一、一种灵敏检测慢性粒细胞性白血病融合基因的方法:RT-nested-PCR（论文文献综述）
罗妮妮[1]（2020）在《基于基因融合介导滚环扩增的BCR/ABLp210超灵敏分型新方法》文中进行了进一步梳理BCR/ABLp210融合基因是慢性粒细胞白血病（CML）的特征分子标志物,它包含e13a2和e14a2两种转录亚型,虽然这两种转录亚型之间只有75个碱基的不同,但其导致的病人病理特征和对靶向药物的应答均存在差异。目前国内外实验室对这两种转录亚型的鉴别还缺乏简单、快速的检测方法。本课题提出RNA融合触发滚环扩增（RF-RCA）策略,直接扩增RNA提取物,对e13a2和e14a2两种转录亚型进行区分,能够一步辨别e14a2与e13a2两种融合亚型。在本方案中,哑铃模板及特异性引物与靶融合RNA同时结合,可诱导特异性引物与哑铃型模板的邻位杂交,触发RCA产生大量串联重复G-四联体序列,在硫黄素T和G-四联体相互作用下实现实时荧光输出。该研究策略敏感性高、特异性强,可检测到低至0.1aM的靶融合基因,也可直接从复杂的基因组RNA提取物中识别0.01%的e13a2和0.1%的e14a2转录亚型。此外,我们成功地将RF-RCA技术应用于临床样本BCR/ABLp210亚型的分析中,对患者进行精确地分子分型并可监测伊马替尼治疗效果。本课题所建立的RF-RCA策略可快速、简便鉴别BCR/ABLp210融合亚型,为临床研究和CML的个体化治疗提供了一个超灵敏、准确、实用的检测工具。
孙伊娜[2]（2019）在《MLL基因重排阳性儿童急性淋巴细胞白血病预后相关因素分析与研究》文中研究表明随着诊断及治疗方法的不断改进,目前国内外儿童急性淋巴细胞白血病（ALL）治愈率已经比较高,但仍有一些儿童难治或复发,其中混合谱系白血病（MLL）基因重排儿童ALL是公认的预后不良类型之一。不同年龄、伙伴基因、治疗策略和早期治疗反应对MLL基因重排白血病预后有很大差异。随着二代测序技术的日益成熟,RNA-seq技术逐步应用于白血病的基因诊断,对于精准的鉴定不良预后基因,显得极为重要。本研究从临床特征、治疗反应及差异表达基因几个方面分析和研究MLL重排阳性儿童ALL预后不良因素,为进一步分层及个体化治疗奠定基础。第一部分 MLL基因重排儿童急性淋巴细胞白血病接受CCLG-ALL2008方案治疗疗效和预后因素分析目的:探讨MLL基因重排儿童ALL接受CCLG-ALL2008方案治疗疗效和预后相关因素。方法:2008年4月至2015年10月共227例ALL患儿接受CCLG-ALL2008高危组方案治疗,其中MLL阳性30例,BCR/ABL阳性24例,MLL和BCR/ABL双阴性173例,MLL阴性197例。MLL阳性组分别与BCR/ABL 阳性组、MLL及BCR/ABL双阴性组和MLL阴性组比较临床特征和治疗反应,并长期随访,对组间及组内进行生存分析。结果:1、MLL阳性组与其它组比较:年龄<2岁比例较其他组明显增高;第15天骨髓非M1（原始+幼稚细胞<5%）比例明显低于阴性组和双阴性组;第33天完全缓解（CR）患儿较BCR/ABL 阳性组明显增高;第33天骨髓MRD≥1×10-2比例较BCR/ABL 阳性组明显低。10年总生存率（OS）和无复发生存率（RFS）MLL阳性组比BCR/ABL 阳性组高。2、MLL阳性组内比较:年龄<2岁患儿10年OS和RFS显着低于年龄≥2岁患儿。强的松不敏感患儿10年OS和RFS显着低于强的松敏感患儿。第33天未缓解（NR）组10年OS和RFS显着低于CR组。多变量COX回归分析发现:年龄、基因重排形式、强的松反应对患儿生存期有影响。结论:CCLG-ALL2008高危组方案对于年龄<2岁、MLL/AF4重排、强的松反应不敏感和第33天未缓解患儿治疗效果不佳;年龄<2岁、MLL/AF4重排、强的松不敏感以及第33天未缓解与MLL重排儿童ALL预后不良相关。第二部分 应用RNA-seq初步研究MLL重排儿童急性淋巴细胞白血病差异表达基因与预后的相关性目的:应用RNA-seq技术鉴定MLL基因及伙伴基因,通过分析差异表达基因,推测预后不良基因。方法:1、2014年4月至2018年4月在苏州大学附属儿童医院接受正规治疗的15例MLL重排阳性及5例阴性儿童ALL病例,用RNA-seq测定基因表达及鉴定伙伴基因。2、差异表达基因（DEGs）通过Cuffdiff算法来分析,并对DEGs进行GO功能和KEGG信号通路富集分析,通过分析前20个差异最显着DEGs富集到有意义的GO功能和KEGG信号通路,筛选出预后相关基因。结果:1、通过RNA-seq 15例ALL病例全部鉴定出MLL基因及伙伴基因。2、差异表达基因分析发现,MLL重排阳性组对阴性组,复发组对未复发组,泼尼松耐药组对敏感组,存在明显的差异表达基因;前20上调DEGs富集到有意义的GO功能和 KEGG 信号通路,MLL 阳性组有:CCNA1、LAMP5、CXCL8、MAP7、IL1RL1、NTRK1、PROM1;复发组中有:IL1RL1、GATA2、IL5RA、CXCL8、CXCR2、CXCR1。结论:1、RNA-seq鉴定融合基因非常精准,有望成为白血病分子生物学诊断新方法。2、CXCL8、IL1RL1、CCNA1、LAMP5、PROM1、GATA2、CXCR2 以及 CXCR1高表达可能与MLL重排阳性儿童ALL预后不良相关。
