导读:本文包含了温和噬菌体论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:CRISPR-Cas9技术,抗生素耐药性,噬菌体杀菌技术,噬菌体包装技术
温和噬菌体论文文献综述
刘鸿博[1]（2019）在《利用温和噬菌体载体递呈CRISPR-Cas9系统靶向清除细菌耐药性的研究》一文中研究指出研究背景:近些年来,泛耐药菌和多重耐药菌的检出率不断上升,针对一线抗生素的耐药率逐渐升高。特别是随着超级耐药菌的出现,抗感染治疗面临无药可用的局面。细菌耐药性的快速流行已成为一个亟待解决的全球性卫生问题。耐药基因往往定位于细菌质粒,具备极强的跨菌种水平转移能力。目前针对泛耐药菌和超级耐药菌的治疗方式及其有限,尚无有效的技术手段阻断耐药性的扩散转移。耐药菌感染治疗、防控等领域亟需新技术和新策略。CRISPR-Cas9基因编辑技术来源于细菌的特异性免疫机制CRISPR系统,能够对目的DNA实现序列特异性的剪切。近年来已有研究报道将CRISPR系统包装至温和噬菌体中,通过噬菌体递呈CRISPR系统,致死性地剪切细菌靶基因。这些研究提供了利用CRISPR工具对抗耐药菌的思路,但还遗留很多缺陷。首先,之前的研究主要通过温和噬菌体递呈CRISPR靶向细菌染色体的策略进行杀菌,缺少靶向质粒策略抗耐药菌效果的深入分析,尤其缺少体内实验数据。其次,当前研究显示的噬菌体递呈CRISPR技术杀菌效力有限,远远低于传统的烈性噬菌体杀菌技术,达不到实用水平。另外,噬菌体包装技术需要改进以避免抗性筛选标记被引入包装后的噬菌体基因组,并提高包装噬菌体的效率和对新噬菌体的适用性。最后,以往研究只评价了1~2天内包装CRISPR-Cas噬菌体的抗菌能力,还需要在更长的观测时间里进行持续观测和分析。研究目的:细菌耐药性主要由耐药质粒进行介导和传播。利用原核CRISPR-Cas9基因编辑技术清除细菌耐药质粒,能够恢复抗生素的杀菌效力,并阻断细菌耐药性的传播。利用更加高效的原核载体技术,携带靶向细菌耐药质粒的CRISPR-Cas9系统更加高效的向耐药菌递呈,将大大增加该系统在抗耐药菌领域的实际应用潜力。本研究将建立CRISPR-Cas9高效清除细菌耐药性技术。设计并构建特异性CRISPR-Cas9系统来分析靶向清除NDM-1耐药质粒的效果。在此基础上,我们利用温和噬菌体作为CRISPR-Cas9系统的高效递呈载体。通过研发新型温和噬菌体包装CRISPR-Cas9技术,实现CRISPR系统的“一步法”包装,探索从温和噬菌体分离到完成包装的技术流程。利用噬菌体递呈CRISPR-Cas9系统,在一系列的体内外实验中检验细菌耐药性的清除效率,并分析联合抗生素抗耐药菌策略。通过持续监测对耐药菌生长的抑制效果,分析噬菌体递呈CRISPR-Cas9抗菌策略是否能避免新的细菌耐受突变的产生,是否具有比烈性噬菌体直接杀菌策略更加持久的抑菌效力。研究方法:建立针对超级耐药基因bla_(NDM-1)的CRISPR-Cas9靶点spacer文库,构建靶向NDM-1质粒的CRISPR-Cas9系统质粒。构建携带NDM-1质粒的耐药大肠杆菌模型,采用定量PCR及荧光信号检测等方法分析CRISPR-Cas9系统清除NDM-1质粒的效率,药敏实验检验耐药质粒清除后细菌耐药表型的变化。通过上述实验验证CRISPR-Cas9系统高效清除细菌耐药质粒的能力。设计引入抗性筛选的新型重组噬菌体筛选系统,建立“一步法”温和噬菌体整合CRISPR-Cas9技术。采用该包装技术改造一株新分离的大肠杆菌温和噬菌体,使其递呈CRISPR-Cas9系统,并靶向剪切携带bla_(NDM-1)靶点的质粒。利用包装CRISPR-Cas9噬菌体侵染携带靶质粒的大肠杆菌,分析噬菌体递呈的CRISPR-Cas9系统清除细菌耐药性的能力,包括PCR检测靶质粒的清除效果,定量PCR分析靶质粒清除效率,菌落计数法统计耐药细菌的敏感化率。利用包装CRISPR-Cas9噬菌体介入细菌耐药质粒的转化、接合等水平转移途径,评价噬菌体递呈CRISPR-Cas9系统清除细菌耐药质粒在阻断细菌耐药性传播扩散方面的效果。