容锡沧1张余2*谭帼馨3谭英3宁成云4李梅2李丽华2
1.南方医科大学附属江门市人民医院骨科广东江门529000;
2.广州军区广州总医院骨科医院广东广州510010;
3.广东工业大学轻工化工学院广东广州510006;
4.华南理工大学材料科学与工程学院广东广州510641
【摘要】通过多巴胺聚合在纳米孔钛表面构建了仿生聚多巴胺(PDA)膜层,具有良好的生物活性。再利用聚多巴胺的螯合效应及还原性,通过调节将纳米银颗粒载入聚多巴胺修饰钛表面的反应时间,得到不同纳米银颗粒浓度的聚多巴胺修饰钛。利用扫描电镜(SEM)、细胞粘附、细胞毒性及杀菌率等对载不同纳米银颗粒浓度的聚多巴胺修饰钛进行体外生物相容性及抗菌性能进行检测。研究结果表明,通过调整纳米银沉积反应时间,可调节材料表面银离子释放量,可得到既有良好细胞相容性,又有较强抗菌能力的聚多巴胺/纳米银修饰钛表面材料。
【关键词】钛;聚多巴胺;纳米银颗粒;抗菌性能;细胞相容性;反应时间
【中图分类号】TB331【文献标识码】A【文章编号】1764-8999(2015)7-0527-02
TheStudyonReactionTimeInfluenceonTheAntibacterialpropertyAndCytocompatibilityforPolydopamineFunctionalizationofTitaniumSurfaceforSilverNanoparticlesImmobilization
RONGXi-Cang1,ZHANGYu2,*,TanGuo-Xin3,TANYing3,NINGCheng-Yun4,LIMei2,LILi-hua2
(1.TheAffiliatedJiangmenPeople’sHospitalofSouthernMedicalUniversity,Jiangmen,529000,China;2.GeneralHospitalofGuangzhouMilitaryCommand,Guangzhou,510010,China;3.FacultyofLightandChemical,GuangDongUniversityofTechnlolgy,Guangzhou,510006,China;4.CollegeofMaterialsScienceandTechnology,SouthChinaUniversityofTechnology,Guangzhou,510641,China.)
【Abstract】Abioinspiredpolydopamine(PDA)layerwasdepositedontitaniumsurfacebysimplydippingthesubstrateintoanalkalinedopaminesolution.Theinvitrobioactivityofthepolydopaminecoatedtitaniumwasassessedbyincubationinsimulatedbodyfluids.Byadjustingthenanosizesilverparticlesloadedpolydopamineresponsetimeofthemodifiedtitaniumsurface,differentconcentrationofsilvernanoparticlesmodifiedpolydopaminefunctionalizationoftitaniumsurface.Usingscanningelectronmicroscopy(SEM),celladhesion,celltoxicityandsterilizationratetoevaluatepolydopaminefunctionalizationoftitaniumsurfacewithloadofdifferentconcentrationofsilvernanoparticlesinvitrobiocompatibilityandantibacterialproperties.Theresearchresultsshowthatbyadjustingthenanosilverdepositionreactiontime,thematerialsurfacesilverionreleasequantityisadjustable.Polydopaminefunctionalizationoftitaniumfurfaceforsilvernanoparticlesimmobilizationcanbebothhavegoodcellcompatibility,andhavestrongerantibacterialability.
