一、细粒棘球蚴95抗原基因的克隆及原核表达质粒的构建（论文文献综述）
王炜烨[1]（2020）在《细粒棘球绦虫TSP8、TSP11基因的原核表达及免疫学初步分析》文中指出目的:细粒棘球绦虫（Echinococcus granulosus,E.g）作为包虫病（hydatidosis）的主要病原体,给我国及世界各国造成了不计其数的危害,给人民群众造成了巨大的生命威胁。自了解包虫病以来,各国均采取积极手段研究对其的防治,因此包虫病的免疫预防就成为了当前研究的热点。基于此,研制针对宿主的包虫病长效保护疫苗,将对我国包虫病的防治起到促进作用。而截至目前,四跨膜蛋白（Tetraspanin,TSP）在广泛的细胞活动过程中起到重要作用,并已发现可对寄生虫宿主免疫互作及逃避起到积极作用,已经被发现可作为多种寄生虫宿主疫苗的候选蛋白。本研究将首次对E.g四跨膜蛋白TSP8、TSP11基因进行扩增及原核表达,并对其重组蛋白免疫小鼠体内的细胞因子及抗体水平进行检测,为研究四跨膜蛋白作为细粒棘球绦虫候选疫苗抗原奠定基础。方法:（1）细粒棘球绦虫四跨膜蛋白TSP8、TSP11全长基因的克隆及序列分析根据NCBI GeneBank中细粒棘球绦虫四跨膜蛋白TSP8、TSP11的全长基因,分别对其设计特异性引物,以细粒棘球绦虫的原头蚴cDNA为PCR模板进行扩增,并将PCR产物克隆至pMD19-T载体,送至测序,通过生物信息学软件分析预测TSP8、TSP11全长基因的结构与功能,并通过SYBR GreenⅠqRT-PCR方法分析TSP8、TSP11基因在E.g原头蚴以及成虫mRNA相对转录情况。（2）细粒棘球绦虫四跨膜蛋白TSP8、TSP11主要抗原基因的克隆及原核表达为成功编码表达细粒棘球绦虫四跨膜蛋白TSP8、TSP11基因,针对其主要抗原区域序列进行了特异性引物设计,对主要抗原区域片段进行克隆并测序。在测序正确的基础上,将目的片段与表达质粒pET-32a分别进行酶切与连接以及转化,建立pET-32a-TSP重组表达载体,并使用亲和层析柱法对其进行纯化、SDS-PAGE电泳对其进行鉴定及检测、Western blot免疫印迹法对其抗原性进行检测、以及通过免疫定位分析TSP8、TSP11蛋白在虫体的具体定位。（3）细粒棘球绦虫四跨膜蛋白TSP8、TSP11免疫学特性分析试验分为4组,重组蛋白TSP8、TSP11组与PBS、佐剂对照组,每组共15只小鼠,分别对试验组进行免疫,以每只小鼠500μg蛋白含量与弗氏佐剂进行等体积混合免疫,每隔15天免疫一次,共免疫4次。第一次免疫为弗氏完全佐剂混合免疫,其余为弗氏不完全佐剂混合免疫。每次免疫后,各组取三只小鼠尾部采血并收集血清,以q-PCR方法测定Th1型（IFN-γ、TNF-β）、Th2型（IL-4、IL-5、IL-6、IL-10）两类免疫反应共6种细胞因子随免疫时间的变化、以及采用ELISA法测定其抗体水平的变化。结果:1、成功克隆到细粒棘球绦虫TSP8基因全长序列,TSP8基因共含有669个核苷酸,编码蛋白含222个氨基酸,相对分子质量为24 KDa。预测TSP8基因共含有2个潜在的N端糖基化位点,包含2个蛋白激酶磷酸化位点。编码TSP8基因的氨基酸序列共含有5个跨膜区域,推测含有4个优势B抗原表位,且qRT-PCR结果显示TSP8基因在E.g原头蚴及成虫阶段均有表达,但在成虫阶段的表达水平较高,具有统计学差异（p<0.05）。2、经克隆获得TSP11全长基因,TSP基因全长765个核苷酸,编码蛋白含254个氨基酸,相对分子质量为29.02KDa,预测其含有3个潜在的N端糖基化位点、5个蛋白激酶磷酸化位点以及1个酪氨酸激酶磷酸化位点。编码TSP11基因的氨基酸序列共含有3个跨膜区域,推测含有7个优势B抗原表位。qRT-PCR显示其在E.g原头蚴及成虫阶段均有表达,无统计学显着差异（P>0.05）。3、重组蛋白Eg-TSP8、Eg-TSP11在免疫小鼠2周时,就可在小鼠血清中检测出特异性IgG抗体,并发现在随后的加强免疫中,血清中的特异性IgG抗体水平逐次升高,表明该重组蛋白能诱导小鼠体内产生特异性的抗体,具有比较好的免疫原性。重组蛋白Eg-TSP8在首免2周后,检测到脾组织中IL-5、IL-10相对于佐剂组与PBS组有较高水平表达（P<0.01）。而重组蛋白Eg-TSP11在第三次加强免疫后,能在脾组织中检测到细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-10水平,均比佐剂组与PBS有显着高水平表达（P<0.01）。可见,重组蛋白Eg-TSP11诱导小鼠产生了Th1/Th2免疫反应,而重组蛋白Eg-TSP8主要偏向于Th2免疫反应。结论:重组蛋白Eg-TSP8、Eg-TSP11均具有免疫原性,但Eg-TSP11蛋白相较于Eg-TSP8蛋白能刺激小鼠产生Th1型免疫应答,具有成为包虫病候选疫苗抗原的潜力。
王云菲[2]（2020）在《细粒棘球绦虫TSP14以及TSP33基因的克隆、原核表达以及免疫原性初步研究》文中提出包虫病是由中绦期细粒棘球绦虫引起的,该病在全球范围内均有分布,我国是该病高发的国家和地区之一。该病危害性大,患者10年病死率高达94%。防控措施以吡喹酮犬犬投药月月驱虫为主,尽管有效,但是在基层难以长期坚持,而且流浪狗难以管理;针对中间宿主的EG95疫苗对移行期内的病原防控有效,但是终末宿主与中间宿主数量比达到45:1,防控成本很高;因此,建立针对终末宿主有效的免疫预防方法是防控该病的一致研究方向。国内外研究表明,四跨膜蛋白家族（TSP）在寄生虫的研究中具有很好的免疫原价值,因此,本试验针对Eg-TSP14和Eg-TSP33进行了克隆、原核表达以及免疫原性初步研究,以期为Eg-TSP14和Eg-TSP33是否具有作为疫苗候选抗原的潜力提供理论基础。目的:克隆Eg-TSP14以及Eg-TSP33基因,并构建重组pET-32a-TSP14以及pET-32a-TSP33质粒,转化至大肠杆菌中进行原核表达,并将重组蛋白免疫小鼠对其免疫原性进行初步研究。方法:（1）以细粒棘球绦虫成虫、原头蚴和包囊壁的cDNA为模板,利用荧光定量PCR技术进行扩增,分析两个基因在虫体不同发育阶段的差异表达情况。（2）克隆Eg-TSP14以及Eg-TSP33基因,构建表达重组载体pET-32a-TSP14以及pET-32a-TSP33。构建成功的载体转化至大肠杆菌感受态细胞BL21中,加入IPTG进行诱导表达,将表达后的蛋白用Ni柱进行纯化并定量。（3）纯化后的蛋白进行Western Blot,验证其反应原性。（4）将重组蛋白免疫小鼠,收集小鼠脾脏和血清,荧光定量PCR测定细胞因子变化和间接ELISA法测定抗体变化。结果:（1）荧光定量PCR结果显示,Eg-TSP14在包囊壁以及原头蚴中有表达,在包囊壁中的表达量高于原头蚴中的表达量。Eg-TSP33基因在成虫、包囊壁、原头蚴中均有表达,在包囊壁中TSP33基因表达量高于原头蚴阶段和成虫阶段。（2）克隆后的Eg-TSP14大小为270bp,Eg-TSP33为420bp,构建好的重组载体经过双酶切鉴定后,进行IPTG诱导表达并进行SDS-PAGE,重组蛋白rEg-TSP14大小27kDa,重组蛋白rEg-TSP33大小为32kDa,与预期结果大小一致,表达形式分析结果显示两者均在沉淀中以包涵体的形式表达,纯化后的重组蛋白rEg-TSP14浓度为1.4mg/mL,重组蛋白rEg-TSP33浓度为1.7mg/mL。（3）Western blot结果显示,重组蛋白rEg-TSP14以及rEg-TSP33均可与犬阳性血清发生反应,具有良好的反应原性。（4）重组蛋白rEg-TSP14以及rEg-TSP33均可以引起小鼠血清抗体水平升高。（5）细胞因子检测结果显示rEg-TSP14可以引起Th2型细胞因子的变化,与对照组相比差异显着（P<0.05）,rEg-TSP33可引起Th1型细胞因子变化。结论:Eg-TSP14和Eg-TSP33分别能在虫体不同发育阶段表达,可能在虫体发育过程中起重要作用,对其免疫原性研究发现,两个蛋白均能诱导小鼠产生免疫反应。细胞因子监测点结果推测Eg-TSP33可能会增强宿主抗感染能力,有利于在感染早期将病原体清除,而Eg-TSP14则可能在E.g.免疫逃避中发挥作用,有利于E.g.在宿主体内建立感染。