段郁[3]（2019）在《基于核酸酶和杂交链式反应检测白血病融合基因的超灵敏电化学新方法》文中研究说明慢性粒细胞性白血病（CML）是一种由多能造血干细胞肿瘤增生引起的恶性克隆骨髓增生性疾病,对人类的生命健康具有极大威胁。由于大多数CML患者在患病初期的3-5年内不会有明显的症状,因此CML的早期诊断依然存在困难。根据世界卫生组织（WHO）2016年修订的白血病分型标准,白血病融合基因是该疾病发生发展的关键性驱动因素,而且特征性的融合基因检查结果也是白血病分子生物学诊断的重要依据。因此特异性的融合基因位点既是白血病诊断分型、疗效监测的重要标志物,也是白血病精准医疗需要检测的关键。本课题建立了一种基于多部件核酸酶（MNAzyme）和单链脱氧核糖核酸链（ssDNA）辅助级联杂交反应的检测BCR/ABL融合基因的超敏特异性电化学检测方法。在Mg2+存在下,两条拆分核酶序列通过对目标物的特异性识别和互补结合,形成稳定的活性MNAzyme,引发对底物发夹探针（HP）的剪切反应裂解茎环产生多条触发链。这些触发链可以与固定在金电极表面的捕获探针以及生物素化的杂交探针P1和P2通过碱基互补配对连接,从而引发电极表面的非均质ssDNA辅助的级联杂交反应。链霉亲和素修饰的碱性磷酸酶（ST-AP）可以通过与特异的亲和反应与富含生物素的杂交长链复合体结合,最终通过碱性磷酸酶催化反应底液中的α-萘基磷酸酯（α-NPP）产生可识别的电化学信号。该生物传感器对目标基因具有高灵敏度和特异性,其检测限可达到21.9 fM,且传感器已成功应用于复杂样品中目标BCR/ABL基因的检测。因此该生物传感器设计策略为慢CML分子诊断融合基因的超灵敏检测提供了一个简单实用的新思路。
宋红云[4]（2019）在《复杂核型急性白血病患者的临床特征及预后分析》文中研究表明背景:急性白血病（acute leukemia,AL）是一类造血干细胞的恶性克隆性疾病,随着近年来医疗水平的提高以及新治疗手段的应用,其预后取得了一定的进展。然而近年来分子生物学和细胞遗传学的快速发展,人们认识到AL的染色体变化不仅从分子遗传水平反映了AL的生物学本质,而且其染色体畸变类型具有重要的诊断和预后价值。染色体异常包括数目和结构的改变,根据其涉及染色体异常的程度不同,分为正常核型（normal karyotype,NK）、单体核型（monomer karyotype,MK）及复杂核型（complex karyotype,CK）。当涉及2条以上染色体和（或）存在3个以上断裂位点的染色体畸变时,即为复杂核型。复杂核型不仅发生于血液肿瘤,实体肿瘤中也可出现。目前复杂核型AL在AL患者中的发生率低,但多项研究表明其完全缓解率（complete remission,CR）低、预后极差。目前仍没有针对复杂核型AL有效的治疗手段。临床上多根据患者针对治疗的具体疗效不断改变治疗措施,以期达到提高缓解率、改善预后目的。目的:探讨伴有复杂核型的急性白血病（AL）患者的临床特征及其与预后的关系。方法:选取我院2008年10月至2018年06月期间诊断的并行染色体检查的AL患者281例（除外急性早幼粒细胞白血病及24例骨髓染色体培养失败的患者）作为筛查对象,其中复杂核型、非复杂核型AL患者分别为33例、248例,33例复杂核型AL患者作为研究组,并从248例非复杂核型AL患者中随机抽取43例患者作为对照组。所有患者均行骨髓形态学、骨髓免疫分型、染色体核型及融合基因等检查,收集、总结其临床和实验室资料,分析临床特点、及其与预后之间的关系。结果:（1）本研究中,复杂核型AL在AL（除外急性早幼粒细胞白血病）患者中的发生率为11.7%（33/281,AML 11.2%,ALL 12.8%）。复杂核型AL与非复杂核型AL患者在性别、年龄、治疗前血细胞、骨髓及外周血原始细胞、骨髓CD34阳性率及是否存在髓外浸润等指标无统计学差异（P>0.05）,而在既往恶性血液病病史或病态造血的差异有统计学意义（P=0.010）。（2）复杂核型AL患者的完全缓解（CR）率为59.4%,低于非复杂核型AL患者CR率85%（P=0.023）;复杂核型急性髓系白血病（AML）患者CR率为47.6%低于非复杂核型AML患者的CR率79.3%（P=0.020）;复杂核型AL患者核型复杂程度高的CR率低于核型复杂程度低的CR率（P=0.036）。（4）应用Kaplan-Meier进行生存分析,复杂核型组和非复杂核型组患者中位无复发生存时间（RFS）分别为162天、462天,中位生存时间（OS）分别为256天、769天,差异均有统计学意义（P分别为0.002、<0.001）。AML患者中,两组的中位OS分别为125天、741天;急性淋巴细胞白血病（ALL）患者中,两组的中位OS分别为293天、939天,差异均有统计学意义（P分别为<0.001、008）。结论:复杂核型AL较同期非复杂核型AL患者比较,多伴有既往恶性血液病病史或骨髓病态造血。复杂核型AL较同期非复杂核型AL患者比较,CR率低、RFS短、OS短。复杂核型AL患者染色体复杂程度高,CR率低。复杂核型AML患者CR率低、OS短,复杂核型ALL患者OS短。