建立温和噬菌体递呈CRISPR-Cas9联合抗生素的抗耐药菌策略,在包括生物膜、小鼠皮肤感染模型、小鼠肠道感染模型等体内外条件下检验该策略的耐药性清除及耐药菌杀灭效力。对联合抗耐药菌策略的杀菌效力进行至少1周时间内的连续监测,观察是否会出现细菌对该策略的耐受突变,并和烈性噬菌体直接杀菌策略的耐受突变相比较。采用全基因组测序分析细菌产生噬菌体耐受突变的机制。研究结果:(1)建立了针对bla_(NDM-1)基因的CRISPR-Cas9系统靶点文库,包含20条特异性spacer序列。构建了靶向剪切bla_(NDM-1)基因的特异性原核CRISPR-Cas9系统质粒。(2)利用CRISPR-Cas9系统清除大肠杆菌的NDM-1质粒,使产NDM-1耐药模式菌变为bla_(NDM-1)阴性,恢复细菌对亚胺培南及其它β-内酰胺类抗生素的敏感性。(3)证明原核CRISPR-Cas9质粒转化耐药菌可以高效清除大肠杆菌中携带的NDM-1质粒。证明无论是天然的NDM-1大质粒还是重组NDM-1高拷贝质粒均可以在12 h内实现大于99%的细胞内清除率。(4)建立了新的噬菌体包装CRISPR-Cas9技术,首次探索完成了大肠杆菌温和噬菌体从分离测序到“一步法”包装CRISPR-Cas9系统的整套技术流程。(5)检验了噬菌体递呈CRISPR-Cas9系统在体外条件下清除靶质粒的效率,发现在8小时内能实现大于99%的耐药质粒清除率。提出利用噬菌体递呈CRISPR-Cas9清除细菌耐药性联合抗生素杀死耐药菌的策略,在体外实验中降低了约10~6倍的耐药大肠杆菌数量,优于已报道研究中所采用的细菌染色体靶向策略。(6)噬菌体递呈CRISPR-Cas9抗菌技术能够减少细菌耐药质粒在环境中的释放和积累,相比烈性噬菌体在8小时内减少了约98.7%的耐药质粒释放。噬菌体递呈CRISPR-Cas9抗菌技术可阻断耐药质粒在细菌间的接合转移,减少了98%的pNDM-1接合子菌落数量,抑制细菌耐药性的传播扩散。(7)首次在形成生物膜的耐药菌中评价噬菌体递呈CRISPR系统技术,并证明该技术能够在成熟生物膜中清除约50%的耐药质粒,将抗生素的最低生物膜清除浓度降低50%。(8)首次在体内实验中评价CRISPR靶向细菌耐药质粒的策略,噬菌体递呈CRISPR系统能够在小鼠皮肤感染模型和小鼠肠道感染模型中发挥清除细菌耐药质粒的作用并联合抗生素实现10~5~10~6倍的耐药大肠杆菌数的降低,效果优于已报道的CRISPR靶向细菌染色体策略。(9)在体外条件下进行长时间杀菌效果监测,烈性噬菌体杀菌策略在24小时内快速引发细菌的噬菌体耐受现象。而192小时内未观察到细菌对包装CRISPR-Cas9噬菌体联合抗生素杀菌策略的新耐受现象。体内条件下,在小鼠皮肤和肠道耐药菌感染模型中持续监测该策略,烈性噬菌体策略在2-3天内出现细菌的耐受,而7天内未观察到细菌对包装CRISPR-Cas9噬菌体联合抗生素杀菌策略的耐受。(10)通过对耐受突变株的全基因组测序,揭示大肠杆菌MG1655形成烈性噬菌体vB_253耐受的机制是在fepA基因位点出现碱基突变;大肠杆菌MG1655形成卡那霉素耐受的机制是在fusA基因位点出现碱基突变。而噬菌体递呈CRISPR-Cas9系统清除细菌耐药质粒联合抗生素杀菌的策略不会导致细菌出现上述基因突变。研究结论:本研究提出了利用噬菌体递呈CRISPR-Cas9系统清除细菌耐药性的策略。在方法学上新建了温和噬菌体“一步法”包装CRISPR-Cas9系统技术。利用噬菌体递呈CRISPR-Cas9系统高效靶向清除细菌耐药质粒的策略,破坏了介导细菌耐药性的质粒,阻断细菌耐药性的传播,降低菌群环境中的耐药基因水平,具备开发成为细菌耐药性防控新技术的潜力。在耐药菌治疗方面,噬菌体递呈CRISPR-Cas9清除细菌耐药性并联合应用抗生素在体内外一系列实验中实现了强大的杀灭耐药菌能力。该策略不仅解决了由耐药基因介导的细菌耐药性问题,使失效的抗生素疗法重新焕发生机,还避免了杀菌过程中可能出现的耐受突变,有望成为一种有效杀灭耐药菌的新方法,在抗耐药菌领域有巨大的应用潜力。(本文来源于《军事科学院》期刊2019-06-03）