刘垠鞠[3]（2020）在《应用TmAdh3重组抗原建立羊脑多头蚴病间接ELISA诊断方法的研究》文中指出脑多头蚴病（Cerebral coenurosis）俗称脑包虫病,是由多头带绦虫（Taenia multiceps）的幼虫脑多头蚴（Coenurus cerebralis）寄生在绵羊、山羊、牦牛等反刍动物脑部、脊髓中引起宿主发生脑炎、脑膜炎等神经机能障碍的一种严重的致死性人兽共患寄生虫病。由于脑多头蚴感染宿主初期时症状轻微经常被忽视,当发生神经症状被发现时往往都到了感染中晚期,对神经系统造成不可逆的损伤,难以治愈,导致动物死亡,给畜牧业带来严重的经济损失,因此脑多头蚴病的早期诊断对其防治至关重要。本研究以多头带绦虫重组蛋白TmAdh3为候选诊断抗原,重组蛋白TmPKA-C1、Tm7、TmGST为对照抗原建立了羊脑多头蚴病间接ELISA诊断方法。首先根据Tm7和TmGST基因设计引物,克隆构建了重组表达载体pGEX4T-Tm7和pET30a-TmGST,转化到宿主菌后诱导表达。同时对实验室前期构建的pET30a-TmPKA-C1和pGEX4T-TmAdh3重组表达菌进行诱导表达。结果成功表达出重组蛋白Tm7（33.0 ku）、TmGST（30.0 ku）、TmPKA-C1（42.0 ku）、TmAdh3（39.0 ku）,利用Western-blot分析重组蛋白TmAdh3、TmPKA-C1、Tm7、TmGST的反应原性,结果显示重组蛋白TmAdh3相较于其他3种重组蛋白可明显区分羊脑多头蚴阳性血清和健康阴性血清。对重组蛋白初步鉴定后,本研究分别以重组蛋白TmAdh3、TmPKA-C1、TmGST、Tm7作为抗原进行ELISA诊断方法的最适检测条件的摸索,对四种重组蛋白进行对比分析,重组蛋白TmAdh3作为检测抗原较其他蛋白有明显的区分性。以重组蛋白TmAdh3建立的间接ELISA方法敏感性可达83.3%（15/18）,与细粒棘球蚴阳性血清的交叉反应较低,特异性可达94.4%（17/18）。同时该重组蛋白作为诊断抗原可检测出少量脑多头蚴感染后14天的绵羊血清（1/9）,可检测出部分脑多头蚴感染后21天的绵羊血清（6/9）,可检测出全部脑多头蚴感染后28天的绵羊血清（9/9）。综上所述,本研究以TmAdh3重组蛋白作为抗原建立的羊脑多头蚴病间接ELISA诊断方法特异性和敏感性较高,具有脑多头蚴病早期诊断价值,有望应用于流行病学调查及动物检疫,本研究为早期诊断羊脑多头蚴病奠定了基础。
蔡其刚[4]（2019）在《青南儿童棘球蚴病调查分析及AE免疫学诊断、代谢组学研究》文中进行了进一步梳理棘球蚴病又称包虫病,是由棘球属绦虫的幼虫-棘球蚴寄生于人及其它动物的肝脏、肺脏等组织器官而引起的一种重要的人畜共患寄生虫病。青海省是全国罕见的棘球蚴病的高发区,流行区域主要分布于玉树藏族自治州和果洛藏族自治州各县。两型棘球蚴病（CE/AE）混合流行,且流行程度高、疫情严重。为了摸清青海南部地区儿童棘球蚴病的流行状况和流行特征、青海田鼠Em感染情况及其病原学特征、探索敏感性和特异性的早期诊断技术,本研究对青海南部地区儿童棘球蚴病的感染状况进行了调查分析研究;对青海省果洛藏族自治州久治县的青海田鼠进行了流行病学调查,并进行了Em青海田鼠株的分离、鉴定;利用分离、鉴定的青海田鼠株Em,表达和纯化了EmAgB3和EmAgB3-GGGS-Em18两个蛋白,并利用纯化的这两个蛋白分别进行了ELISA和胶体金免疫试纸条检测方法的探索;利用分离鉴定的Em青海田鼠株构建了Em沙鼠感染模型,并对构建的Em沙鼠感染模型进行了肝脏、脾脏和血浆代谢组学研究。主要研究结论如下:（1）通过采用影像学和血清学诊断方法,对青海南部地区儿童棘球蚴病感染状况进行了调查分析研究,明确了该区域儿童棘球蚴病的流行分布情况和特征。这对患棘球蚴病儿童采取早期诊断和制定最佳治疗方案,保障患病儿童尽早地正常生长发育具有重要的意义。同时,对于健康的儿童,也可以尽早地进行预防、保健及调理。（2）通过对青海省果洛藏族自治州久治县的青海田鼠进行流行病学调查,从捕获的50只青海田鼠中分离、鉴定得到了11株Em,Em感染率为22%。通过对其进行分子生物学分析,确定了Em青海田鼠分离株为亚洲型,且存在不同核苷酸位点的变异。该研究发现进一步确立了青海田鼠作为Em中间宿主在流行病学上的重要地位,这为在该地区通过控制青海田鼠的数量来降低人感染AE的风险提供了一个重要的思路。（3）通过提取Em青海田鼠分离株的基因组DNA,综合利用分子生物学和免疫学技术,克隆、表达和纯化了EmAgB3蛋白和EmAgB3-GGGS-Em18蛋白,获得了高纯度和高浓度的重组蛋白（EmAgB3蛋白的浓度为1.05 mg/mL,EmAgB3-GGGS-Em18蛋白浓度为0.5 mg/mL）。另外,通过利用3C酶酶切的方式,成功将重组EmAgB3蛋白的GST标签进行了切除。进行了纯化和蛋白复性,使其最大程度地恢复了天然EmAgB3蛋白的空间结构和生物学特性,为进一步对其进行更深入的结构、功能和应用研究奠定了物质基础。（4）通过对重组EmAgB3蛋白和重组EmAgB3-GGGS-Em18蛋白进行ELISA和胶体金试纸条技术的包装,分别建立了ELISA和胶体金免疫试纸条的诊断方法。经特异性、敏感性和符合性试验,均具有非常良好的临床诊断应用价值。（5）通过将分离鉴定的Em青海田鼠分离株进行腹腔接种沙鼠的方式,成功构建了Em沙鼠感染模型,感染率高达100%。这为将来进行更深入的针对Em青海田鼠分离株的生物学研究奠定了种子基础。（6）采集了Em沙鼠模型和正常沙鼠对照的肝脏、脾脏和血浆样本,利用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱分析技术,分别对采集的样本进行了非靶标代谢组学研究,筛选获得了数量众多的差异代谢物。肝脏代谢组学分析显示:在肝脏中检测到10493个代谢物,从中筛选出1509个差异代谢物。其中309个代谢物较正常肝脏代谢物上调,1200个代谢物下调;脾脏代谢组学分析显示:在脾脏中检测到8679个代谢物,从中筛选出1111个差异代谢物。其中586个代谢物较正常脾脏代谢物上调,525个代谢物下调;血浆代谢组学分析显示:在血浆中检测到4085个代谢物,从中筛选出316个差异代谢物。其中200个代谢物较正常血浆代谢物上调,116个代谢物下调。这些代谢组学的数据,为将来开展针对特异性代谢物的研究、筛选药物作用靶点和代谢通路提供了参考。
胡尊楠,马忠臣,何金科,徐明国,陈创夫,王震[5]（2019）在《细粒棘球绦虫Eg95-5蛋白生物信息学分析及鉴定》文中指出为了制备一定纯度和浓度细粒棘球绦虫（Echinococcus granulosus, Eg）Eg95-5蛋白,进一步开发新型疫苗和建立新的疾病诊断方法,试验采用生物信息学分析、pMD19-T-Eg95-5与pET30a-Eg95-5载体的构建、Eg95-5蛋白诱导表达及纯化、免疫印迹技术（Western-blot）对Eg95-5蛋白序列和反应原性进行研究。结果表明:Eg95-5蛋白无信号肽和跨膜结构,蛋白含有6个抗原决定簇和12个磷酸化位点,二级结构以无规则卷曲（39.25%）、延伸链（33.64%）和α-螺旋（21.50%）为主,并获得了Eg95-5的三级结构模型;成功克隆并构建Eg95-5重组表达载体,获得了高纯度的Eg95-5蛋白,该蛋白可与患病动物血清发生特异性反应。说明Eg95-5蛋白结构较为保守,是无信号肽和非跨膜蛋白,作为抗原可以引起良好的免疫反应。