付煜[5]（2018）在《Armored RNA技术在登革热病毒及白血病BCR-ABL1p210/p190融合基因检测中的应用研究》文中指出Armored RNA技术是近年来发展起来的一种主要用于制备RNA质控品和标准品的技术。其原理是利用基因工程手段将载有大肠杆菌MS2噬菌体衣壳蛋白的基因序列和外源性基因序列克隆到表达载体中,然后将外源性基因片段转录成RNA,并包裹在MS2衣壳蛋白基因表达的衣壳蛋白中,最终装配成球状RNA-蛋白质复合体,一般称为“盔甲RNA”（armored RNA）,或MS2病毒样颗粒（MS2 virus-like particle,MS2 VLP）。由于有外层衣壳蛋白的保护,内部的RNA片段能抵抗环境中存在的RNA酶的降解而保持稳定;同时,armored RNA整体结构又很好模拟了病毒的天然属性。所以,armored RNA技术在疾病诊断,尤其是在感染性疾病的诊断中具有很大的临床应用价值。我们前期的研究已经使用armored RNA技术成功制备了流行性感冒、埃博拉以及中东呼吸综合征等多种相关疾病病毒的armored RNAs,并在国内成功开展了这些项目核酸检测的室间质量评价（External quality assessment,EQA）。登革热是由登革热病毒引起、经伊蚊传播的一种急性传染病。登革热在世界上广泛传播,但主要在热带和亚热带流行,给流行地区带了极大的经济负担和社会负担。2014年,广州因输入性病例而爆发登革热,并蔓延至全省20多个地级市和其他省份,全国全年累计病例超过4.6万;2015年至2017年,全国每年都有数千例登革热病毒感染的相关报道。慢性粒细胞性白血病（Chronic myeloid leukemia,CML）和急性淋巴细胞白血病（Acute lymphocytic leukemia,ALL）是白血病中比较常见的两种类型。绝大多数CML和少部分ALL患者以出现费城染色体（Philadelphia chromosome,Ph）为主要特征。Ph为22号染色体与9号染色体发生易位形成新的染色体,表现为22号染色体长臂区段易位至9号染色体长臂上,致使基因BCR（Breakpoint cluster region）和ABL1基因融合（BCR-ABL1）,即t（9;22）（q34;q11）,其中 CML 以 p210 型 BCR-ABL1 融合基因（Fusion gene,FG）为主,ALL以p190型BCR-ABL1融合基因为主。针对登革热病毒核酸和BCR-ABL1融合基因转录本的荧光定量PCR（RT-qPCR）技术是一种常规、快速的检测方法,在登革热和白血病的诊断和病情评估中发挥着非常重要的作用,目前被国内绝大多数实验室使用。但是,RT-qPCR核酸分子检测由于操作步骤较多,容易受很多因素影响,导致检测结果不稳定。EQA可用于比较不同实验室之间的检测结果,可以发现实验室检测中存在的问题,是一种提高实验室内部检测能力的有效手段。目前,不管是登革热还是白血病,在国内都还没有开展RT-qPCR核酸分子检测相关的EQA活动。基于此,本研究使用armored RNA技术制备了登革热病毒检测质评样本（见第一部分）和BCR-ABL1融合基因检测质评样本（见第二部分）,并首次在国内开展了这两个项目的EQA活动。在第一部分中,我们制备了登革热病毒1～4型质评样本,每型包含5支阳性样本和3支阴性样本,全国共计20家实验室参加。结果显示,参评实验室对质评样本检测的准确度、灵敏度和特性度分别为89.6%（569/635）,85.1%（336/395）和97.1%（233/240）。5家实验室检测结果的正确率为100.0%,评为“优秀”;11家实验室检测结果的正确率介于80.0～100.0%,评为“合格”;4家实验室检测结果的正确率小于80.0%,评为“不合格”。在第二部分中,我们制备了 p210型和p190型BCR-ABL1质评样本,每种质评样本包含9支不同%BCR-ABL1比值的阳性样本（其中1支为基准样本）和1支阴性样本,全国共计66家实验室参加。结果显示,对同一个样本来说,不同实验室检测结果的极差,即检测结果的最大值和最小值相差很大,不管是p210 BCR-ABL1检测结果还是p190 BCR-ABL1检测结果,样本变异系数（CV%）基本超过60%,部分样本超过100.0%,甚至超过200.0%;但是,总体来看p210样本检测结果的CV%稍低于p190样本。对24家可以转化至国际单位（International scale,IS）的实验室来说,p210 BCR-ABL1检测结果经过转换系数（Conversion factor,CF）换算后,所有样本检测结果的CV%均降低;但是,3家实验室的%BCR-ABL1IS上报结果较转换前反而偏离检测均值。随访后发现,其中2家实验室RT-qPCR检测平台的组分发生改变导致CF变化而影响了%BCR-ABL1转化。最后,按照UK NEQAS评分标准,分别有47家和51家实验室通过本次BCR-ABL1融合基因检测EQA。第一部分和第二部分的研究结果说明,不管是登革热病毒,还是BCR-ABL1融合基因的RT-qPCR核酸检测,在我国的实验室都存在一些问题。解决这些问题,对降低我国临床实验室对登革热和白血病检测结果的变异,以及提高临床医师对这两类疾病的诊断和管理水平非常重要。使用统一的标准品可以降低BCR-ABL1融合基因在不同实验室检测结果之间的变异;但是,目前国内外使用的标准品,基本上都是质粒或cDNA。