张秀红[2]（2006）在《溶源性发酵乳杆菌及其温和噬菌体的研究》一文中研究指出酸奶是国内主要的发酵乳制品，由于具有多种保健功能而深受消费者的青睐。目前，酸奶的生产菌株除了常见的保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌外，还有双岐杆菌和嗜酸乳杆菌。为了进一步改善酸奶的保健功能，生产各种特色酸奶，很有必要对其它益生乳杆菌的生理特性进行详细研究。像乳酪发酵过程一样，酸奶生产也同样受到噬菌体的威胁。随着国内酸奶生产规模和种类的增加，噬菌体的危害也逐渐显现出来，甚至导致酸奶发酵的失败。但目前国内外对于酸奶生产菌株噬菌体的研究报道较少，国内尚处空白。鉴于上述情况，本论文重点对酸奶来源的乳杆菌及其噬菌体进行研究，以期为降低酸奶发酵过程中噬菌体的污染奠定理论基础。 本实验从国内20种不同品牌酸奶中分离到20株杆菌，经形态观察、革兰氏染色、过氧化氢酶反应等特性分析初步证明是乳杆菌。利用丝裂霉素C(MMC)诱导法，对上述20株乳杆菌进行溶源性检测，结果发现其中7株是溶源性菌株。诱导的噬菌体经过电镜观察发现，形态均呈典型的蝌蚪状，有六边形的头、长而非收缩性的尾，在噬菌体分类中属于有尾噬菌体目(Urovirales)、Siphoviredae科(指具有长而非收缩性尾)。经限制性内切酶分析，7个噬菌体的基因组DNA具有相同的限制性内切酶图谱，推断它们为同一种噬菌体，命名为φYB5，宿主菌为乳杆菌YB5。 通过SDS-PAGE对噬菌体φYB5外壳蛋白进行分析，得知其外壳蛋白的主要成分是一个分子量为31.9kDa的蛋白，同时对其包装机制的研究发现，该噬菌体的DNA包装机制为pac-型。进一步对溶源性菌株YB5及其相应的治愈菌株YB5-A生长特性比较，治愈菌株细胞多呈分散状排列，单个细胞稍长，菌落稍大；而溶源性菌株的细胞多聚为簇状，单个细胞略短，菌落也稍小一点，可能是前噬菌体的存在增加了溶源性菌株的代谢负担。 对溶源性菌株YB5进行16SrDNA基因测序鉴定。利用PCR扩增该菌株的(本文来源于《山东大学》期刊2006-10-18）
张秀红,孔健,曲音波[3]（2005）在《保加利亚乳杆菌温和噬菌体的分离及其生物学特性的研究》一文中研究指出本实验从20个不同品牌的酸奶中分离了20株保加利亚乳杆菌,经丝裂霉素C诱导后,对裂解液电镜观察,发出有7株为溶源性菌株,可诱导出噬菌体颗粒。这7个噬菌体颗粒具有小的等边体的头和非收缩性的尾.头部直径约为40nm,尾长约130nm。由限制性酶切图发现其具有相同的遗传特征,经SDS—PAGE检测其外壳蛋白,结果有一条主带约为31.9kDa.(本文来源于《中国资源生物技术与糖工程学术研讨会论文集》期刊2005-07-01）
张秀红,孔健,曲音波[4]（2005）在《中国市售酸奶中保加利亚乳杆菌温和噬菌体的分离及其分子生物学性质的研究》一文中研究指出乳酸菌由于在食品发酵中的经济重要性而受到极为普遍的关注。自1935年Whitehead和Cox首次报道了乳品发酵剂中的噬菌体问题以来,噬菌体污染就一直是困绕发酵乳品业及其他发酵工业的一大世界难题。噬菌体侵袭了乳品发酵剂乳酸菌后,使侵染菌体产酸力严重下降以至菌体破裂而导致发酵迟缓或发酵失败,给生产厂家造成巨大的经济损失。国际上对此进行的理论及应用技术的研究工作较多,并取得了很大进展。国内随着乳品业的快速发展,发酵乳制品的品牌和数量都在迅猛增长。噬菌体带来的问题也日渐严重。其中最引人关注的问题是噬菌体的污染来源及防治办法。许多学者认为溶源性乳酸菌是噬菌体污染的一个重要来源,同时也可能增加发酵剂的不稳定性,因此对乳酸菌温和性噬菌体的研究尤为迫切。(本文来源于《中国生物工程学会第四次会员代表大会暨学术讨论会论文摘要集》期刊2005-07-01）