王凝[6]（2018）在《细粒棘球绦虫不育囊形成相关基因的分子特征及功能的初步研究》文中进行了进一步梳理细粒棘球绦虫的中绦期幼虫可引起人和多种动物的细粒棘球蚴病,又称为囊型包虫病。该病是一种危害严重的人畜共患寄生虫病,呈世界性广泛分布,在我国造成了巨大的经济损失和严重的公共卫生问题。细粒棘球蚴在中间宿主体内可形成不育囊,不育囊内没有原头蚴,故不能感染终末宿主而使其生活史终结,但仍能对宿主组织器官造成严重的病理损害。目前,对细粒棘球蚴在中间宿主体内形成不育囊这一特殊生物学现象的相关研究仍较少,导致其形成的因素和调控机制以及参与调控的基因尚不明确。本研究扩增并表达了细粒棘球绦虫Bcl-2相关抗凋亡蛋白3（Eg-BAG3）、内吞蛋白B1（Eg-EB1）、线粒体分裂蛋白1（Eg-Fis1）、程序性死亡因子6（Eg-PDCD6）以及柠檬酸合成酶（Eg-CS）,对其蛋白特性进行了研究,探讨其功能和在不育囊形成中的作用。主要的工作和研究结果如下:1.细粒棘球绦虫BAG3和EB1基因的特征分析及其在不育囊形成中的作用在本研究中,细粒棘球绦虫BAG3和EB1基因被成功克隆并表达。Eg-BAG3基因编码232个氨基酸,Eg-EB1基因编码252个氨基酸。荧光免疫定位分析显示,Eg-BAG3广泛地分布于细粒棘球绦虫不同的发育时期,主要定位于包囊壁生发层,原头蚴的表皮和实质区,成虫的表皮和实质区;而Eg-EB1仅定位于包囊壁生发层,原头蚴的表皮和实质区。通过对H2O2处理后原头蚴的Eg-BAG3和Eg-EB1基因表达谱进行分析,发现原头蚴发生明显凋亡现象,而Eg-BAG3和Eg-EB1的m RNA表达水平随着H2O2处理时间的增加而明显上升,推测Eg-BAG3和Eg-EB1蛋白可能均在细粒棘球蚴对抗氧化应激所导致的细胞凋亡中起到作用。为了深入探讨Eg-BAG3和Eg-EB1蛋白对细粒棘球蚴细胞凋亡的功能,本研究应用RNA干扰技术沉默目的基因,进而测定原头蚴细胞凋亡率的变化。实验结果表明,Eg-BAG3基因干扰组原头蚴的凋亡率明显高于未干扰组,而Eg-EB1基因干扰组原头蚴的凋亡率则较低,这说明Eg-BAG3基因表达量的减少会促进细胞凋亡,而Eg-EB1表达量的减少则会降低细粒棘球蚴的凋亡现象。综上所述,Eg-BAG3和Eg-EB1蛋白参与调节不育囊的形成。Eg-BAG3通过抵御氧化应激诱导的细胞凋亡而维持包囊的可育性;Eg-EB1则促进氧化损伤而触发细胞凋亡,从而进一步诱导不育囊的形成。2.细粒棘球绦虫Fis1和PDCD6基因的克隆表达及蛋白功能的初步研究本研究以细粒棘球绦虫原头蚴的c DNA为模板扩增出Eg-Fis1和Eg-PDCD6基因,并将其进行原核表达和蛋白特性分析。Eg-Fis1基因编码157个氨基酸,具有一个跨膜区,该跨膜区与其功能密切相关;Eg-PDCD6基因编码174个氨基酸,该基因在物种间具有较高的保守性。经Western blot分析,重组蛋白r Eg-Fis1和r Eg-PDCD6均具有较好的反应原性。荧光免疫定位分析显示,Eg-Fis1和Eg-PDCD6都广泛地分布于细粒棘球绦虫原头蚴、生发层以及成虫实质区。原头蚴经H2O2氧化处理后,Eg-Fis1和Eg-PDCD6的m RNA相对表达量均从H2O2处理后即开始上调,8h后表达量最高,但Eg-PDCD6的表达量较Eg-Fis1上升缓慢,这可能是在原头蚴应对氧化应激时,Eg-PDCD6并不起主要作用。为探究Eg-Fis1和Eg-PDCD6在调控氧化应激所导致的细胞凋亡中的作用,我们采用RNA干扰法抑制目的基因的表达并用TUNEL法来检测原头蚴细胞凋亡的情况,在Eg-Fis1干扰组,原头蚴检测出的荧光信号低于未干扰组,说明Eg-Fis1蛋白表达量的减少会降低细粒棘球蚴的细胞凋亡现象;然而,在Eg-PDCD6干扰组,原头蚴检测出的荧光信号和未干扰组差异较小,未发生明显变化。因此我们推断,Eg-Fis1蛋白通过促进氧化损伤而触发细胞凋亡,从而进一步诱导不育囊的形成;而Eg-PDCD6不是其细胞凋亡过程中关键的调控基因。3.细粒棘球绦虫柠檬酸合成酶的分子特征与生物学特性分析在本研究中,细粒棘球绦虫柠檬酸合成酶首次被克隆、表达和特性分析。研究发现,Eg-CS基因编码466个氨基酸,CS基因在物种之间有着较高的保守性。Western blot分析,发现r Eg-CS能够被绵羊包虫病阳性血清和兔抗高免血清特异性的识别,说明该蛋白具有较好的反应原性。通过对Eg-CS在细粒棘球绦不同发育时期的免疫荧光定位分析发现,Eg-CS主要定位于可育囊与不育囊包囊壁生发层,原头蚴的表皮和实质区,成虫的表皮和实质区,提示Eg-CS在细粒棘球绦虫的生长发育以及生理活动中起重要作用。本研究利用H2O2对原头蚴进行氧化处理,诱导其产生凋亡,通过观察Eg-CS相对表达量的变化,发现Eg-CS的m RNA相对表达量在H2O2处理2 h后先上升,之后随着处理时间的增加而逐渐下降。Eg-CS相对表达量在凋亡发生时的升高,说明凋亡是一主动、耗能的过程。随着死亡细胞的增多,所需代谢也逐渐降低,因此Eg-CS的m RNA相对表达量也相对下降,而Eg-CS表达量的降低又进一步促进原头蚴的凋亡。综上所述,柠檬酸合成酶作为代谢途径的关键酶,在细粒绦虫体内起到了重要作用,并且可能维持包囊的可育性,而Eg-CS含量的降低,可能会导致不育囊的形成。此外,本试验采用间接ELISA法评价了r Eg-CS蛋白的诊断效果,结果显示r Eg-CS对绵羊包虫病有较高的敏感性（93.55%）和特异性（80.49%）,但与山羊细颈囊尾蚴阳性血清和绵羊脑包虫阳性血清交叉反应严重,说明r Eg-CS蛋白不合适作为绵羊细粒棘球蚴病的诊断抗原。
朵红[7]（2016）在《棘球蚴病疫苗研究进展》文中进行了进一步梳理棘球蚴病是一种重要的人兽共患病,严重阻碍着畜牧业经济的发展和人民的身体健康,已成为我国西部地区重要的公共卫生问题。长期以来科研工作者在棘球蚴病疫苗研究方面做了大量的工作,已有商品化的疫苗应用于畜牧业生产中。本文对棘球蚴病的基因工程疫苗、核酸疫苗、多肽疫苗的研究现状和进展进行了综述。
李宏民,娄忠子,李立,李振华,李建秋,闫鸿斌,贾万忠[8]（2014）在《棘球蚴EG95重组蛋白研究进展》文中研究指明棘球蚴病是一种对人畜危害极为严重的人兽共患寄生虫病,严重威胁我国流行区农牧民身体健康和畜牧业的发展,对该病的预防迫在眉睫。EG95蛋白在细粒棘球蚴发育过程中必不可少、高度保守,是目前为止已发现的最具潜力的疫苗候选抗原之一。国内外学者在EG95重组抗原的构建、表达、应用等方面进行了大量的工作,本文对其进行综述。
李文桂[9]（2014）在《细粒棘球绦虫Eg95疫苗的研制现状》文中提出囊型棘球蚴病是一种严重危害人类健康的人兽共患寄生虫病,采用疫苗防治该病是当前研究的热点领域之一。Eg95是一种有效的疫苗候选分子,其疫苗种类有重组抗原、合成肽疫苗、DNA疫苗、重组酵母、重组牛痘病毒疫苗、重组BCG疫苗、转基因苜蓿疫苗和重组双歧杆菌疫苗等。
陈林[10]（2013）在《豆状带绦虫密码子分析与四个功能基因的研究》文中研究说明豆状带绦虫呈世界性分布,成虫寄生于犬、狐狸等终末宿主的小肠,其中绦期幼虫-----豆状囊尾蚴寄生于家兔等兔形目动物的肝脏被膜、肠系膜及大网膜等处,引起家兔的豆状囊尾蚴病。我国是养兔大国,豆状囊尾蚴病流行于24个省区,是家兔的主要寄生虫病之一。本论文在前人研究工作的基础上,进一步对豆状带绦虫生物学、密码子使用情况及功能基因进行了分析和研究,为兔豆状囊尾蚴病诊断试剂及基因工程疫苗的研究提供候选抗原。主要研究内容与结果如下：1、豆状带绦虫生物学研究观察并记录了5只实验犬在人工感染豆状囊尾蚴后的节片排出特征及虫卵感染家兔后豆状囊尾蚴在兔体内的分布特点,结果显示：5只犬在感染豆状囊尾蚴后的第39～57d开始排出节片,最多一天排出158片。孕节中虫卵含量在60～26,480个之间。平均虫卵大小为（41.32±4.53）μm ×（36.23±4.92）μm。虫卵孵化大约需要4～5min。6只健康家兔每只经口感染5000个虫卵,感染后第55d剖杀。检测发现,豆状囊尾蚴主要寄生部位为兔的胃大网膜和直肠浆膜,肝脏被膜数量则较少。2、豆状带绦虫转录组和包括豆状带绦虫在内的43个扁形动物（吸虫和绦虫）线粒体全基因组密码子偏好性分析利用豆状带绦虫转录组数据库中已注释的8118个重构基因进行了同义密码子使用情况的分析,发现：平均GC含量为49.48%；24个密码子被定义为最优密码子,几乎所有的最优密码子（除CGU外）都以G或C结尾；对应分析中,基因在主轴上与对应的第三位密码子GC含量成正相关,同时编码蛋白基因的表达水平、疏水性及芳香性与有效密码子数（ENC）显着相关。对豆状带绦虫等43个扁形动物（吸虫与绦虫）线粒体基因组密码子偏好性分析发现：19个吸虫纲动物的GC3s平均为0.254±0.044；被测绦虫纲动物GC3s平均为0.254±0.044。四重简并密码子家族碱基组成分析表明：第三位密码子U（51.9%）或A（22.7%）的含量要高C（6.3%）或G（19.14%）的含量；包括UUU, UUA及UUG等,24个密码子是高频使用的密码子；ENC-plot图显示,大多数的点分布在期望ENC曲线的下方或周围；在43个扁形动物中,线粒体蛋白编码基因的核酸组成、基因的疏水性和芳香性都与同义密码子的偏好使用有关。3、豆状带绦虫六钩蚴Tp-UBC2基因的原核表达及重组表达蛋白的功能研究从豆状带绦虫六钩蚴的cDNA中扩增了Tp-UBC2基因。Tp-UBC2开放阅读框全长444bp,编码147个氨基酸。构建了其原核表达载体pET32a-Tp-UBC2,表达的重组蛋白分子量为36.63kDa。经免疫印迹检测,该重组蛋白能与家兔豆状囊尾蚴病阳性血清特异性结合。