质粒或cDNA做为标准品不能反应RNA提取和cDNA合成过程。基于此,本研究使用armored RNA技术制备了 p210型和p190型BCR-ABL1融合基因标准品（见第三部分）。在该部分中,为了消除使用不同标准曲线对BCR-ABL1融合基因和内参基因引起的变异,我们通过重叠PCR（Overlap extension PCR,OE-PCR）技术将p210型或p190型BCR-ABL1FG与内参基因（Controlgene,CG）进行了1:1连接;同时,为了提高p210型和p190型BCR-ABL1融合基因标准品的适用性,我们选择了 4种国际推荐的CGs（ABL1、BCR、GUSB以及B2M）。本研究制备的标准品（命名为p210FG-CG和p190FG-CG）随第二部分中p210型和p190型BCR-ABL1质评样本一起发放至参评实验室进行评估。结果显示,当使用当地标准品时,检测结果CV%大于80%的p210和p190模拟样本分别占33.3%（3/9）和 55.6%（5/9）;CV%介于 50%～80%分别占 66.7%（6/9）和 44.4%（4/9）;两个项目均无样本检测结果CV%小于50%。当使用p210FG-CG和P190FG-CG标准品时,检测结果CV%大于80%、介于50%～80%和小于50%的模拟样本均占33.3%（3/9）。另外,本研究还发现,不管是p210质评项目还是p190质评项目,对使用自建方法（Laboratory developed tests,LDT）或使用过柱法进行RNA抽提的实验室来说,BCR-ABL1检测结果的变异度明显小于使用商品化试剂盒和TRIzol试剂的实验室。该部分研究说明,使用p210FG-CG或P190FG-CG统一的标准品可以在一定程度降低不同实验室之间检测结果变异度,尤其是对使用LDT或使用过柱法进行RNA抽提的实验室。虽然通过使用统一的标准品可以提高实验室检测结果的一致性,但是不能将当地实验室%BCR-ABL1结果溯源至%BCR-ABL1IS。目前,国际上已经通过两条主要途径实现了 p210型BCR-ABL1融合基因检测的标准化,这两条途径为样本交换和参考物质。但是,通过样本交换的形式进行%BCR-ABL1溯源,整个过程费时、费力,仅适合部分实验室;同时,目前p190型BCR-ABL1融合基因检测尚未实现标准化。所以,为了更好地实现我国BCR-ABL1融合基因检测的标准化,尤其是对p190型BCR-ABL1融合基因,我们用armoredRNA技术制备包含p210和p190型BCR-ABL1融合基因的二级参考物质（见第四部分）。为了保证p210和p190型BCR-ABL1融合基因RT-qPCR扩增片段的长度不发生变化,我们通过三轮OE-PCR将p190 BCR-ABL1融合基因外显子e1下游75bp完全替换p210 BCR-ABL1融合基因的e14外显子（75bp）。4个水平的BCR-ABL1融合基因二级参考物质制备成功后,使用1st WHO国际白血病BCR-ABL1融合基因定量检测基因参考盘（NIBSC编码:09/138）进行定值,并在国内41家实验室进行区域性验证。结果显示,在33家参加的实验室中,获得有效转化系数的实验室为25家（p210）和28家（p190）,分别占75.8%和84.8%。对15家获得有效CF的IS实验室中,通过二级参考物质获得的CF与通过样本交换方式获得CF 一致的实验室占80.0%（12/15）。综上所述,本研究成功地利用armored RNA技术制备了登革热病毒和白血病BCR-ABL1p210/p190融合基因质评样本、BCR-ABL1p210/p190融合基因标准品和二级参考物质。本研究所做的工作对发现我国实验室在登革热和白血病的核酸检测中存在的问题并寻求解决方案,以提高实验室的检查能力有积极的促进作用,尤其是对提高我国实验室白血病BCR-ABL1融合基因检测的一致性及推动白血病BCR-ABL1融合基因检测的标准化进程等方面将发挥关键的作用。
张小燕[6]（2017）在《探讨IL-7在骨髓间充质干细胞促进慢粒白血病细胞对TKIs耐药中的作用及其机制》文中提出研究背景和目的:慢性粒细胞性白血病（chronic myeloid leukemia,CML）是一种起源于造血干细胞的恶性克隆增殖性疾病,主要特点是具有BCR/ABL融合基因。酪氨酸激酶抑制剂（Tyrosine kinase inhibitors,TKIs）伊马替尼,尼罗替尼等作为分子靶向药物,在治疗CML中已经取得了显着的效果。但是随着治疗的进行,约有15%-25%的病人逐渐对TKIs产生耐药。一些慢性期病人存在原发性耐药。存在BCR-ABL激酶位点突变时,特别是T3151突变,40%的病人对TKIs产生耐药。这些耐药现象的发生具体机制尚不十分清楚。近年来大量研究表明,骨髓微环境在白血病的耐药中发挥重要的作用。骨髓间充质干细胞是骨髓微环境中最重要的细胞之一,不仅可分化成各种各样的基质细胞如脂肪细胞、成纤维细胞等,而且可以分泌细胞外基质蛋白,细胞因子,生长因子等。IL-7是其分泌的细胞因子之一,能促进白血病细胞的DNA合成,与血液系统肿瘤的发生发展关系密切。本研究主要探讨慢性粒细胞白血病病人骨髓中IL-7的表达情况,并研究IL-7在骨髓间充质干细胞促进慢粒白血病细胞对TKIs耐药中的作用及其机制。