导读:本文包含了酶前药体系论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:linamarase,linamarin,自杀基因,酶-前药体系
酶前药体系论文文献综述
李军[1]（2009）在《新型自杀基因linamarase介导的酶—前药体系高效靶向治疗原发性肝癌的实验研究》一文中研究指出原发性肝癌是恶性程度最高的肿瘤之一,目前尚无根治方法。自杀基因疗法,又名基因介导的酶-前药疗法,能特异性提高药物在肿瘤中的浓度,并具备独特的旁观者效应,是肿瘤基因治疗的重要方法之一。本研究将木薯来源的linamarase(lis)引入肝癌基因治疗中,利用其水解前体药物linamarin(lin),并产生毒性代谢产物HCN的特性,从而实现对肝癌细胞的杀伤。通过建立lis稳转肝癌细胞系,发现其本身对细胞生长,细胞周期等特性并无影响。此外单独使用前体药物lin也未发现细胞毒性,从而提示了该策略的安全性。为提高目的基因的表达及针对肝癌的靶向性,我们以ViraPower?病毒载体系统为基础,分别构建CMV及AFP启动子转录的lis腺病毒载体。体外实验表明,含CMV启动子的腺病毒联合lin具备针对多种肿瘤细胞的强大抑制效应及旁观者效应。而含AFP启动子的病毒仅具备对AFP阳性肝癌细胞的特异性杀伤,从而体现了其针对肝癌的特异性和靶向性。动物实验提示lis能特异性表达于肝癌组织中,联合使用lin后能显着抑制肿瘤生长并延长动物存活时间。结果表明,lis/lin系统是一种潜在的肝癌基因治疗策略,值得进一步深入研究。目的:1.构建稳定转染lis基因的肝癌细胞系,实现lis酶在真核细胞中的活性表达,观察它对肿瘤细胞的体内、体外生物学特性的影响。初步了解lis基因及lin对肝癌细胞的作用;2.运用ViraPower?腺病毒载体系统,构建CMV启动子转录下的lis重组腺病毒载体,观察该病毒载体的感染效率及目的基因表达情况。应用重组病毒联合前体药物lin进行多种肿瘤细胞系的体内、体外治疗,探讨腺病毒载体介导的lis/lin系统的抑瘤效果及作用机理;3.克隆AFP启动子,检测其靶向转录活性。构建AFP启动子转录的lis重组腺病毒,通过体外实验及裸鼠荷瘤实验来检验该病毒前药体系针对AFP阳性肝癌细胞的特异性杀伤,实现lis/lin系统治疗原发性肝癌转录水平上的靶向调控。方法:1.PCR法从木薯cDNA中克隆并扩增lis cDNA,将该基因亚克隆至pcDNA3.1+质粒中,构建重组真核表达载体。脂质体转染及药物筛选相结合,构建稳定转染lis肝癌细胞系HepG2/lis。观察稳转细胞形态学变化,生长曲线,流氏细胞周期,裸鼠体内成瘤曲线等,并进行肿瘤细胞内lis酶活性分析。用不同浓度的lin培养HepG2细胞,观察lin本身对HepG2细胞生长的影响及细胞毒性;2.将lis cDNA亚克隆于ViraPower?腺病毒载体系统的入门克隆pENTRTM2B中,利用特异性LR反应将入门克隆中的lis导入腺病毒骨架载体pAd/CMV/V5-DEST中(含CMV启动子) ,获得重组病毒骨架载体pAd/CMV/lis。线性化骨架载体并转染293A细胞,包装重组腺病毒Ad-CMV-lis。扩增并纯化重组腺病毒,TCID50法测定它的滴度。利用含报告基因的腺病毒Ad-CMV-EGFP感染肿瘤细胞,摸索病毒的最佳感染复数。通过联合Ad-CMV-lis及前药lin进行多种肿瘤细胞系的体外及体内抑瘤实验,观查该系统的抑瘤活性及旁观者效应。用DNA片段化检测、Annexin-V/PI流式细胞分析、瘤组织病理学及TUNEL染色进一步探索lis/lin系统的抑瘤机理。3.RT-PCR法从HepG2(AFP+)细胞基因组中克隆并扩增AFP启动子,亚克隆入pEGFP-1质粒中,利用报告基因EGFP检测其特异性转录活性。用AFP启动子替换pcDNA3.1+质粒中的CMV启动子,然后将lis cDNA插入该质粒多克隆位点中,实现AFP启动子与lis的串联。