以80μg纯化的Tp-UBC2重组蛋白及皂素佐剂皮下免疫兔,免疫后7d加强1次,第2次免疫后14d用5000枚豆状带绦虫虫卵口服感染,感染后50d剖检,重组蛋白的减虫率为79.3%。以重组蛋白rTp-UBC2作为包被抗原建立的兔豆状囊尾蚴病Dot-ELISA诊断方法,对226份兔血清的检测结果显示有较高的敏感性（83.3～97.6%）和特异性（88.8-98.4%）。4.豆状带绦虫六钩蚴Tpl基因的原核表达及Dot-ELISA诊断方法的建立。采用RACE技术从豆状带绦虫六钩蚴中扩增出了Tpl基因,Tpl基因全长684bp,编码227个氨基酸,构建了pET32a-Tp1原核表达载体,经IPTG诱导获得分子量约为45.8kDa的重组蛋白。该重组蛋白能与家兔豆状囊尾蚴病阳性血清特异性结合。以重组蛋白Tp1作为包被抗原建立的兔豆状囊尾蚴病Dot-ELISA诊断方法对226份兔血清进行了检测,具有较高的敏感性（92.9～97.6%）和特异性（95.2～98.4%）。5.豆状带绦虫六钩蚴Tp-dUTPase基因的原核表达及Dot-ELISA诊断方法的建立采用PCR方法从豆状带绦虫六钩蚴中扩增得到Tp-dUTPase基因,编码区序列长447bp,编码148个氨基酸。构建了pET32a-Tp-dUTPase原核表达载体,表达的重组蛋白分子量为36.20kDa。该重组蛋白能与家兔豆状囊尾蚴病阳性血清特异性结合。以重组蛋白dUTPase作为包被抗原建立了兔豆状囊尾蚴病Dot-ELISA诊断方法,对226份兔血清进行了检测,结果显示有较高的敏感性（85.7～92.9%）和特异性（86.4～88.0%）。6.豆状带绦虫六钩蚴Tp-TSP2基因生物信息学分析采用PCR方法,从豆状带绦虫六钩蚴中扩增了Tp-TSP2基因,并构建了pET32a-Tp-TSP2原核表达载体。Tp-TSP2基因编码区长621bp,编码206个氨基酸。预测该重组蛋白的相对分子量为52.40kDa,pI值为5.18,有2个B细胞抗原表位,与多房棘球绦虫TSP2基因相似度为92.23%。
二、细粒棘球蚴95抗原基因的克隆及原核表达质粒的构建（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、细粒棘球蚴95抗原基因的克隆及原核表达质粒的构建（论文提纲范文）
（1）细粒棘球绦虫TSP8、TSP11基因的原核表达及免疫学初步分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 细粒棘球蚴病概述 |
| 1.1 病原 |
| 1.2 诊断方法 |
| 2 细粒棘球蚴病疫苗研制研究进展 |
| 2.1 细粒棘球绦虫中间宿主疫苗研究进展 |
| 2.2 细粒棘球绦虫终末宿主疫苗研究进展 |
| 3 四跨膜蛋白的研究进展 |
| 3.1 四跨膜蛋白的功能 |
| 3.2 寄生虫四跨膜蛋白研究进展 |
| 4 细粒棘球绦虫免疫学概述 |
| 4.1 细粒棘球绦虫的免疫逃避机制 |
| 4.2 包虫病中不同Th类型细胞因子的作用 |
| 5 展望 |
| 6 结语 |
| 第二章 试验内容 |
| 试验一 细粒棘球绦虫TSP8、TSP11 基因的克隆及序列测序 |
| 1.材料 |
| 1.1 虫株、质粒和菌株 |
| 1.2 主要试剂及材料 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2.试验方法 |
| 2.1 引物设计及合成 |
| 2.2 原头蚴总RNA的提取 |
| 2.3 反转录及目的基因的PCR扩增 |
| 2.4 RCR产物的回收、克隆以及测序 |
| 2.5 TSP基因的生物信息学分析 |
| 3.试验结果 |
| 3.1 总RNA质量检测 |
| 3.2 TSP基因的克隆 |
| 3.3 生物信息学分析 |
| 4.讨论 |
| 试验二 细粒棘球绦虫TSP8、TSP11 基因的原核表达 |
| 1.材料 |
| 1.1 质粒和菌株、血清 |
| 1.2 主要试剂及材料 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2.试验方法 |
| 2.1 引物设计及合成 |
| 2.2 目的基因的PCR扩增 |
| 2.3 RCR产物的回收、克隆以及测序 |
| 2.4 重组表达载体的构建 |
| 2.5 重组蛋白的表达 |
| 2.6 重组蛋白的可溶性分析 |
| 2.7 SDS-PAGE电泳检测 |
| 2.8 重组蛋白的纯化 |
| 2.9 鼠抗rEg-TSP-IgG的制备 |
| 2.10 免疫印迹分析 |
| 2.11 免疫荧光鉴定 |
| 3.试验结果 |
| 3.1 TSP基因主要抗原区域的扩增 |
| 3.2 重组p ET32a-TSP质粒的鉴定 |
| 3.3 重组蛋白的表达与抗原性分析 |
| 4.讨论 |
| 试验三 重组蛋白免疫学初步分析 |
| 1.材料 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 主要试剂及材料 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2.方法 |
| 2.1 制备特异性抗血清 |
| 2.2 重组蛋白免疫学初步分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 qPCR法检测TSP免疫小鼠体内细胞因子变化 |
| 3.2 ELISA法检测TSP免疫小鼠体内抗体水平变化 |
| 4.讨论 |
| 第三章 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
| 石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅表 |
（2）细粒棘球绦虫TSP14以及TSP33基因的克隆、原核表达以及免疫原性初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 引言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 E.granulosus形态学特点 |
| 2 E.g.生活史 |
| 3 流行病学 |
| 3.1 流行状况 |
| 3.2 流行因素 |
| 4 诊断方法 |
| 4.1 常规诊断方法 |
| 4.2 血清学诊断 |
| 5 细粒棘球蚴病防治策略 |
| 5.1 EG95 |
| 5.2 EgM蛋白家族 |
| 5.3 EgA31 |
| 5.4 Eg14-3-3 蛋白 |
| 6 四跨膜蛋白 |
| 6.1 四跨膜蛋白的生物功能 |
| 6.2 四跨膜蛋白在寄生虫中的研究进展 |
| 第二章 试验部分 |
| 试验一 细粒棘球绦虫TSP14、TSP33 基因的克隆、序列分析及不同发育阶段表达分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 细粒棘球蚴、包囊壁和成虫 |
| 1.2 主要仪器设备 |
| 1.3 主要试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 总RNA提取及反转录 |
| 2.2 引物设计与合成 |
| 2.3 Eg-TSP14 以及Eg-TSP33 基因的扩增 |
| 2.4 基因扩增产物的回收 |
| 2.5 载体的连接 |
| 2.6 连接产物的转化 |
| 2.7 菌液PCR |
| 2.8 Eg-TSP14 以及Eg-TSP33生物信息学分析 |
| 2.9 Eg-TSP14 以及Eg-TSP33实时荧光定量PCR检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 Eg-TSP14 以及Eg-TSP33 基因的克隆 |
| 3.2 Eg-TSP14 以及Eg-TSP33 基因的序列分析 |
| 3.3 Eg-TSP14 以及Eg-TSP33二级结构和三级结构 |
| 3.4 Eg-TSP14 以及Eg-TSP33 结构域分析 |
| 3.5 B细胞表位预测 |
| 3.6 同源序列比对 |
| 3.7 Eg-TSP14 以及Eg-TSP33 RT-PCR检测结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 试验二 细粒棘球绦虫TSP14 以及TSP33 非跨膜区的克隆及原核表达 |
| 1 材料 |