【Keywords】titanium;polydopamine;silvernanoparticles;antibacterialproperty;cytocompatibility;reactiontime
引言:
钛及其合金作为传统的金属植入物材料,因其具有良好的生物相容性、机械性和耐生物腐蚀性,广泛应用于医疗领域。但是钛及其合金植入体内后发生的细菌感染及植入物松动是其失败的两个主要原因。纳米银因其极大的比表面积,较强的渗透性及抗菌性等特点成为抗菌材料的研究热点。然而,鉴于纳米银潜在的细胞毒性,提高纳米银修饰钛表面的细胞相容性具有重要意义。仿贻贝粘连蛋白的聚多巴胺(PDA)因其具有极强的粘附性,能提高材料表面亲水性和生物相容性[1,2]等特点,广泛应用于生物材料的表面修饰。Giglio[3]等通过电聚合等方法,在钛表面形成纳米银/水凝胶复合涂层,结果证明该复合涂层具有较高抗菌率和良好的生物活性。此外,聚多巴胺具有一定的还原性,Ball[4]等将聚多巴胺改性后的聚苯乙烯培养皿浸入硝酸银溶液中,表面得到纳米银层,证实其能够实现材料表面的无电金属化。本研究利用多巴胺自聚合在钛表面构建出仿生聚多巴胺层,利用聚多巴胺的金属离子络合作用和还原能力,通过调节反应时间,在钛表面制备出不同纳米银浓度的聚多巴胺/纳米银复合膜层,并对其进行体外抗菌性能和细胞相容性研究,旨在得到兼具良好生物活性和抗菌性能的钛基植入材料。
1实验方法:
1.1钛表面聚多巴胺仿生修饰
医用纯钛片(99.9%,宝鸡市启辰新材料科技有限公司)用HNO3/HF溶液(分析纯)预处理后浸入60℃piranha溶液(VH2SO4:VH2O2=7:3)中反应30min(将制得的钛样品命名为nTi),后将其浸入到pH值为8.5,浓度为2g/L的盐酸多巴胺(98%,阿拉丁)溶液中振荡反应24h,用去离子水超声10min,烘干,得到聚多巴胺修饰钛(Ti-PDA)。以酸洗钛(Ti)为实验对照样。
1.2聚多巴胺修饰钛表面纳米载银
将实验1.1中制得的Ti-PDA样品浸入到20mM的硝酸银(98%,上海国药)溶液中反应一定时间(15min,30min,60min),后用去离子水反复清洗,氮气吹干,得到聚多巴胺/纳米银修饰钛样品(Ti-PDA-Ag-15min,Ti-PDA-Ag-30min,Ti-PDA-Ag-60min)。为了检验纳米银修饰钛表面银离子的释放,将1cm2大小的Ti-PDA-Ag样品浸入到去离子水中,37℃恒温振荡一定时间后,更换去离子水,通过石墨炉原子吸收光谱仪(Z-5000,Hitachi,Japan)测定更换液中的Ag+浓度,平行3次测量。同时取样品用13%的HNO3溶液浸泡16h,同上方法测量液体Ag+浓度。(图1)
1.3体外抗菌性能
革兰氏阳性菌以金黄色葡萄球菌(ATCC6538,RockvilleMD,USA)为试验株及革兰氏阴性菌以大肠埃希菌(ATCC8099,RockvilleMD,USA)为试验菌株检验钛表面的抗菌性能。操作如下:将冻存的菌液加到LB液体培养基(Luria–Bertani培养基,含10g/L蛋白胨,5.0g/L氯化钠,and5.0g/L牛肉膏,pH值在7.0至7.2间)中,在放到培养摇床37℃培养活化24小时。将菌液浓度调整至1×106CFU/ml(菌液浓度通过测定光密度OD值确定:在波长为600nm条件下,0.1OD值对应于每毫升108个细胞)。将直径为1cm的钛样品置于24孔培养板中,用无菌移液管移取500ul细菌悬液(浓度106CFU/mL)于样品表面,在37℃生化培养箱中共培养24h后,将菌液稀释10-4倍后取100ul利用固体LB培养基倒平板法计算菌落总数,以Ti为对照组,杀菌率(R)按下式进行计算:(图2)
公式(1)
