导读:本文包含了番茄转染论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:肌萎缩侧索硬化,超氧化物歧化酶,氧化应激,NQO-1
番茄转染论文文献综述
王珏[1]（2015）在《番茄红素对转染hSOD1-G93A的NSC34细胞的保护作用及机制研究》一文中研究指出目的:肌萎缩侧索硬化症为神经系统变性疾病的一种,其特征是选择性的侵犯脊髓前角细胞、脑干运动神经元、皮质锥体细胞及锥体束,导致上、下运动神经元变性死亡。患者出现上下运动神经元同时损害的临床特征,以单侧或双侧手指活动笨拙无力为常见首发症状。本病晚期出现延髓麻痹,在患者意识始终清醒的情况下,出现舌肌萎缩、构音不清、饮水呛咳、吞咽困难等症状,严重影响患者生存质量,给患者带来巨大痛苦。随着疾病病程的持续进展,在发病之后3~7年内多因呼吸肌受累死于肺部感染或呼吸肌麻痹所致的呼吸衰竭。目前国际范围内对ALS发病机制的相关研究主要关注于其相关突变蛋白h SOD1-G93A,因此,针对此突变蛋白所造成的损伤进行治疗方面的研究就具有重要意义。番茄红素是一种含有碳碳共轭双键的类胡萝卜素,因其结构中大量的C=C-C=C存在使得其具有抗氧化能力。现有研究证实,番茄红素能够通过Nrf2-ARE信号转导通路,上调Ⅱ相解毒酶的表达,从而保护细胞,对抗氧化损伤。目前研究发现,在SOD1突变模型中,至少有14种受Nrf2调控的基因表达出现下调,包括NQO1、GST、HO-1、细胞色素P450、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶等。但是目前国内外均缺乏将番茄红素应用于治疗神经系统变性疾病的体外实验证据。本实验采用突变的h SOD1-G93A质粒转染NSC34细胞,从抗氧化应激角度探讨番茄红素对转染h SOD1-G93A的NSC34细胞的影响及其可能机制,为将来寻求治疗肌萎缩侧索硬化症广泛普及的药物打下初步的研究基础。方法:1实验分组实验设置空白对照组、转染空质粒组、转染h SOD1-G93A组以及不同浓度的番茄红素处理组(1.5μmol/L,2.5μmol/L,7.5μmol/L)。以DMSO溶解番茄红素,于转染操作后24小时向各组细胞加入DMSO或不同剂量的番茄红素(1.5μmol/L,2.5μmol/L,7.5μmol/L)继续培养24小时,用于后续实验。2细胞培养及质粒转染取冻存于液氮罐中的NSC34细胞,予以复苏。培养液使用含有10%灭活的胎牛血清及青链霉素的高糖DMEM,培养条件为37℃、5%CO2。于细胞复苏传代3次以后,待细胞突起明显、形态良好、汇合度为80%~90%时,于细胞对数生长期分别转染h SOD1-G93A质粒、空质粒。转染操作过程依照LipofectamineTM 2000试剂说明书进行规范操作。转染操作后24小时给予番茄红素处理,继续培养24小时。即转染后48小时收集标本,用于后续实验。3细胞丙二醛(MDA)含量检测收集转染后48小时的各组细胞,使用硫代巴比妥酸(TBA)法测定细胞MDA水平。操作过程依照试剂说明书进行规范操作,于532nm处,读取吸光度值。4目的蛋白表达水平检测——蛋白免疫印迹(Western Blot)提取细胞总蛋白,以Bicinchoninic acid(BCA)法测定细胞总蛋白浓度。以60μg为蛋白上样量,进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。之后,将凝胶中的蛋白电泳转印至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。将PVDF膜与一抗于4℃摇床孵育至少12小时。再将PVDF膜与结合有荧光染料的二抗于室温下避光孵育1小时。之后使用Odyssey双色红外荧光成像系统对PVDF膜进行扫描,结合Image J软件进一步确定目的蛋白表达水平。5细胞凋亡率测定消化各组NSC34细胞,制备成单细胞悬液,500rpm,5分钟条件下离心,弃上清,将细胞以预冷的PBS重悬并计数。