ding xing de chong yao shou duan ,bing zhu yao qu jue yu ju you ming xian gong xiao de rong ge biao qian huo jie tou 。yin ci ,ben gong zuo shua qu san chong re wen ding xing cha 、yi ju ji dan ju you chong yao gong neng de mei dan bai (xiao tong zi kang huai xie suan guo yang hua wu mei 1ji JcAPX1、da chang gan jun gao si an suan -O-zhuai hu po xian mei ji EcMetA、jia chan bao jun ya lin suan yan tuo qing mei ji PsPtx)zuo wei ba dan bai ,yi jian yan lai zi chao shi re jun Pyrococcus furiosusde xiao fen zi liang gong su yang hai dan bai (Rubredoxin)ji PfRubneng fou zuo wei re wen ding xing rong ge jie tou ,di gao da chang gan jun chong zu biao da ba dan bai de ke rong xing 、re wen ding xing ji ji huo xing nai re neng li 。qu de de zhu yao jie guo ru xia :(1)rong ge jie tou PfRubde ji yin ge cheng ji ji yuan he rong ge biao da zai ti de gou jian shou xian tong guo yin wu hu bu yan shen fa ge cheng PfRubde DNApian duan ,chun hua hou jing Sal Ihe Xho Ishuang mei qie ,fen bie cha ru dao zai ti pET(JcAPX1)、pET(EcMetA)、pET(PsPtx)shang ba dan bai ji yin 3’duan hou de Xho Iwei dian ,gou jian le san chong yuan he rong ge biao da zai ti bing tong guo ce xu yan zheng 。(2)rong ge PfRubke di gao JcAPX1de ke rong xing 、re wen ding xing ji ji mei huo nai re xing you SDS-PAGEde jie guo ke yi kan chu C-duan rong ge PfRubke jiang JcAPX1de ke rong xing you 12%di gao dao 94%zuo you 。cong re wen ding xing fen xi de jie guo ke yi kan chu ,rong ge PfRubneng xian zhe zeng jiang chong zu JcAPX1de re wen ding xing 。tong shi ,JcAPXjiao huo xing ran se he fen guang guang du fa mei huo ce ding de jie guo biao ming ,rong ge PfRubhai neng shi JcAPX1de mei huo nai re neng li zhi shao di gao le 3℃。(3)rong ge PfRubke di gao EcMetAde ke rong xing he re wen ding xing ji ji chong zu da chang gan jun de nai re xing tong yang ,C-duan rong ge PfRubneng you xiao di gao EcMetAde ke rong xing (zhi shao di gao le 20%)he re wen ding xing 。ling wai ,you xi jun ti du xi shi dian ban shi yan fa xian ,zai gao wen (42℃、48℃、52℃)xie pai 2 hhou ,EcMetA-PfRubchong zu da chang gan jun zai M9ji ben pei yang ji shang de jun la sheng chang zhuang kuang ming xian hao yu han chan du EcMetAde chong zu jun ,biao ming rong ge PfRubhai neng you xiao di gao EcMetAchong zu da chang gan jun jun zhu de nai re xing 。(4)rong ge PfRubke di gao PsPtxde ke rong xing 、re wen ding xing he mei huo nai re xing you SDS-PAGEfen xi jie guo ke yi kan chu ,C-duan tian jia PfRubjie tou xian zhe zeng jiang le chong zu PsPtxdan bai de ke rong xing he re wen ding xing 。tong shi ,cong jiao huo xing ran se jie guo ke yi kan chu ,PfRubjie tou de tian jia hai neng you xiao bao hu PsPtxmian zao re shi huo ,er ju tong guo geng ling min de fen guang guang du fa mei huo ce ding fen xi zheng shi ke yi shi PsPtxde mei huo nai re xing zhi shao di gao 12℃。zeng shang ,PfRubzuo wei rong ge jie tou bu jin neng di gao ba dan bai de ke rong xing he re wen ding xing ,er ju neng bao hu ba dan bai mian zao re shi huo bing fu yu ji chong zu jun geng hao de nai re xing 。PfRublai zi yu chao shi re jun Pyrococcus furiosus,ta de zhe chong re wen ding zuo yong ke neng gui yin yu ta ben shen chao gao de re wen ding xing ji ji dui rong ge ba dan bai de fen zi nei shun shi chuan di 。yin ci ,ben gong zuo kan lai wei cai qu rong ge ce lve di gao mu biao dan bai de re wen ding xing ji ji ying yong fang mian di gong le yi tiao xin de you xiao tu jing 。te bie di ji de shi ,zhe chong fang fa ying gai ye kuo yong yu zhi wu zhuai ji yin yan jiu ,wei di gao zhi wu nai gao wen xie pai di gong le ke neng 。
论文参考文献
论文详细介绍
论文作者分别是来自云南师范大学的余桂珍，发表于刊物云南师范大学2019-10-16论文，是一篇关于融合接头论文,热稳定性论文,超噬热菌论文,红素氧还蛋白论文,云南师范大学2019-10-16论文的文章。本文可供学术参考使用，各位学者可以免费参考阅读下载，文章观点不代表本站观点，资料来自云南师范大学2019-10-16论文网站，若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权，请联系我们删除。
标签：融合接头论文; 热稳定性论文; 超噬热菌论文; 红素氧还蛋白论文; 云南师范大学2019-10-16论文;