杨水云,易全成,赵文明[5]（1998）在《酸碱度对温和噬菌体存活与吸附效率的影响》一文中研究指出实验测定了ｐＨ对Ｂａｃｉｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓｖａｒ．ｅｎｔｏｍｏｃｉｄｕｓ温和噬菌体ＴＰ３存活与吸附效率的影响作用。结果表明：在不同ｐＨ的介质中，ＴＰ３存活的能力相差很大；酸性介质及高碱性介质对ＴＰ３都有不同程度的瞬间灭活作用；ＴＰ３存活的最适ｐＨ为７．７，且适宜其存活的ｐＨ范围很窄；ｐＨ不同，ＴＰ３吸附到苏云金芽孢杆菌表面上的效率也不同，在ｐＨ≥９范围内，ｐＨ升高，吸附效率降低。(本文来源于《西北大学学报(自然科学版)》期刊1998年04期）
盛小禹,李育阳[6]（1991）在《地衣芽孢杆菌温和噬菌体的具有启动子功能片段的克隆》一文中研究指出载体pTG402与地衣芽孢杆菌噬菌体B1p7经限制酶酶切并连接后转化大肠杆菌。从全部转化子中抽提质粒DNA,转化枯草杆菌后经菌落原位显色选到22个有启动子功能片段的克隆子。利用邻苯二酚双加氧酶对底物的显色反应,测定了15个克隆子的启动子活性,并绘制了启动子功能最强的重组质粒的酶切图谱。此外,还测定了两个克隆子在枯草杆菌各个生长期的表达情况,发现在对数生长后期表达量大增,认为识别这两个启动子的σ因子可能是σ~(37)。(本文来源于《生物工程学报》期刊1991年01期）
郭兴华,贾士芳,门大鹏[7]（1990）在《以温和噬菌体ρ11为载体克隆α-淀粉酶基因》一文中研究指出温和噬菌体 p11 DNA 和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168染色体 DNA 用 BamH1酶消化和 T4 DNA 连接酶连接,转化到被噬菌体ρ11溶源化了的501菌株中,经过体内交换整入到染色体上,培养48小时后,从1020个菌落中挑出含 Arol~+-Amy~+基因的3个转化子,分别命名为ρ11Amy1、ρ11Amy2和ρ11Amy3。取ρ11Amy1 进行繁殖和丝裂霉素 C 诱导,诱导后的重组噬菌体用于测定噬斑形成能力和转导活性,提取其 DNA 再用于转化,均证明构建成了含淀粉酶基因的重组特异性转导噬菌体。(本文来源于《微生物学报》期刊1990年04期）
郭兴华,贾士芳[8]（1989）在《温和噬菌体ρ11的分离纯化及其DNA的提取》一文中研究指出枯草芽孢杆菌(Bacollus subtilis)温和噬菌体已广泛用于转导、转染、分子生物学和基因克隆等研究,但是它的分离和纯化尚有一定的困难。原因在于:1.和烈性噬菌体不同,高(本文来源于《微生物学通报》期刊1989年01期）
贾盘兴,徐星,余茂効[9]（1988）在《枯草芽孢杆菌AS1.398的温和噬菌体》一文中研究指出中性蛋白酶生产菌Bacillus subtilis AS1.398为双溶源菌,能产细菌素,经紫外线和丝裂霉素C诱导,分离到二株温和噬菌体BSL10和BSL11。电镜观察表明,二株噬菌体形态相似,均属长尾噬菌体科的成员,经EcoRI限制酶消解,将BSL10和BSL11分别切割成6和14个片段,经电泳方法测定其分子量分别为22.6kb和51.7kb。BSL10和BSL11DNA的G+C含量分别为65mol%和60.2mol%。两者蛋白经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测发现分别有3和4条主带。(本文来源于《微生物学报》期刊1988年01期）
贾盘兴,徐星,那淑敏,余茂効[10]（1987）在《碱性蛋白酶生产菌——地衣芽孢杆菌(B. licheniformis)的温和噬菌体》一文中研究指出碱性蛋白酶生产菌——地衣芽孢杆菌经丝裂霉素C或紫外线处理,均可诱导释放噬菌体,电镜观察表明噬菌体头部外廓呈六边形,有不收缩的尾部(头部40nm×40nm,尾部107×5,7nm),噬菌体BLL1 DNA对限制酶Eco R Ⅰ,HindⅢ和Bam H Ⅰ敏感,分别切割成8,15,和9个片段,经电泳法测定。噬菌体DNA分子量约相当于23.4kb,根据解链温度计算出噬菌体的G+C含量约为31.2摩尔％,噬菌体提纯的外壳蛋白经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳呈现5条主带,其分子量分别约为78000,72000,55000,39000,35000。(本文来源于《病毒学报》期刊1987年02期）