取1-5*105个细胞再次以上述条件离心,弃上清,加入500μl 1x Binding buffer重悬,再加入5μl PI,室温避光孵育30分钟,利用流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果:1成功培养NSC34细胞,完成质粒转染于倒置荧光显微镜下观察证实,NSC34细胞贴壁良好,形态规则,突起明显,成功培养NSC34细胞。于倒置荧光显微镜下观察转染空质粒组、转染h SOD1-G93A组和番茄红素处理组的细胞,证实均存在EGFP绿色荧光;对于转染h SOD1-G93A组和番茄红素处理组细胞,蛋白质免疫印迹法在相应位置检测到含EGFP标签的外源性SOD1(Fig.5),流式细胞仪测定转染效率为23.30%和26.21%,质粒转染完成。2丙二醛(MDA)含量测定MDA含量代表了细胞脂质过氧化水平,可间接反映氧化应激水平。收集转染48小时后细胞,测定MDA,结果显示,空白对照组与转染空质粒组细胞MDA含量差异无统计学意义(P<0.05),转染h SOD1-G93A组细胞MDA含量明显高于转染空质粒组(P<0.05),达2.25nmol/mgprot。各个番茄红素处理组(1.5μmol/L、2.5μmol/L、7.5μmol/L)的MDA含量均不同程度的高于转染h SOD1-G93A组,分别为1.94 nmol/mgprot、1.46 nmol/mgprot、1.30 nmol/mgprot,呈剂量相关性,有统计学意义(P<0.05)。证实转染h SOD1-G93A能够引起NSC34细胞脂质过氧化损伤,番茄红素能够减轻这种损伤,减轻程度与给药浓度呈剂量相关性。3 NQO-1表达水平测定NQO-1是涉及对抗活性氧损伤的一种关键酶,在氧化应激条件下NQO-1的表达被诱导,为细胞提供多重保护。NSC34细胞转染h SOD1-G93A后24小时给予番茄红素(7.5μmol/L)、48小时收集细胞并提取细胞蛋白用于蛋白质免疫印迹,观测NQO-1蛋白表达水平的变化。结果显示,相比于空白对照组,转染h SOD1-G93A组NQO-1蛋白表达水平明显下降,为29.85%,番茄红素处理组(7.5μmol/L)NQO-1蛋白表达水平为67.01%,明显高于转染h SOD1-G93A组,有统计学意义(P<0.05)。4细胞凋亡率凋亡中、晚期细胞以及死亡细胞,细胞膜的完整性受到比较严重的破坏,碘化丙啶(PI)可进入细胞内将细胞核红染,可用来较为客观地判定细胞凋亡率。转染h SOD1-G93A 24小时后给予番茄红素处理(1.5μmol/L、2.5μmol/L、7.5μmol/L),48小时后收集细胞用于凋亡率检测。结果显示相比于转染h SOD1-G93A组40.08%的凋亡率,各番茄红素处理组(1.5μmol/L、2.5μmol/L、7.5μmol/L)细胞凋亡率均降低,分别为36.55%、30.15%、24.8%,且降低程度与番茄红素给药浓度呈剂量相关性,有统计学意义(P<0.05)。结论:番茄红素对转染h SOD1-G93A的NSC34细胞有保护作用,主要表现为:1减轻细胞脂质过氧化,且减轻程度与番茄红素浓度呈剂量相关性。2上调了NQO-1蛋白表达水平。3降低细胞凋亡率。(本文来源于《河北医科大学》期刊2015-03-01）
郑禄禄[2]（2015）在《番茄红素对转染SOD1-G93A的PC12细胞线粒体的保护作用》一文中研究指出肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)是一种运动神经系统的退行性疾病,上、下运动神经元均受累,临床上主要表现为肌肉逐渐萎缩与无力,最后在3-5年内因呼吸衰竭而死亡。5-10%的ALS是家族性ALS(f ALS),90%ALS是散发性ALS(s ALS)。关于ALS的发病机制,目前尚未完全清楚,可能与超氧化物歧化酶1(SOD1)基因突变、氧化应激、免疫学机制、线粒体功能障碍、神经元周围胶质细胞的异常、氧化毒性等有关,而突变的SOD1基因被认为是引起f ALS最常见的基因,现已报道了多个SOD1突变位点,其中以G93A突变位点最多,而向小鼠体内转入人突变的SODl-G93A后,小鼠模型也因与人有类似的临床发病特点而成为世界上公认的研究ALS的动物模型。