方法:1.收集24例慢性粒细胞白血病耐药病人（RCML）、非耐药病人（SCML）和健康人（NC）的骨髓,通过采用高灵敏的IL-7 ELISA检测试剂盒检测骨髓中IL-7表达水平,并用荧光定量PCR检测骨髓单个核细胞中IL-7基因的表达。2.采用Ficoll密度梯度离心法原代分离和培养慢性粒细胞白血病耐药病人骨髓间充质干细胞（RMSCs）、非耐药病人骨髓间充质干细胞（SMSCs）和健康人的骨髓间充质干细胞（NCMSCs）,ELISA法检测RMSCs、SMSCs和NCMSCs培养液中IL-7表达水平。3.选用原代培养的NCMSCs、SMSCs和RMSCs在体外模拟健康人的骨髓微环境和CML病人的骨髓微环境,K562和BV173细胞株模拟CML白血病细胞,将白血病细胞与骨髓间充质干细胞共培养,构建出类似人体骨髓造血微环境对CML白血病细胞调控的模型。4.将NCMSCs,SMSCs和RMSCs按不同比例与K562/BV173细胞共培养,观察各组白血病细胞的增殖随MSCs浓度的变化。将NCMSCs,SMSCs和RMSCs与K562/BV173细胞共培养不同时间,观察各组白血病细胞的增殖随时间的变化。采用CCK8检测共培养的K562和BV173细胞的增殖。采用流式细胞仪检测细胞周期的变化。在共培养组分别加入伊马替尼和尼罗替尼药物干预,AnnexinV/PI双染法检测细胞凋亡以及对TKIs敏感性的变化。采用Western blot检测BCR/ABL、PI3K/AKT和JAK/STAT信号通路相关蛋白分子的表达。5.在RMSCs+K562共培养组,加入IL-7抗体或敲降RMSCs的IL-7基因,观察K562细胞在伊马替尼和尼罗替尼药物处理后,细胞增殖和凋亡的变化以及JAK/STAT信号通路相关蛋白分子的表达。6.将NCMSCs,SMSCs和RMSCs与K562细胞共同接种到BALB/c-nu裸鼠体内,建立皮下移植瘤模型,观察三种不同的骨髓间充质干细胞在体内对白血病细胞增殖、凋亡和耐药性的影响以及JAK/STAT信号通路相关蛋白分子的表达。结果:1.成功分离培养原代的NCMSCs,SMSCs和RMSCs细胞。三种MSCs形态相似,均为长梭形,成纤维细胞样,并呈漩涡状生长。流式细胞术鉴定所得细胞的免疫表型符合骨髓间充质干细胞的特点。2.ELISA检测结果显示,RCML病人骨髓中IL-7水平明显高于SCML病人和NC组。RMSCs培养液中,IL-7明显高于相应NCMSCs组和SMSCs组。3.荧定光量PCR检测结果显示RCML组骨髓单个核细胞中的IL-7mRNA的表达量明显增高。而SCML组与NC组相比,无显着性差别。4.共培养实验发现,不同MSCs对白血病细胞的增殖抑制呈浓度依赖性。低浓度的骨髓间充质干细胞对白血病细胞增殖无明显影响,高浓度的骨髓间充质干细胞能够显着抑制白血病细胞的增殖,而且随着间充质干细胞比例的升高,抑制作用增强。MSCs对白血病细胞增殖的影响呈现时间依赖性。随着时间的延长,MSCs对白血病细胞增殖的抑制作用增强。但是三种不同的骨髓间充质干细胞对白血病细胞的增殖抑制率无明显差别。5.细胞周期检测发现,随着共培养时间的延长,细胞周期发生了明显阻滞,S期的比例减少,G0/G1期细胞比例增加。但在K562+NCMSCs,K562+SMSCs,K562+RMSCs三个共培养组之间,无明显差别。6.加入IM或NI药物干预后结果显示,随着IM或NI药物浓度的增加,白血病细胞的增殖率逐渐减弱,凋亡率逐渐增加,NCMSCs、SMSCs和RMSCs三组均呈现这种趋势。但观察同一药物浓度下,各共培养组的增殖率发现,K562+RMSCs组,K562细胞增殖率明显高于对照组、NCMSCs和SMSCs组,而凋亡率明显低于对照组、NCMSCs和SMSCs组。在K562+RMSCs组加入IL-7中和抗体和敲降RMSCs的IL-7基因后,其增殖率下降,凋亡率增高。这些结果表明,RMSCs可以促进了酪氨酸激酶抑制剂处理后的K562细胞的增殖,抑制其凋亡,对K562细胞起到保护作用,这种保护作用与IL-7有关。7.采用Western blot检测相关信号通路蛋白的表达,结果发现RMSCs诱导的IM/NI耐药是BCR/ABL非依赖性的,且PI3K/AKT信号通路未参与,而是IL-7/JAK1/STAT5信号通路介导了RMSCs引起的慢粒白血病细胞对酪氨酸激酶抑制剂耐药。8.裸鼠皮下移植瘤实验表明,RMSCs能够保护白血病细胞,使其细胞凋亡减少,细胞存活增加从而促进其耐药,这种保护作用与Caspase 3和Bcl-2相关。进一步检测相关的信号通路,发现pJAK1和pSTAT5蛋白水平在K562+RMSCs皮下瘤块组织中明显高于其他组。敲降了RMSCs的IL-7基因后,瘤块组织中pJAK1和pSTAT5蛋白水平表达下降,提示IL-7/JAK1/STAT5信号通路参与了体内RMSCs促白血病细胞耐药作用。结论:慢性粒细胞白血病耐药病人骨髓间充质干细胞分泌IL-7异常增高,可通过BCR/ABL非依赖的方式,激活白血病细胞JAK1/STAT5信号通路,从而促进其对酪氨酸激酶抑制剂耐药,这可能为慢性粒细胞白血病的治疗提供新的靶点。