通过构建病毒入门载体及LR反应,将AFP-lis序列定向克隆于pAd/PL-DEST腺病毒骨架载体中(不含启动子),获得骨架载体pAd/AFP/lis。将其转染293A细胞,包装重组腺病毒Ad-AFP-lis。重组病毒经扩增、纯化后,联合lin进行体内、体外抑瘤实验,验证该体系对AFP阳性肿瘤细胞的特异性及靶向性杀伤。结果:1.成功构建lis稳转肝癌细胞系HepG2/lis。发现它与空质粒转染组及空白对照细胞相比,在细胞形态,生长曲线,细胞周期分布,体内成瘤生长曲线等方面差异不显着(P>0.05)。HepG2/lis细胞给予lin后,能产生代谢产物HCN,并随lin浓度的增加而增多,提示lis酶在真核细胞中能以活性方式表达。此外单独使用lin对细胞生长并无抑制作用。2.成功构建重组腺病毒Ad-CMV-lis。联合应用lin后能在体内、体外有效抑制多种肿瘤细胞的生长,抑瘤作用与lin呈明显的时间、剂量依赖效应。肿瘤细胞治疗后经DNA片段化检测未发现典型的凋亡DNA ladder, Annexin-V/PI流式细胞分析提示经治疗后凋亡及坏死细胞均增高,但以坏死细胞增高为主。瘤组织病理学观察发现Ad-CMV-lis/lin治疗组中出现大量的坏死区,并发现较多的TUNEL阳性染色细胞。3.克隆并重组了276bp的AFP启动子。EGFP报告基因分析提示,该启动子具备AFP阳性肝癌细胞的特异性转录活性。成功构建AFP启动子转录下的重组腺病毒Ad-AFP-lis,实现了lis在AFP阳性肝癌细胞系中的高效特异性表达。体外及动物治疗实验均证明,该病毒联合lin治疗,能特异性抑制AFP阳性肝癌细胞系的生长,并延长动物存活时间,而对AFP阴性肝癌细胞系无杀伤效果。结论:1.植物来源的lis cDNA能稳定表达于真核细胞中,并能正确包装出类似大小,具备β-葡萄糖苷酶活性的lis蛋白。lis cDNA在细胞中的稳定整合对细胞形态、生长特性、细胞周期、成瘤性等生物学特点并无明显影响。而前体药物lin对细胞也具有低毒性,因此lis/lin系统是一种安全的自杀基因治疗策略。2.通过重组腺病毒载体,发现腺病毒具有靶细胞感染率及目的基因表达水平高,包装使用方便,病毒滴度高,不整合到宿主基因组中等优点,因此能作为lis/lin自杀基因治疗的高效表达载体。3.重组腺病毒Ad-CMV-lis在体内、体外均表现出对多种肿瘤细胞系的抑制作用,提示lis/lin自杀基因系统具备较广的治疗适用范围。由于不同肿瘤的生物学特点不同,因此该系统在其他肿瘤中的应用潜能有待于进一步研究。4. 276bp的AFP启动子能调控lis/lin系统在肝癌中的靶向性转录,实现针对AFP阳性肝癌细胞的特异性杀伤。然而由于原发性肝癌中有少部分呈AFP阴性表达,因此改造现有的AFP启动子,提高其针对AFP阴性的肝癌细胞的转录水平,是值得深入研究的问题。(本文来源于《第四军医大学》期刊2009-04-01）
陈建发,黄宗海[2]（2004）在《前药转换酶/前药体系的研究进展》一文中研究指出前药转换酶 /前药体系是自杀基因疗法的核心 ,关系到自杀基因疗法的成败 ,近年来得到深入研究。就前药转换酶 /前药体系的种类、作用机制和体外、体内实验结果等进行一综述(本文来源于《肿瘤防治杂志》期刊2004年04期）
酶前药体系论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
前药转换酶 /前药体系是自杀基因疗法的核心 ,关系到自杀基因疗法的成败 ,近年来得到深入研究。就前药转换酶 /前药体系的种类、作用机制和体外、体内实验结果等进行一综述
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
酶前药体系论文参考文献
[1].李军.新型自杀基因linamarase介导的酶—前药体系高效靶向治疗原发性肝癌的实验研究[D].第四军医大学.2009
[2].陈建发,黄宗海.前药转换酶/前药体系的研究进展[J].肿瘤防治杂志.2004
标签：linamarase; linamarin; 自杀基因; 酶-前药体系;