随着大量研究的进展,人们发现线粒体功能障碍在ALS发生发展过程中起着非常关键的作用,线粒体功能障碍有可能是ALS发病的始动因素,而与ALS发病密切相关的SOD1就在线粒体上定位存在。更有研究发现,在ALS患者以及动物模型的运动神经元细胞中的确存在着大量形态异常的线粒体和突变蛋白的蓄积。SOD1的主要功能是通过歧化反应将线粒体内的有毒物质(如ROS)氧化,从而达到解毒的目的。而SOD1基因发生基因突变时,SOD1与锌的结合力下降,从而导致了对运动神经元的毒性,而引起患者出现线粒体空泡化和膨胀。并且,SOD1突变的蛋白凝集物会阻碍线粒体的运输通道,抑制线粒体的生物学功能,从而造成线粒体损伤,同时激活细胞凋亡因子,造成运动神经元死亡而发生ALS。动力相关蛋白(dynamin related protein1,Drp1)与线粒体动态变化有密切联系,是介导线粒体分裂的因子,在正常状态下,细胞内的Drp1大部分位于细胞质基质中,大约只有3%结合在线粒体的外膜上。哺乳动物的线粒体进行分裂时,线粒体分裂蛋白1(Fis1)会促进Drp1聚集到线粒体的外膜上,以促使线粒体发生分裂,故Drp1表达增强可致线粒体持续分裂而引起细胞凋亡。PC12细胞为大鼠嗜铬细胞瘤细胞,该细胞富含合成及分解多巴胺所必须的酪氨酸羟化酶,单胺氧化酶等,其化学特性十分接近中脑多巴胺能神经元,同时具备瘤细胞特性,因此广泛用于中枢神经系统变性疾病的研究。番茄红素(lycopene)是一种类胡萝卜素,是存在于植物中的一种天然色素,主要存在于番茄、胡萝卜、西瓜和番石榴中,其中番茄的含量最高,目前它是自然界的植物中发现的最强抗氧化剂之一,具有很强的抗氧化作用和清除自由基的能力,具有预防心脏病、保护心血管、减缓动脉粥样硬化、预防多种癌症、抗老化、保护皮肤等多种生理功能。其在阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease,AD)、帕金森病(Parkinson’s Disease,PD)等神经变性疾病中的保护作用已得到证实,但在ALS方面却未有报道。目的:本实验采用SOD1-G93A转染的PC12细胞制备ALS细胞模型,探讨番茄红素对转染所致的PC12细胞线粒体损伤的保护作用。方法:采用空(Empty,E)质粒、野生型(Wild Type,WT)质粒、SOD1-G93A质粒转染PC12细胞,显微镜下观察转染效率,选择转染效率达70%及以上的细胞孔,CCK-8检测细胞活力,并验证转染质粒后导致的细胞损伤。给予正常培养的细胞不同浓度的番茄红素(0、1、10、20、50、100μmol?L)处理,CCK-8检测细胞活力,观察药物对细胞的作用。使用SOD1-G93A质粒转染的PC12细胞,选择达转染效率的细胞孔,分别给予不同低浓度的番茄红素(0、0.1、0.5、1、5、10、20μmol?L)处理,CCK-8检测细胞活力,筛选番茄红素的最适药物浓度。将细胞分为正常细胞组,转染E质粒组(E),转染WT质粒组(WT),转染SOD1-G93A组(SOD1-G93A)。各组均分为空白对照组、番茄红素组,每组3个孔。番茄红素组使用含最适药物浓度的培养液培养细胞,对照组给予普通培养液培养。培养24小时后,mitotraker染色流式细胞仪检测ROS水平,激光共聚焦显微镜观察Drp1的变化,以观察番茄红素对SOD1-G93A转染的PC12细胞所致线粒体损伤的保护作用。结果:1转染E、WT、SOD1-G93A质粒后,显微镜下观察,选择转染效率达70%及以上的细胞孔,CCK-8检测细胞活力,E、WT、SOD1-G93A组与对照组比较,细胞活力逐渐下降,SOD1-G93A组细胞活力下降最明显,差异均有统计学意义(P﹤0.05)。E组与WT组比较,差异无统计学意义,SOD1-G93A组与E、WT组比较,差异有统计学意义(P﹤0.05),说明造模成功。