| 1.1 cDNA |
| 1.2 主要仪器设备 |
| 1.3 主要试剂与耗材 |
| 1.4 主要溶液配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 总RNA提取 |
| 2.2 引物设计 |
| 2.3 Eg-TSP14 以及Eg-TSP33 非跨膜区片段的克隆 |
| 2.4 Eg-TSP14 以及Eg-TSP33 非跨膜区片段的原核表达 |
| 3 结果 |
| 3.1 Eg-TSP14 以及Eg-TSP33 非跨膜区片段的扩增 |
| 3.2 重组质粒的构建及双酶切鉴定 |
| 3.3 重组蛋白的诱导表达 |
| 3.4 重组蛋白表达形式分析、纯化及定量 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 试验三 Eg-TSP14及Eg-TSP33 蛋白免疫原性初步探究 |
| 1 材料 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 主要仪器与设备 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 试剂的配方 |
| 2 方法 |
| 2.1 Eg-TSP14及Eg-TSP33 高免血清的制备 |
| 2.2 Western Blotting |
| 2.3 ELISA检测免疫小鼠的血清抗体滴度 |
| 2.4 qPCR测定细胞因子动态变化 |
| 3 结果 |
| 3.1 Western Blot |
| 3.2 间接ELISA检测免疫后小鼠抗体IgG |
| 3.3 免疫后小鼠细胞因子检测 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 全文结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 附件 |
（3）应用TmAdh3重组抗原建立羊脑多头蚴病间接ELISA诊断方法的研究（论文提纲范文）
| 硕士学位论文评阅人、答辩委员会签名表 |
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 脑多头蚴病 |
| 1.1.1 病原学 |
| 1.1.2 流行病学 |
| 1.1.3 生活史 |
| 1.1.4 临床表现 |
| 1.1.5 治疗 |
| 1.1.6 预防 |
| 1.1.7 临床诊断 |
| 1.1.8 免疫学诊断 |
| 1.2 研究目的与意义 |
| 第二章 多头带绦虫Tm7、Tm GST、Tm PKA-C1、Tm Adh3 重组蛋白的原核表达及反应原性初步分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 菌株和血清 |
| 2.1.2 主要材料 |
| 2.1.3 试剂及配制 |
| 2.1.4 主要仪器及设备 |
| 2.1.5 p GEX4T-Tm7、p ET30a-Tm GST重组质粒构建 |
| 2.1.6 Tm7 的原核表达、纯化及Western-Blot检测 |
| 2.1.7 Tm GST的原核表达、纯化及Western-Blot检测 |
| 2.1.8 Tm PKA-C1 的原核表达、纯化及Western-Blot检测 |
| 2.1.9 Tm Adh3 的原核表达、纯化及Western-Blot检测 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 重组表达质粒PET-30a-Tm GST、p GEX4T-1-Tm7 质粒构建 |
| 2.2.2 重组蛋白Tm7 的原核表达及Western-Blot分析 |
| 2.2.3 重组蛋白Tm GST的原核表达及Western-Blot分析 |
| 2.2.4 重组蛋白Tm PKA-C1 的原核表达及Western-Blot分析 |
| 2.2.5 重组蛋白Tm Adh3 的原核表达及Western-Blot分析 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 羊脑多头蚴病间接ELISA诊断方法的建立 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 主要材料 |
| 3.1.2 试剂配置 |
| 3.1.3 主要仪器及设备 |
| 3.1.4 重组蛋白Tm Adh3、Tm PKA-C1、Tm GST、Tm7 间接ELISA检测方法优化 |
| 3.1.5 重组蛋白Tm Adh3间接ELISA方法的特异性及敏感性检测 |
| 3.1.6 重组蛋白r Tm Adh3间接ELISA检测的消长曲线测定 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 重组蛋白Tm Adh3 间接ELISA方法的最佳反应条件优化试验 |
| 3.2.2 重组蛋白Tm PKA-C1 间接ELISA方法的最佳反应条件及对比 |
| 3.2.3 重组蛋白Tm GST间接ELISA方法的最佳反应条件优化试验 |
| 3.2.4 重组蛋白Tm7 间接ELISA方法的最佳反应条件优化试验 |
| 3.2.5 重组蛋白Tm Adh3、Tm PKA-C1、Tm GST、Tm7 间接ELISA检测对比 |
| 3.2.6 重组蛋白Tm Adh3 间接ELISA检测的特异性及敏感性 |
| 3.2.7 重组蛋白Tm Adh3 间接ELISA检测实验感染脑多头蚴羊抗体消长曲线 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（4）青南儿童棘球蚴病调查分析及AE免疫学诊断、代谢组学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| SUMMARY |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 棘球蚴病简史 |
| 2 病原体及其特征 |
| 2.1 生物学分类地位 |
| 2.2 棘球属绦虫种类及其形态 |
| 2.2.1 细粒棘球绦虫 |
| 2.2.2 多房棘球绦虫 |
| 2.3 棘球绦虫的生活史 |
| 3 棘球蚴病临床症状 |
| 4 棘球蚴病的流行分布情况 |
| 5 泡型棘球蚴病动物模型构建研究进展 |
| 5.1 理想的Em动物模型应具备的特点 |
| 5.2 动物模型建立的方法 |
| 5.2.1 口服虫卵感染 |
| 5.2.2 经皮肝穿刺法 |
| 5.2.3 开腹肝穿刺法 |
| 5.2.4 切开皮肤经腹壁肌层肝穿刺法 |
| 5.2.5 门静脉分支注射法 |
| 5.2.6 腹腔注射法 |
| 5.3 动物模型评价方法 |
| 5.3.1 剖检法 |
| 5.3.2 影像学方法 |
| 5.3.3 免疫学方法 |
| 6 诊断方法研究进展 |
| 6.1 病原学检测 |
| 6.2 影像学诊断 |
| 6.3 血清免疫学诊断 |
| 6.4 DNA检测 |
| 7 分子生物学研究进展 |
| 7.1 基因组特征 |
| 7.2 棘球蚴代谢组学研究进展 |
| 7.3 棘球蚴蛋白质组学研究进展 |
| 8 棘球蚴病疫苗免疫学研究进展 |
| 8.1 基因工程疫苗 |
| 8.2 核酸(DNA)疫苗 |
| 8.3 多肽疫苗 |
| 9 本研究的目的和意义 |
| 第二章 青南地区儿童棘球蚴病感染状况的调查分析研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 调查区域 |
| 1.2 学校调查 |
| 1.3 超声检查 |
| 1.4 血清学检测 |
| 1.4.1 前期准备 |
| 1.4.2 样品检测 |
| 1.4.3 参考范围 |
| 1.4.4 结果判定 |
| 1.5 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 儿童棘球蚴病病例的地理分布情况 |
| 2.2 儿童棘球蚴病病例的性别和年龄分布情况 |
| 2.3 儿童棘球蚴病的地域分布情况 |
| 2.4 AE和 CE病变的超声分类 |
| 3 讨论 |
| 第三章 青海田鼠株多房棘球蚴的分离鉴定及系统进化分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 青海田鼠的捕获 |