陈锦元[7]（2017）在《工具酶辅助信号放大的DNA电化学传感器》文中提出基因检测在疾病早期诊断、预后评估及药物治疗指导等方面具有重要意义,因而在临床医学方面具有举足轻重的地位。为了提高临床医疗效率和降低医疗成本,使医学服务于广大人民群众,未来的基因检测将朝着床边诊断系统发展。DNA电化学传感器具有易于微型化、快速、高通量、高灵敏度、高特异性和价格低廉等优点,因而具有广阔的临床应用前景。为了实现实际样品中核酸的痕量分析,通过信号放大途径提高灵敏度尤为重要。基于分子生物学中工具酶的高催化能力、高生物相容性、高特异性和高灵活性等特征,本论文利用工具酶通过引入多个信号分子或使目标链放大等方式构建简单、超灵敏的DNA电化学传感器,实现了对复杂实际样品的检测,为DNA电化学传感器广泛应用于临床奠定扎实的基础,本论文主要研究工作如下:（1）在第一部分中,利用末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxyribonucleotide transferase,TdT）在恒温条件下无需模板即可催化多个脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）聚合到DNA分子的3’羟基末端的特点,构建了植入模式（grafting-to mode）的DNA电化学传感器。与传统的TdT介导的基于界面起始聚合（surface-initiated enzymatic polymerization,SIEP）模式的电化学传感器不同,本实验采用先均相延伸后固相杂交的方法引入多个信号分子。实验结果表明,SIEP模式所存在的高背景问题是由于TdT在界面作用时所产生,而并非是由探针的非特异性吸附所引起。然而,植入模式可以避免高背景的产生,使用较高的酶量即可快速的完成反应,所需反应时间从120 min降至20 min。通过对检测性能多方面的比较,植入模式在背景、时间、电流值等方面均显着优于SIEP模式。（2）在第二部分中,基于连接酶链式反应（ligation chain reaction,LCR）提出了一种简便、实用的双链组装型DNA电化学传感器。通过均相LCR扩增得到大量两端分别修饰有巯基和生物素的短双链DNA（dsDNA）片段,具有刚性结构的dsDNA通过金-硫键均匀的分布在牛血清白蛋白（bovine serum albumin,BSA）组装界面上,而末端生物素通过与链霉亲和素的特异性结合将HRP固定到金电极表面,最后通过辣根过氧化物酶（horeseradish peroxidase,HRP）催化TMB-H2O2底物进行电化学检测。结果表明,在目标DNA浓度为1.0×10-161.0×10-1111 M时,安培电流与和浓度对数值呈良好的线性关系,检测限为5.0×10-19M（50μL的反应体系里含有15个目标DNA分子）。此外,该方法能够显着区分其他三种碱基所引起的单碱基错配,可用于单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）的分析。在实际样品应用中,该方法可直接从血清总核酸提取物（DNA/RNA）里的大量基因组和长短不一的RNA中检测出不同含量的C型乙型肝炎病毒（HBV）基因组,而对于B型样品和正常样品则没有响应,显示出很好的检测效果,且与基因测序和凝胶电泳结果相符。更为重要的是,通过改变引物序列可以检测不同的目标DNA序列,因此本方法具有通用性,有望用于临床各种疾病相关DNA标志物的定性定量分析。（3）本文第三部分在第二部分的基础上提出亲和素标记的多聚辣根过氧化物酶（SA-PolyHRP）与LCR双重信号放大用于急性早幼粒细胞白血病（acute promyelocytic leukemia,APL）PML/RARα融合基因检测的电化学生物传感器,即将均匀分布在电极表面的经LCR扩增的每条短双链DNA末端结合多个HRP从而实现后放大（post-amplification）。选择酶联免疫分析中以不同方式引入多个HRP的链霉亲和素-酶标生物素复合物和链霉亲和素包被的HRP聚合物这两种酶复合物进行实验,结果表明链霉亲和素包被的HRP聚合物由于其外部的链霉亲和素层更易与电极表面的生物素结合而产生有效信号放大。针对固定局限在融合位点附近PML/RARα融合基因所设计的探针,本实验在引入SA-PolyHRP之后保证了灵敏度,可检测低至15个拷贝的目标DNA分子,在1.0×10-16 M到1.0×10-13 M浓度范围内,安培电流与浓度的对数值呈线性关系,与传统的SA-HRP相比,其在灵敏度上提高近2个数量级。此外,在引入SA-PolyHRP之后,本方法同样具有较高的特异性,能够显着区分其他三种碱基所引起的单碱基错配,而且本实验所设计的PML/RARα融合基因探针区分单碱基错配的能力更加显着。