2 CCK-8检测结果显示给予正常细胞不同浓度的番茄红素后,20μmol?L、50μmol?L、100μmol?L组与对照组比较,细胞活力明显下降,差异有统计学意义(P﹤0.05),说明高浓度的番茄红素可对细胞生长、存活产生不利影响,不可用于细胞实验。给予转染SOD1-G93A的细胞低浓度的番茄红素后,与对照组比较,细胞活力逐渐升高,至药物浓度为10μmol?L时,细胞活力达最高,后又下降,因此筛选出可用于实验的最适药物浓度为10μmol?L。3转染WT质粒与转染E质粒的PC12细胞相比,细胞内ROS水平升高(P﹤0.05),转染SOD1-G93A的PC12细胞与转染E质粒、转染WT质粒的细胞相比,转染表达G93A的PC12细胞ROS水平明显升高(P﹤0.05)。转染SOD1-G93A的PC12细胞与转染E质粒、WT质粒的细胞相比,Drp1水平明显升高,说明转染表达G93A的PC12细胞存在线粒体损伤。4用最适药物浓度的番茄红素干预PC12细胞,E、WT、SOD1-G93A各组番茄红素组与对照组比较,ROS含量均明显降低(P﹤0.05),Drp1含量减少。结论:1成功制备了ALS的细胞模型,转染表达SOD1-G93A的PC12细胞存在线粒体损伤。2合适浓度的番茄红素可提高细胞活力,对G93A-SOD1转染的PC12细胞有保护作用。3番茄红素可协助清除ALS细胞模型内过量堆积的活性氧及降低Drp1的含量,这可能是番茄红素保护线粒体、减轻细胞损伤的可能机制之一。(本文来源于《河北医科大学》期刊2015-03-01）
番茄转染论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)是一种运动神经系统的退行性疾病,上、下运动神经元均受累,临床上主要表现为肌肉逐渐萎缩与无力,最后在3-5年内因呼吸衰竭而死亡。5-10%的ALS是家族性ALS(f ALS),90%ALS是散发性ALS(s ALS)。关于ALS的发病机制,目前尚未完全清楚,可能与超氧化物歧化酶1(SOD1)基因突变、氧化应激、免疫学机制、线粒体功能障碍、神经元周围胶质细胞的异常、氧化毒性等有关,而突变的SOD1基因被认为是引起f ALS最常见的基因,现已报道了多个SOD1突变位点,其中以G93A突变位点最多,而向小鼠体内转入人突变的SODl-G93A后,小鼠模型也因与人有类似的临床发病特点而成为世界上公认的研究ALS的动物模型。随着大量研究的进展,人们发现线粒体功能障碍在ALS发生发展过程中起着非常关键的作用,线粒体功能障碍有可能是ALS发病的始动因素,而与ALS发病密切相关的SOD1就在线粒体上定位存在。更有研究发现,在ALS患者以及动物模型的运动神经元细胞中的确存在着大量形态异常的线粒体和突变蛋白的蓄积。SOD1的主要功能是通过歧化反应将线粒体内的有毒物质(如ROS)氧化,从而达到解毒的目的。而SOD1基因发生基因突变时,SOD1与锌的结合力下降,从而导致了对运动神经元的毒性,而引起患者出现线粒体空泡化和膨胀。并且,SOD1突变的蛋白凝集物会阻碍线粒体的运输通道,抑制线粒体的生物学功能,从而造成线粒体损伤,同时激活细胞凋亡因子,造成运动神经元死亡而发生ALS。动力相关蛋白(dynamin related protein1,Drp1)与线粒体动态变化有密切联系,是介导线粒体分裂的因子,在正常状态下,细胞内的Drp1大部分位于细胞质基质中,大约只有3%结合在线粒体的外膜上。哺乳动物的线粒体进行分裂时,线粒体分裂蛋白1(Fis1)会促进Drp1聚集到线粒体的外膜上,以促使线粒体发生分裂,故Drp1表达增强可致线粒体持续分裂而引起细胞凋亡。PC12细胞为大鼠嗜铬细胞瘤细胞,该细胞富含合成及分解多巴胺所必须的酪氨酸羟化酶,单胺氧化酶等,其化学特性十分接近中脑多巴胺能神经元,同时具备瘤细胞特性,因此广泛用于中枢神经系统变性疾病的研究。番茄红素(lycopene)是一种类胡萝卜素,是存在于植物中的一种天然色素,主要存在于番茄、胡萝卜、西瓜和番石榴中,其中番茄的含量最高,目前它是自然界的植物中发现的最强抗氧化剂之一,具有很强的抗氧化作用和清除自由基的能力,具有预防心脏病、保护心血管、减缓动脉粥样硬化、预防多种癌症、抗老化、保护皮肤等多种生理功能。