| 1.2 捕获青海田鼠解剖及囊液收集 |
| 1.3 包囊HE染色 |
| 1.4 原头蚴分离及镜检 |
| 1.5 PCR分析 |
| 1.6 进化分析 |
| 1.7 Em感染的青海田鼠物种的鉴定 |
| 2 结果 |
| 2.1 样本收集 |
| 2.2 捕获青海田鼠的解剖特征 |
| 2.3 包囊原头蚴HE染色 |
| 2.4 原头蚴分离及镜检 |
| 2.5 PCR分析 |
| 2.6 进化分析 |
| 2.7 Em感染的青海田鼠物种的鉴定 |
| 3 讨论 |
| 第四章 EmAgB3 蛋白及串联EmAgB3-GGGS-Em18 蛋白的克隆表达 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 寄生虫 |
| 1.1.2 质粒及菌种 |
| 1.1.3 试剂与仪器 |
| 1.1.4 扩增用引物 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 EmAgB3及Em18 基因的克隆及序列测定 |
| 1.2.2 EmAgB3和EmAgB3-GGGS-Em18 的基因合成 |
| 1.2.3 载体酶切 |
| 1.2.4 目的片段与载体连接 |
| 1.2.5 转化E.coli DH5α感受态细胞后筛选克隆 |
| 1.2.6 诱导表达融合蛋白 |
| 1.2.7 蛋白的纯化 |
| 1.2.8 纯化蛋白的检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 EmAgB3及Em18 基因的克隆及序列测定 |
| 2.1.1 PCR产物琼脂糖凝胶电泳鉴定 |
| 2.1.2 PCR产物克隆测序鉴定 |
| 2.2 Bam HI-EmAgB3-Xho I及 Nde I-EmAgB3-GGGS-Em18-Xho I基因生物合成 |
| 2.3 重组载体酶切鉴定 |
| 2.4 融合蛋白诱导结果 |
| 2.5 融合蛋白GST/镍琼脂糖亲和层析纯化 |
| 2.6 EmAgB3 融合蛋白酶切后SDS-PAGE检测 |
| 2.7 EmAgB3 融合蛋白酶切后透析 |
| 2.8 蛋白最终Tricine-SDS-PAGE分析 |
| 2.9 目的蛋白Western blot分析 |
| 2.10 蛋白浓度测定 |
| 3 讨论 |
| 第五章 基于EmAgB3和EmAgB3-GGGS-Em18 重组蛋白的AE ELISA诊断方法的建立及应用. |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 抗原 |
| 1.1.2 血清 |
| 1.1.3 试剂 |
| 1.1.4 仪器耗材 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 基本方法 |
| 1.2.2 抗原包被用浓度及阳性血清稀释倍数的筛选 |
| 1.2.3 临界值的确定及判定方法 |
| 1.2.4 特异性检测 |
| 1.2.5 符合性检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 抗原包被用浓度及阳性血清稀释倍数确定 |
| 2.2 临界值的确定 |
| 2.3 特异性交叉检测 |
| 2.4 符合性检测 |
| 3 讨论 |
| 第六章 基于重组蛋白EmAgB3和EmAgB3-GGGS-Em18 的棘球蚴病胶体金试纸条诊断方法的建立及应用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 抗原 |
| 1.1.2 血清 |
| 1.1.3 试剂 |
| 1.1.4 仪器耗材 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 所需溶液配制 |
| 1.2.2 材料准备 |
| 1.2.3 胶体金的制备 |
| 1.2.4 胶体金标记二抗(山羊抗人Ig G Fc)及纯化 |
| 1.2.5 金标垫、样品垫处理 |
| 1.2.6 喷金与划膜 |
| 1.2.7 组装与测试 |
| 1.2.8 特异性试验 |
| 1.2.9 敏感性试验 |
| 1.2.10 符合性试验 |
| 2 结果 |
| 2.1 特异性试验 |
| 2.2 敏感性试验 |
| 2.3 符合性试验 |
| 3 讨论 |
| 第七章 Em沙鼠模型的建立及其代谢组学的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验鼠及寄生虫虫株 |
| 1.1.2 样品 |
| 1.1.3 试剂 |
| 1.1.4 仪器耗材 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 Em沙鼠模型的建立 |
| 1.2.2 代谢组学研究用样本采集 |
| 1.2.3 代谢物提取 |
| 1.2.4 上机检测 |
| 1.2.5 数据处理 |
| 1.2.6 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 Em沙鼠模型的建立 |
| 2.2 沙鼠组织UHPLC-QTOF-MS检测 |
| 2.3 质量控制 |
| 2.3.1 过程质控 |
| 2.3.2 数据质控 |
| 2.4 统计分析 |
| 2.4.1 肝脏代谢组学变化 |
| 2.4.2 脾脏代谢组学变化 |
| 2.4.3 血浆代谢组学变化 |
| 3 讨论 |
| 第八章 结论与展望 |
| 1 研究结论 |
| 2 创新点 |
| 3 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
| 攻读博士学位期间参与的科研项目及发表论文 |
| 导师简介 |
（5）细粒棘球绦虫Eg95-5蛋白生物信息学分析及鉴定（论文提纲范文）
| 1 材料 |
| 1.1 试验动物及病料 |
| 1.2 菌株 |
| 1.3 主要试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 生物信息学分析 |
| 2.1.1 Eg95-5蛋白信号肽及跨膜结构的预测 |
| 2.1.2 Eg95-5蛋白糖基化位点、磷酸化位点和抗原表位的预测 |
| 2.1.3 Eg95-5蛋白二级结构和三级结构的预测 |
| 2.2 pMD19-T-Eg95-5与pET30a-Eg95-5载体的构建 |
| 2.3 Eg95-5蛋白诱导表达及纯化 |
| 2.4 Western-blot鉴定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 生物信息学分析 |
| 3.1.1 Eg95-5蛋白信号肽及跨膜结构的预测 |
| 3.1.2 Eg95-5蛋白糖基化位点、磷酸化位点和抗原表位的预测 |
| 3.1.3 Eg95-5蛋白二级结构和三级结构的预测 |
| 3.2 pMD19-T-Eg95-5与pET30a-Eg95-5载体的构建 |
| 3.3 Eg95-5蛋白诱导表达及纯化 |
| 3.4 Western-blot鉴定 |
| 4 讨论 |
（6）细粒棘球绦虫不育囊形成相关基因的分子特征及功能的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要缩写说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 1 细粒棘球蚴的不育囊与可育囊 |
| 1.1 细粒棘球蚴包囊的类型 |
| 1.2 包囊结构及生化成分 |
| 1.3 不育囊的形成特性 |
| 1.3.1 宿主种类 |
| 1.3.2 宿主年龄 |
| 1.3.3 寄生部位 |
| 1.3.4 宿主生活环境 |
| 1.3.5 细粒棘球蚴基因型 |
| 1.4 不育囊形成的调控因素 |
| 1.4.1 细胞凋亡 |
| 1.4.2 宿主免疫 |
| 2 五个细粒棘球蚴不育囊形成相关基因的研究进展 |
| 2.1 Bcl-2 相关抗凋亡蛋白3 |
| 2.2 内吞蛋白B1 |
| 2.3 线粒体分裂蛋白1 |
| 2.4 程序性死亡因子6 |
| 2.5 柠檬酸合成酶 |
| 3 展望 |
| 4 研究目的及意义 |
| 第二部分 研究内容 |
| 第一章 细粒棘球绦虫BAG3 和EB1 基因的特征分析及其在不育囊形成中的作用 |