1.4体外细胞粘附情况
将Ti,nTi,Ti-PDA,Ti-PDA-Ag-15min,Ti-PDA-Ag-30min,Ti-PDA-Ag-60min六组样品分别置于24孔培养板中,移取500μL小鼠MC3T3-E1(ATCCCRL-2593)细胞悬液以2×104cells/mL浓度接种到24孔板中,置于37℃、5%CO2细胞培养箱内培养12h,浸泡到无菌PBS溶液(pH=7.4)中清洗,戊二醇固定,PBS清洗后用梯度浓度的乙醇脱水,CO2临界点干燥后喷金置于扫描电镜(NovaNanoSEM430,FEI,Netherlands)下观察材料表面细胞的粘附。(图3)
六组样品按照上述方法培养120min后,加入4%多聚甲醛在4℃条件下30min,再加入4,6-联脒-2-苯基吲哚(DAPI,Sigma)在室温下反应30min,最后使用荧光显微镜(Olympus,1×2-ILL100,Japan)下观察拍照,观察细胞早期粘附情况。(图4)
1.5细胞毒性
六组样品按照上述1.4步骤培养1d、3d、5d和7d后,吸弃旧培养基,PBS清洗后每孔加入300μL新鲜培养基和30μL溴化-3-(4,5-2甲基噻唑基-2)-2,5-二苯基四唑(MTT)溶液,孵育3h后轻轻吹打混匀,用酶标仪(MultiskanFC,ThermoScientific,America)在490nm波长下测定OD值,以样品Ti作为对照样。采用SPSS15.0统计学软件对六组样品的吸光度值进行处理。(图5)
2结果与讨论:
2.1聚多巴胺修饰钛表面纳米载银
有研究表明,材料表面羟基化可以与聚多巴胺中的邻苯二酚基团发生脱水形成双齿类配位体[5],增强聚多巴胺在表面的粘附。本研究通过piranha溶液处理酸洗钛表面,既活化了钛表面使其富含羟基,又使钛表面纳米结构化,增强聚多巴胺层的结合力。多巴胺发生自聚合后,在纳米网结构的钛表面构建出均匀颗粒状的仿生多巴胺膜层。Zhang等[6]已证实多巴胺在碱性条件下先经过一系列复杂的环化、氧化作用和分子内重排反应,形成聚多巴胺的纳米颗粒,吸附在材料表面形成聚多巴胺单分子层。由此可以推断,Ti-PDA表面的纳米颗粒为聚多巴胺。最后,将聚多巴胺修饰的多孔钛浸入硝酸银溶液中,因聚多巴胺表面的邻苯二酚基团和醌式基团对银离子具有络合作用,使银离子吸附在其表面;同时,聚多巴胺利用表面酚羟基的氧化还原性将吸附的银离子原位化学还原成Ag纳米粒子固定在基底表面[7,8]。
通过调整聚多巴胺修饰的多孔钛浸入硝酸银溶液中沉积反应的时间,通过设定15min、30min、60min三个时间点,取出的样本行银离子释放试验。发现样本的银离子释放均是呈递减的趋势,释放初期(2d),银离子释放显著,后其释放趋于稳定(如图1)。同时,随着沉积时间的增加,银离子的释放总量是在增加的。至实验结束的14d,Ti-PDA-Ag-15min,Ti-PDA-Ag-30min和Ti-PDA-Ag-60min样本的银离子累积释放量分别相当于其总载银量的11.47%,14.73%和17.10%,可以预见,纳米银修饰的钛表面具有持久的抗菌性能。有研究表明,银离子产生的细胞毒性均于较高浓度下产生[9,10]。通过换算,Ti-PDA-Ag-15min,Ti-PDA-Ag-30min及Ti-PDA-Ag-60min样本液体中的银离子浓度均小于10-6mmol/L,但需待下面的细胞实验进一步验证其细胞毒性。
2.2体外细胞相容性