孙云霞[8]（2017）在《194例CML患者染色体核型及ABL激酶区突变检测的临床意义分析》文中认为目的:通过收集我院血液科20102016年确诊的194例CML患者的临床资料,分析CML患者的临床特征、染色体核型、ABL激酶区突变,探讨CML染色体异常的特征、ABL激酶区突变的检测及临床意义。方法:我们回顾性分析我院血液科20102016年确诊的194例CML患者,收集患者临床及实验室资料,包括性别、年龄、外周血细胞计数、脾脏大小、骨髓细胞形态学检查、荧光原位杂交技术检测BCR-ABL融合基因、G显带技术进行染色体核型分析、RQ-PCR方法检测BCR-ABL基因水平及对所需患者治疗后行ABL激酶区突变检测;根据以上检查结果对疾病进行分期及危险度分层。根据2009年Baccarani IM耐药标准,其中37例为伊马替尼耐药患者,并收集此类患者IM治疗前病史及干扰素使用情况。结果:194例CML患者中182例（93.81%）为Ph+,Ph+患者中167例（91.76%）有典型t（9;22）（q34;q11）,12例（6.19%）为Ph-（FISH和/或PCR检测存在BCR-ABL融合基因）。本研究参照2009年Baccarani IM耐药标准,194例CML患者中,有37例为IM耐药患者,其中慢性期18例,占耐药患者的48.6%,加速期/急变期19例,占51.35%。37例耐药患者IM治疗前中位病程3.5年,持续完全分子生物学缓解患者中有8例在接受IM治疗前使用干扰素和/或羟基脲治疗,其中位病程0.65年,有统计学差异（p=0.016）。耐药患者接受干扰素治疗中位时间为2.95±2.2年,持续完全分子生物学缓解患者中有5例在使用IM治疗前使用干扰素治疗,其中位时间为1.5±1.97年,无统计学差异（p=0.176）。在本研究194例CML患者中有48例接受了ABL激酶区突变检测。37例耐药患者中,有6例检出ABL激酶区突变,突变率为16.22%;18例慢性期患者中2例存在突变,比例为（11%）,19例加速期/急变期患者中4例存在突变（21.1%）,无明显统计学差异（p=0.672）。其中P-loop区域突变2例,其他区域:F317L、L298V、E459K、M351T各1例。结论:加速期和急变期CML患者更容易出现变异易位和/或附加染色体异常;接受IM治疗前病程越长,患者发生耐药的可能性越大;使用二代TKIs治疗患者也可发生ABL激酶区突变。
肖剑文[9]（2017）在《31种融合基因在儿童急性白血病中的表达及临床意义》文中进行了进一步梳理第一部分31种融合基因在儿童急性淋巴细胞白血病中的表达目的分析儿童急性淋巴细胞性白血病（acute lymphoblastic leukemia,ALL）的分子遗传学改变与临床特征的关系。方法收集并分析255例初诊ALL患儿临床及实验室资料,所有患儿均做骨髓细胞学、免疫分型、染色体核型分析并利用多重巢式PCR检测31种白血病基因,检测为阳性者应用split-out PCR验证。结果255例ALL中男性153例,女性102例,平均年龄63.07±2.67月。共104例检出白血病基因（阳性率40.78%）,包括ETV6/RUNX1基因42例,E2A/PBX1基因17例,BCR/ABL基因15例,MLL基因16例,SIL/TAL1基因5例,HOX11基因5例,EVI1基因3例及SET/CAN基因1例。T-ALL基因检出率低于B-ALL;ETV6/RUNX1、BCR/ABL基因C-B-ALL多见,E2A/PBX1和MLL基因分别多见于pre-B-ALL和pro-B-ALL;ETV6/RUNX1基因多见于1-10岁组,MLL基因多发于<1岁组,BCR/ABL基因多见于>10岁组（P<0.05）。结论采用多重巢式RT-PCR结合split-out PCR方法可方便快速检测31种儿童常见的白血病基因,有助于儿童ALL精确分型、指导危险度分层和治疗。T-ALL基因检出率较低,提示T-ALL可能需要其它方法进行分子遗传学分型。不同年龄组B-ALL分子遗传学改变存在差异,可能是不同年龄儿童B-ALL化疗效果存在差异的原因之一。第二部分31种融合基因在儿童急性髓细胞白血病中的表达目的分析儿童急性髓细胞性白血病（acute myeloid leukemia,AML）的分子遗传学改变与临床特征的关系。方法收集并分析133例初诊AML患儿临床及实验室资料,所有患儿均做骨髓细胞学、免疫分型、染色体核型分析并利用多重巢式PCR检测31种白血病基因,初筛试验为阳性者应用split-out PCR验证。结果133例AML患儿中包括急性早幼粒细胞白血病（acute promyelocytic leukemia,APL）28例,非APL的AML患儿105例（男性62例,女性43例,平均年龄73.03±4.54月）。共98例检出白血病基因（阳性率73.68%）,包括:AML/ETO基因31例,PML/Ra Rα基因28例,MLL重排基因12例,CBFβ-MYH11基因10例,HOX11基因及TLS/ERG基因1例。EVI1基因22例（其中7例合并MLL重排基因）。APL患儿中检出罕见型PML/Ra Rα基因2例。非APL患儿中AML/ETO及EVI1基因阳性率最高,但各年龄组分子遗传学分布无显着性差异（p>0.05）。染色体检查6例未见分裂象,可供分析99例患儿中73例为异常核型（阳性率73.74%）。AML患儿染色体异常核型及基因检出率均高于ALL（p<0.05）。结论多重巢式RT-PCR结合split-RT-PCR方法可方便快速检测儿童AML常见融合基因,有助于完善AML精细分型。多重巢式RT-PCR联合基因测序有助于检测AML融合基因罕见突变位点,提高AML融合基因检出率。比较ALL而言,联合细胞遗传学及检测AML常见基因在指导儿童AML危险度分层和临床治疗中具有更大意义。