| 1 材料与试剂 |
| 1.1 实验动物及血清 |
| 1.2 虫体 |
| 1.3 主要试剂、质粒与菌株 |
| 1.4 常用试剂的配制方法 |
| 1.5 主要仪器设备 |
| 1.6 生物信息学分析软件 |
| 2 方法 |
| 2.1 细粒棘球蚴总RNA的抽提和反转录 |
| 2.2 Eg-BAG3和Eg-EB1 基因的PCR扩增与纯化 |
| 2.3 Eg-BAG3和Eg-EB1 基因克隆、鉴定及转化 |
| 2.3.1 Eg-BAG3和Eg-EB1 基因克隆测序 |
| 2.3.2 序列比对与生物信息学分析 |
| 2.4 原核表达载体的构建 |
| 2.4.1 pMD19-T- Eg-BAG3和pMD19-T- Eg-EB1 质粒提取与回收 |
| 2.4.2 表达载体的连接和酶切鉴定 |
| 2.5 rEg-BAG3和rEg-EB1 的原核表达及纯化 |
| 2.5.1 rEg-BAG3和rEg-EB1 的表达 |
| 2.5.2 SDS-PAGE电泳检测 |
| 2.5.3 优化诱导表达条件 |
| 2.5.4 rEg-BAG3和rEg-EB1 可溶性分析 |
| 2.5.5 rEg-BAG3和rEg-EB1 蛋白纯化 |
| 2.6 rEg-BAG3和rEg-EB1 反应原性分析 |
| 2.6.1 兔抗rEg-BAG3-IgG和 rEg-EB1-IgG的制备 |
| 2.6.2 免疫印迹 |
| 2.7 免疫荧光定位 |
| 2.7.1 兔抗rEg-BAG3与rEg-EB1总IgG制备 |
| 2.7.2 虫体蜡块的制作 |
| 2.7.3 间接免疫荧光定位 |
| 2.8 原头蚴氧化胁迫处理 |
| 2.8.1 原头蚴的活性检测 |
| 2.8.2 原头蚴的体外培养 |
| 2.8.3 氧化胁迫处理 |
| 2.8.4 光学显微镜和透射电子显微镜分析 |
| 2.8.5 qRT-PCR检测Eg-BAG3和Eg-EB1 表达量 |
| 2.8.5.1 RNA提取及cDNA合成 |
| 2.8.5.2 qRT-PCR引物和反应 |
| 2.9 原头蚴Eg-BAG3和Eg-EB1 体外RNA干扰试验 |
| 2.9.1 原头蚴的体外培养 |
| 2.9.2 siRNA的合成与转染 |
| 2.9.2.1 siRNA的合成 |
| 2.9.2.2 siRNA转染原头蚴 |
| 2.9.3 qRT-PCR检测Eg-BAG3和Eg-EB1 表达量 |
| 2.9.3.1 RNA提取及cDNA合成 |
| 2.9.3.2 qRT-PCR 引物和反应 |
| 2.10 原头蚴细胞凋亡测定 |
| 2.10.1 原头蚴的氧化处理 |
| 2.10.2 TUNEL检测 |
| 2.10.3 免疫荧光Tunel凋亡率分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 Eg-BAG3和Eg-EB1 基因的扩增与生物信息学分析 |
| 3.1.1 Eg-BAG3和Eg-EB1 基因PCR扩增 |
| 3.1.2 Eg-BAG3和Eg-EB1 生物信息学分析 |
| 3.2 rEg-BAG3和rEg-EB1 的表达与反应原性分析 |
| 3.2.1 rEg-BAG3和rEg-EB1 原核表达与纯化 |
| 3.2.2 rEg-BAG3和rEg-EB1 的反应原性分析 |
| 3.3 细粒棘球绦不同发育时期rEg-BAG3和rEg-EB1 的免疫荧光定位 |
| 3.4 氧化应激诱导的细胞凋亡对原头蚴形态影响 |
| 3.5 原头蚴mRNA相对表达量测定 |
| 3.6 原头蚴体外RNA干扰研究 |
| 3.6.1 siRNA转染与内源Eg-BAG3和Eg-EB1 基因表达抑制 |
| 3.6.2 原头蚴细胞凋亡率检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 细胞凋亡与不育囊形成的关系 |
| 4.2 Eg-BAG3和EgE-EB1 基因的鉴定及蛋白特性分析 |
| 4.3 氧化应激诱导的细胞凋亡对原头蚴的影响 |
| 4.4 Eg-BAG3和EgE-EB1 蛋白在原头蚴的功能研究 |
| 第二章 细粒棘球绦虫FIS1和PDCD6 基因的克隆表达及蛋白功能的初步研究 |
| 1 材料与试剂 |
| 1.1 实验动物及血清 |
| 1.2 虫体 |
| 1.3 主要试剂、质粒与菌株 |
| 1.4 常用试剂的配制方法 |
| 1.5 主要仪器设备 |
| 1.6 生物信息学分析软件 |
| 2 方法 |
| 2.1 细粒棘球蚴总RNA的抽提和反转录 |
| 2.2 Eg-Fis1和Eg-PDCD61 基因的PCR扩增与纯化 |
| 2.3 Eg-Fis1和Eg-PDCD6 基因克隆、鉴定及转化 |
| 2.3.1 Eg-Fis1和Eg-PDCD6 基因克隆测序 |
| 2.3.2 序列比对与生物信息学分析 |
| 2.4 原核表达载体的构建 |
| 2.4.1 pMD19-T- Eg-Fis1和pMD19-T- Eg-PDCD6 质粒提取与回收 |
| 2.4.2 表达载体的连接和酶切鉴定 |
| 2.5 rEg-Fis1和rEg-PDCD6 的原核表达及纯化 |
| 2.5.1 rEg-Fis1和rEg-PDCD6 的表达 |
| 2.5.2 SDS-PAGE电泳检测 |
| 2.5.3 优化诱导表达条件 |
| 2.5.4 rEg-Fis1和rEg-PDCD6 可溶性分析 |
| 2.5.5 rEg-Fis1和rEg-PDCD6 蛋白纯化 |
| 2.6 rEg-Fis1和rEg-PDCD6 反应原性分析 |
| 2.6.1 兔抗rEg-Fis1-IgG和 rEg-PDCD6-IgG的制备 |
| 2.6.2 免疫印迹 |
| 2.7 免疫荧光定位 |
| 2.7.1 兔抗rEg-Fis1和rEg-PDCD6总IgG制备 |
| 2.7.2 虫体蜡块的制作 |
| 2.7.3 间接免疫荧光定位 |
| 2.8 原头蚴氧化胁迫处理 |
| 2.8.1 原头蚴的活性检测 |
| 2.8.2 原头蚴的体外培养 |
| 2.8.3 氧化胁迫处理 |
| 2.8.4 qRT-PCR检测Eg-Fis1和Eg-PDCD6 表达量 |
| 2.8.4.1 RNA提取及cDNA合成 |
| 2.8.4.2 qRT-PCR引物和反应 |
| 2.9 原头蚴Eg-Fis1和Eg-PDCD6 体外RNA干扰试验 |
| 2.9.1 原头蚴的体外培养 |
| 2.9.2 siRNA的合成与转染 |
| 2.9.2.1 siRNA的合成 |
| 2.9.2.2 siRNA转染原头蚴 |
| 2.9.3 qRT-PCR检测Eg-Fis1和Eg-PDCD6 表达量 |
| 2.9.3.1 RNA提取及cDNA合成 |
| 2.9.3.2 qRT-PCR引物和反应 |
| 2.10 原头蚴细胞凋亡测定 |
| 2.10.1 原头蚴的氧化处理 |
| 2.10.2 TUNEL检测 |
| 2.10.3 免疫荧光Tunel凋亡率分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 Eg-Fis1和Eg-PDCD6 基因的扩增与生物信息学分析 |
| 3.1.1 Eg-Fis1和Eg-PDCD6 基因的扩增 |
| 3.1.2 Eg-Fis1和Eg-PDCD6 基因的生物信息学分析 |
| 3.2 重组蛋白的表达与反应原性分析 |
| 3.2.1 rEg-Fis1和rEg-PDCD6 蛋白的表达与纯化 |
| 3.2.2 重组蛋白的反应原性分析 |
| 3.3 rEg-Fis1和rEg-PDCD6 在细粒棘球绦不同发育时期的免疫荧光定位 |
| 3.4 原头蚴m RNA相对表达量测定 |
| 3.5 原头蚴体外RNA干扰研究 |
| 3.5.1 si RNA转染与内源Eg-Fis1和Eg-PDCD6 基因表达抑制 |
| 3.5.2 原头蚴细胞凋亡率检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 Eg-Fis1和Eg-PDCD6 基因鉴定和分析 |
| 4.2 Eg-Fis1和Eg-PDCD6 分布特性分析 |
| 4.3 氧化应激诱导的细胞凋亡对Eg-Fis1和Eg-PDCD6 表达量的影响 |
| 4.4 Eg-Fis1和Eg-PDCD6 蛋白在原头蚴细胞凋亡的功能研究 |