其在阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease,AD)、帕金森病(Parkinson’s Disease,PD)等神经变性疾病中的保护作用已得到证实,但在ALS方面却未有报道。目的:本实验采用SOD1-G93A转染的PC12细胞制备ALS细胞模型,探讨番茄红素对转染所致的PC12细胞线粒体损伤的保护作用。方法:采用空(Empty,E)质粒、野生型(Wild Type,WT)质粒、SOD1-G93A质粒转染PC12细胞,显微镜下观察转染效率,选择转染效率达70%及以上的细胞孔,CCK-8检测细胞活力,并验证转染质粒后导致的细胞损伤。给予正常培养的细胞不同浓度的番茄红素(0、1、10、20、50、100μmol?L)处理,CCK-8检测细胞活力,观察药物对细胞的作用。使用SOD1-G93A质粒转染的PC12细胞,选择达转染效率的细胞孔,分别给予不同低浓度的番茄红素(0、0.1、0.5、1、5、10、20μmol?L)处理,CCK-8检测细胞活力,筛选番茄红素的最适药物浓度。将细胞分为正常细胞组,转染E质粒组(E),转染WT质粒组(WT),转染SOD1-G93A组(SOD1-G93A)。各组均分为空白对照组、番茄红素组,每组3个孔。番茄红素组使用含最适药物浓度的培养液培养细胞,对照组给予普通培养液培养。培养24小时后,mitotraker染色流式细胞仪检测ROS水平,激光共聚焦显微镜观察Drp1的变化,以观察番茄红素对SOD1-G93A转染的PC12细胞所致线粒体损伤的保护作用。结果:1转染E、WT、SOD1-G93A质粒后,显微镜下观察,选择转染效率达70%及以上的细胞孔,CCK-8检测细胞活力,E、WT、SOD1-G93A组与对照组比较,细胞活力逐渐下降,SOD1-G93A组细胞活力下降最明显,差异均有统计学意义(P﹤0.05)。E组与WT组比较,差异无统计学意义,SOD1-G93A组与E、WT组比较,差异有统计学意义(P﹤0.05),说明造模成功。2 CCK-8检测结果显示给予正常细胞不同浓度的番茄红素后,20μmol?L、50μmol?L、100μmol?L组与对照组比较,细胞活力明显下降,差异有统计学意义(P﹤0.05),说明高浓度的番茄红素可对细胞生长、存活产生不利影响,不可用于细胞实验。给予转染SOD1-G93A的细胞低浓度的番茄红素后,与对照组比较,细胞活力逐渐升高,至药物浓度为10μmol?L时,细胞活力达最高,后又下降,因此筛选出可用于实验的最适药物浓度为10μmol?L。3转染WT质粒与转染E质粒的PC12细胞相比,细胞内ROS水平升高(P﹤0.05),转染SOD1-G93A的PC12细胞与转染E质粒、转染WT质粒的细胞相比,转染表达G93A的PC12细胞ROS水平明显升高(P﹤0.05)。转染SOD1-G93A的PC12细胞与转染E质粒、WT质粒的细胞相比,Drp1水平明显升高,说明转染表达G93A的PC12细胞存在线粒体损伤。4用最适药物浓度的番茄红素干预PC12细胞,E、WT、SOD1-G93A各组番茄红素组与对照组比较,ROS含量均明显降低(P﹤0.05),Drp1含量减少。结论:1成功制备了ALS的细胞模型,转染表达SOD1-G93A的PC12细胞存在线粒体损伤。2合适浓度的番茄红素可提高细胞活力,对G93A-SOD1转染的PC12细胞有保护作用。3番茄红素可协助清除ALS细胞模型内过量堆积的活性氧及降低Drp1的含量,这可能是番茄红素保护线粒体、减轻细胞损伤的可能机制之一。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
番茄转染论文参考文献
[1].王珏.番茄红素对转染hSOD1-G93A的NSC34细胞的保护作用及机制研究[D].河北医科大学.2015
[2].郑禄禄.番茄红素对转染SOD1-G93A的PC12细胞线粒体的保护作用[D].河北医科大学.2015