温和噬菌体论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
酸奶是国内主要的发酵乳制品，由于具有多种保健功能而深受消费者的青睐。目前，酸奶的生产菌株除了常见的保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌外，还有双岐杆菌和嗜酸乳杆菌。为了进一步改善酸奶的保健功能，生产各种特色酸奶，很有必要对其它益生乳杆菌的生理特性进行详细研究。像乳酪发酵过程一样，酸奶生产也同样受到噬菌体的威胁。随着国内酸奶生产规模和种类的增加，噬菌体的危害也逐渐显现出来，甚至导致酸奶发酵的失败。但目前国内外对于酸奶生产菌株噬菌体的研究报道较少，国内尚处空白。鉴于上述情况，本论文重点对酸奶来源的乳杆菌及其噬菌体进行研究，以期为降低酸奶发酵过程中噬菌体的污染奠定理论基础。 本实验从国内20种不同品牌酸奶中分离到20株杆菌，经形态观察、革兰氏染色、过氧化氢酶反应等特性分析初步证明是乳杆菌。利用丝裂霉素C(MMC)诱导法，对上述20株乳杆菌进行溶源性检测，结果发现其中7株是溶源性菌株。诱导的噬菌体经过电镜观察发现，形态均呈典型的蝌蚪状，有六边形的头、长而非收缩性的尾，在噬菌体分类中属于有尾噬菌体目(Urovirales)、Siphoviredae科(指具有长而非收缩性尾)。经限制性内切酶分析，7个噬菌体的基因组DNA具有相同的限制性内切酶图谱，推断它们为同一种噬菌体，命名为φYB5，宿主菌为乳杆菌YB5。 通过SDS-PAGE对噬菌体φYB5外壳蛋白进行分析，得知其外壳蛋白的主要成分是一个分子量为31.9kDa的蛋白，同时对其包装机制的研究发现，该噬菌体的DNA包装机制为pac-型。进一步对溶源性菌株YB5及其相应的治愈菌株YB5-A生长特性比较，治愈菌株细胞多呈分散状排列，单个细胞稍长，菌落稍大；而溶源性菌株的细胞多聚为簇状，单个细胞略短，菌落也稍小一点，可能是前噬菌体的存在增加了溶源性菌株的代谢负担。 对溶源性菌株YB5进行16SrDNA基因测序鉴定。利用PCR扩增该菌株的
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
温和噬菌体论文参考文献
[1].刘鸿博.利用温和噬菌体载体递呈CRISPR-Cas9系统靶向清除细菌耐药性的研究[D].军事科学院.2019
[2].张秀红.溶源性发酵乳杆菌及其温和噬菌体的研究[D].山东大学.2006
[3].张秀红,孔健,曲音波.保加利亚乳杆菌温和噬菌体的分离及其生物学特性的研究[C].中国资源生物技术与糖工程学术研讨会论文集.2005
[4].张秀红,孔健,曲音波.中国市售酸奶中保加利亚乳杆菌温和噬菌体的分离及其分子生物学性质的研究[C].中国生物工程学会第四次会员代表大会暨学术讨论会论文摘要集.2005
[5].杨水云,易全成,赵文明.酸碱度对温和噬菌体存活与吸附效率的影响[J].西北大学学报(自然科学版).1998
[6].盛小禹,李育阳.地衣芽孢杆菌温和噬菌体的具有启动子功能片段的克隆[J].生物工程学报.1991
[7].郭兴华,贾士芳,门大鹏.以温和噬菌体ρ11为载体克隆α-淀粉酶基因[J].微生物学报.1990
[8].郭兴华,贾士芳.温和噬菌体ρ11的分离纯化及其DNA的提取[J].微生物学通报.1989
[9].贾盘兴,徐星,余茂効.枯草芽孢杆菌AS1.398的温和噬菌体[J].微生物学报.1988
[10].贾盘兴,徐星,那淑敏,余茂効.碱性蛋白酶生产菌——地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)的温和噬菌体[J].病毒学报.1987
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