| 第三章 细粒棘球绦虫柠檬酸合成酶的分子特征与生物学特性分析 |
| 1 材料与试剂 |
| 1.1 实验动物及血清 |
| 1.2 虫体 |
| 1.3 主要试剂、质粒与菌株 |
| 1.4 常用试剂的配制方法 |
| 1.5 主要仪器设备 |
| 1.6 生物信息学分析软件 |
| 2.方法 |
| 2.1 细粒棘球蚴总RNA的抽提和反转录 |
| 2.2 Eg-CS基因的PCR扩增与纯化 |
| 2.3 Eg-CS基因克隆、鉴定及转化 |
| 2.3.1 Eg-CS基因克隆测序 |
| 2.3.2 序列比对与生物信息学分析 |
| 2.4 原核表达载体的构建 |
| 2.4.1 pMD19-T-CS质粒提取与回收 |
| 2.4.2 表达载体的连接和酶切鉴定 |
| 2.5 rEg-CS的原核表达及纯化 |
| 2.5.1 rEg-CS的表达 |
| 2.5.2 SDS-PAGE电泳检测 |
| 2.5.3 优化诱导表达条件 |
| 2.5.4 rEg-CS可溶性分析 |
| 2.5.5 rEg-CS蛋白纯化 |
| 2.6 rEg-CS反应原性分析 |
| 2.6.1 兔抗rEg-CS-IgG的制备 |
| 2.6.2 免疫印迹 |
| 2.7 免疫荧光定位 |
| 2.7.1 兔抗rEg-CS总 IgG制备 |
| 2.7.2 虫体蜡块的制作 |
| 2.7.3 间接免疫荧光定位 |
| 2.8 间接ELISA方法的建立 |
| 2.8.1 操作步骤 |
| 2.8.2 最佳条件的筛选 |
| 2.8.3 Cut-off值的确定 |
| 2.8.4 ELISA的特异性测定 |
| 2.8.5 ELISA的敏感性测定 |
| 2.9 原头蚴氧化胁迫处理 |
| 2.9.1 原头蚴的活性检测 |
| 2.9.2 原头蚴的体外培养 |
| 2.9.3 氧化胁迫处理 |
| 2.9.4 qRT-PCR检测Eg-CS表达量 |
| 2.9.4.1 RNA提取及c DNA合成 |
| 2.9.4.2 qRT-PCR引物和反应 |
| 3 结果 |
| 3.1 Eg-CS基因的扩增与生物信息学分析 |
| 3.1.1 Eg-CS基因的扩增 |
| 3.1.2 Eg-CS基因的生物信息学分析 |
| 3.2 重组Eg-CS的表达与反应原性分析 |
| 3.2.1 重组蛋白的表达与纯化 |
| 3.2.2 重组蛋白的反应原性分析 |
| 3.3 Eg-CS在细粒棘球绦不同发育时期的免疫荧光定位 |
| 3.4 间接ELISA的初步建立 |
| 3.4.1 最佳工作条件的确定 |
| 3.4.2 Cut-off值的确定 |
| 3.4.3 间接ELISA方法的灵敏度与特异性 |
| 3.5 原头蚴m RNA相对表达量测定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 柠檬酸合成酶蛋白特性 |
| 4.2 Eg-CS分布特性分析 |
| 4.3 Eg-CS在应对原头蚴细胞凋亡上的作用 |
| 4.4 rEg-CS间接ELISA效果评价 |
| 第三部分 结论与创新点 |
| 1 结论 |
| 2 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（7）棘球蚴病疫苗研究进展（论文提纲范文）
| 1 基因工程疫苗 |
| 2 核酸疫苗 |
| 3 多肽疫苗 |
| 4结语 |
（8）棘球蚴EG95重组蛋白研究进展（论文提纲范文）
| 1 EG95抗原基因的研究 |
| 2 EG95重组蛋白表达技术研究 |
| 2.1 重组EG95蛋白的原核表达 |
| 2.1.1 大肠杆菌表达的EG95重组蛋白 |
| 2.1.2 根瘤农杆菌表达系统表达EG95重组蛋白 |
| 2.1.3 结核分枝杆菌表达的EG95重组蛋白 |
| 2.1.4 重组双歧杆菌表达的EG95重组蛋白 |
| 2.2 重组EG95抗原的真核表达 |
| 2.2.1 用酵母进行表达的EG95重组蛋白 |
| 2.2.2 用杆状病毒-昆虫细胞系统进行表达的EG95重组蛋白 |
| 2.2.3 病毒活载体表达EG95重组蛋白 |
| 2.3 EG95DNA疫苗 |
| 3 EG95人工合成肽 |
| 4 展望 |
（9）细粒棘球绦虫Eg95疫苗的研制现状（论文提纲范文）
| 1 Eg95重组抗原 |
| 2 Eg95合成肽疫苗 |
| 3 Eg95 DNA疫苗 |
| 4 Eg95重组酵母 |
| 5 Eg95重组牛痘病毒疫苗 |
| 6 Eg95重组BCG疫苗 |
| 7 Eg95转基因苜蓿疫苗 |
| 8 Eg95重组双歧杆菌疫苗 |
| 9 结语 |
（10）豆状带绦虫密码子分析与四个功能基因的研究（论文提纲范文）
| 本论文创新性工作 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 文献综述 |
| 一 带科绦虫主要虫种功能基因研究进展 |
| 1 猪带绦虫 |
| 2 细粒棘球绦虫 |
| 3 多房棘球绦虫 |
| 4 多头带绦虫 |
| 5 牛带绦虫及亚洲带绦虫 |
| 6 其他带科绦虫 |
| 7 展望 |
| 二、选题目的和意义 |
| 第二部分 研究内容 |
| 第一章 豆状带绦虫生物学研究 |
| 摘要 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二章 豆状带绦虫转录组密码子偏好性分析 |
| 摘要 |
| 引言 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三章 豆状带绦虫及其他42种扁形动物(吸虫与绦虫)线粒体基因组密码子偏好性分析 |
| 摘要 |
| 引言 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第四章 豆状带绦虫Tp-UBC2基因克隆、原核表达及重组表达蛋白的功能研究 |
| 摘要 |
| 引言 |
| 1 材料与试剂 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第五章 豆状带绦虫Tp1基因的克隆、原核表达及重组抗原Dot-ELISA诊断方法的建立 |
| 摘要 |
| 引言 |
| 1 材料与试剂 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第六章 豆状带绦虫Tp-dUTPase基因的克隆、原核表达及重组抗原Dot-ELISA方法的建立 |
| 摘要 |
| 引言 |
| 1 材料与试剂 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第七章 豆状带绦虫Tp-TSP2基因序列分析及重组质粒的构建 |
| 摘要 |
| 引言 |
| 1 材料与试剂 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的论文 |
四、细粒棘球蚴95抗原基因的克隆及原核表达质粒的构建（论文参考文献）
- [1]细粒棘球绦虫TSP8、TSP11基因的原核表达及免疫学初步分析[D]. 王炜烨. 石河子大学, 2020(08)
- [2]细粒棘球绦虫TSP14以及TSP33基因的克隆、原核表达以及免疫原性初步研究[D]. 王云菲. 石河子大学, 2020(08)
- [3]应用TmAdh3重组抗原建立羊脑多头蚴病间接ELISA诊断方法的研究[D]. 刘垠鞠. 中国农业科学院, 2020
- [4]青南儿童棘球蚴病调查分析及AE免疫学诊断、代谢组学研究[D]. 蔡其刚. 甘肃农业大学, 2019
- [5]细粒棘球绦虫Eg95-5蛋白生物信息学分析及鉴定[J]. 胡尊楠,马忠臣,何金科,徐明国,陈创夫,王震. 黑龙江畜牧兽医, 2019(05)
- [6]细粒棘球绦虫不育囊形成相关基因的分子特征及功能的初步研究[D]. 王凝. 四川农业大学, 2018(08)
- [7]棘球蚴病疫苗研究进展[J]. 朵红. 青海畜牧兽医杂志, 2016(06)
- [8]棘球蚴EG95重组蛋白研究进展[J]. 李宏民,娄忠子,李立,李振华,李建秋,闫鸿斌,贾万忠. 中国人兽共患病学报, 2014(10)
- [9]细粒棘球绦虫Eg95疫苗的研制现状[J]. 李文桂. 国外医学(医学地理分册), 2014(01)
- [10]豆状带绦虫密码子分析与四个功能基因的研究[D]. 陈林. 四川农业大学, 2013(09)