内植物材料植入体内后将与组织和细胞长期直接接触,因此必须具备良好的生物相容性,包括良好的细胞粘附性和低细胞毒性。图3为样本表面MC3T3-E1细胞的早期粘附电镜下观察情况,图3(A)显示,对照样Ti表面MC3T3-E1细胞呈椭球状和长梭形,并有少量伪足伸展;通过纳米化nTi样本,MC3T3-E1细胞呈不规则多边形铺展,较Ti表面伸出较多伪足;至使用聚多巴胺(PDA)活化的材料样本,Ti-PDA,Ti-PDA-Ag-15min,Ti-PDA-Ag-30min及Ti-PDA-Ag-60min,表面细胞呈不规则多边形铺展,细胞伸出较多伪足,且细胞之间通过伪足相互交联(如图3),证实钛表面纳米结构和聚多巴胺仿生膜层有利于细胞的早期粘附。同时通过DAPI染色观察,Ti-PDA,Ti-PDA-Ag-15min,Ti-PDA-Ag-30min及Ti-PDA-Ag-60min样本MC3T3-E1细胞早期粘附的数量均较Ti及nTi明显多,更进一步印证了上述结论。
至于细胞毒性情况,MTT结果(图5)表明,细胞在材料上培养1d和3d,各组细胞数量无显著性差异;培养至第5d和7d,Ti,pTi和Ti-PDA之间的细胞数量无明显差异,而Ti-PDA-Ag-15min及Ti-PDA-Ag-30min显示出对MC3T3-E1细胞增殖一定的抑制作用,但增殖率仍大于90%,符合生物材料医用标准,说明材料均具有良好的体外细胞相容性。但是至Ti-PDA-Ag-60min,增殖率已明显降低,降低接近于80%,与Ti-PDA-Ag-15min及Ti-PDA-Ag-30min样本比较,已有较大的细胞毒性。
2.3抗菌性能
已有研究表明,聚多巴胺结构中存在的苯酚类物质能够抑制有害细菌的繁殖与生长[11],但其抗菌作用远远达不到常规的抗菌要求。体外抗菌性能纳米银含量、形状及尺寸等对材料的抗菌性能有着重要的影响,Castanon[12]等人证明,较小粒径的纳米银具有更强的杀菌能力,其原因是小粒径的纳米银比表面积更大,更容易穿透细菌的细胞壁。图2为不同样品的杀菌率结果照片,研究结果表明,纳米结构化和聚多巴胺修饰钛表面对金黄色葡萄球菌及大肠埃希菌没有明显的抗菌作用,而聚多巴胺/纳米银修饰钛表面具有较强的杀菌作用,Ti-PDA-Ag-15min,Ti-PDA-Ag-30min及Ti-PDA-Ag-60min样本,由公式(1)计算得到的对金黄色葡萄球菌的杀菌率分别为60.4%,100%和100%,对大肠埃希菌的杀菌率分别为83.8%,100%和100%。无机抗菌剂表面改性材料和整体型抗菌材料主要通过以Ag、Cu等为代表的无机抗菌剂发挥抗菌功能,其具体作用机理尚未完全明确。目前普遍认为纳米银之所以具有抗菌作用一方面是因为其释放银离子,其抗菌机理与银离子类似;另一方面纳米粒子本身能够引起细胞膜的完整性或渗透屏障的破坏,导致胞内物质流失,从而杀灭细菌[13-16]。纳米银具有长效抗菌作用则源于其释放的银离子在杀灭细菌后,可以从死亡的细菌体中游离出来,再与其他菌群接触,周而复始进行杀菌过程。
3.结论:
3.1通过纳米孔化钛表面及利用聚多巴胺的还原能力将纳米银颗粒负载至钛表面,其聚多巴胺/纳米银修饰钛表面有较好的细胞粘附性能及对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌均具有较强的杀菌能力。
3.2银离子有一定的细胞毒性,通过调整纳米银沉积反应时间,可调节材料表面银离子释放量,得到既有较低的细胞毒性,又有较强抗菌能力的聚多巴胺/纳米银修饰钛表面材料。
金黄色葡萄糖球菌组:A:Ti,B:nTi,C:Ti-PDA,D:Ti-PDA-Ag-15min,E:Ti-PDA-Ag-30min,F:Ti-PDA-Ag-60min.
大肠埃希组:a:Ti,B:nTi,C:Ti-PDA,D:Ti-PDA-Ag-15min,E:Ti-PDA-Ag-30min,F:Ti-PDA-Ag-60min.
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