第三部分ETV6/RUNX1、E2A/PBX1或MLL基因在儿童急性B淋巴细胞白血病微小残留病监测中的价值目的分别利用流式细胞术（flowcytometry,FCM）及PCR技术监测儿童急性B淋巴细胞性白血病（B cell acute lymphoblastic leukemia,B-ALL）治疗后微小残留病（Minimal residual disease,MRD）水平,分析两种检测方法的灵敏度及与预后的关系。方法61例初诊时B-ALL患儿分为A组（ETV6/RUNX1基因阳性）、B组（E2A/PBX1基因阳性）和C组（MLL基因阳性）并接受CCCG-ALL-2008方案化疗,治疗后不同时间点（time piont,TP）行骨髓穿刺,使用FCM及PCR技术检查评估TP2及TP3时MRD水平并分析与预后的关系。结果TP2及TP3时FCM-MRD和PCR-MRD检测阳性率无显着差异（P>0.05）。B组PCR-MRD检测阳性率高于FCM-MRD。随访至2017.02,61例患儿平均生存时间43.928±2.226月,3年EFS为80.0±5.4%。A组、B组和C组平均生存时间分别为50.325±1.129月、24.867±3.608月及31.852±7.201月,3年EFS分别为93.1±4.7%、60.0±12.6%和62.9±17.9%,A组疗效好于B组和C组（P<0.05）。结论按照分子遗传学进行危险度分组并分层治疗可以有效提高儿童ALL的疗效。使用FCM或PCR技术均可以有效检测儿童B-ALL的MRD水平并指导其分层治疗。虽然FCM或PCR技术检测MRD效果相似,但B组和C组患儿可能更适合选择PCR技术检测MRD。
杨冰玉[10]（2017）在《基于GC-MS联用技术的慢性粒细胞白血病代谢组学研究》文中认为目的应用基于GC-MS（气相色谱质谱联用）技术的代谢组学方法,研究慢性粒细胞白血病患者血浆中内源性代谢物的变化,寻找与疾病相关的潜在标志物,并初步探讨其涉及的相关代谢通路。在此基础上比较了酪氨酸激酶抑制剂治疗后慢性粒细胞白血病患者血浆中代谢物的变化,发现与诊断及疗效评价相关的潜在标志物。方法选取2015年2月至2015年4月在苏州大学附属第一医院初次确诊的26例慢性粒细胞白血病（CML）患者,及同期体检中心健康志愿者26例作为健康对照,另选取52例经过酪氨酸激酶抑制剂（TKI）治疗的CML患者进行进一步研究,其中26例为治疗成功组,26例为治疗失败组。初诊CML患者,治疗成功组及失败组患者的年龄、性别、身体质量指数（BMI）均与将康对照组相匹配,并排除合并其他疾病、近期服用其他药物的病例。应用气相色谱质谱联用技术（GC-MS）方法对四组血浆样本进行代谢物无靶标检测,采集代谢物指纹图谱,结合数据处理方法,筛选潜在CML诊断标志物和治疗标志物。结果（1）与健康对照组比较,CML患者血浆中共12种代谢物水平出现显着变化,代谢物丙酸、肉豆蔻酸、甘油、山梨醇的丰度均降低,肌醇、半乳糖、葡萄糖、乳酸、甘氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、吲哚丙酸的丰度均增加（均VIP>1且P<0.05）。上述CML患者血浆潜在诊断标志物涉及的代谢紊乱主要与半乳糖代谢、丙酮酸代谢、甘油酯代谢、肌醇磷酸化代谢及甘氨酸丝氨酸苏氨酸代谢通路相关（影响值>0.10）。（2）CML患者经过TKI治疗前、后共8种代谢物具有相同的变化趋势,这8种代谢物分别为乳酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、吲哚丙酸、山梨醇、半乳糖和肌醇,其中乳酸、异亮氨酸、山梨醇、肌醇的改变具有统计学意义（VIP值>1且P<0.05）。（3）TKI治疗成功组和失败者组比较,2个代谢物在这两组样本中经过治疗后有相反的变化趋势,分别为丙酸、甘油,但差异无明显统计学意义（P>0.05）;2个代谢物只有在治疗成功组经过治疗后有明显的变化（P<0.05）,包括肉豆蔻酸及葡萄糖,而在治疗失败组,肉豆蔻酸有与成功组相反的变化趋势,葡萄糖的变化趋势与成功组相同,但这2种代谢物的变化趋势均无明显统计学差异（P>0.05）。结论（1）与健康人比较,CML患者血浆代谢表型发生明显变化,可能与CML疾病发生密切相关,具有成为CML辅助诊断新标志物的潜能。（2）TKI治疗后,CML患者血浆代谢表型发生明显改变,乳酸、异亮氨酸、山梨醇、肌醇的改变可能与TKI治疗相关,肉豆蔻酸及葡萄糖改变可能与疗效相关。（3）基于GC-MS的代谢组学技术可成为进一步研究CML诊断和治疗效果评价的重要补充手段。
二、一种灵敏检测慢性粒细胞性白血病融合基因的方法:RT-nested-PCR（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、一种灵敏检测慢性粒细胞性白血病融合基因的方法:RT-nested-PCR（论文提纲范文）
（1）基于基因融合介导滚环扩增的BCR/ABLp210超灵敏分型新方法（论文提纲范文）
| 英文缩略写对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 1 实验部分 |
| 2 结果与讨论 |
| 3 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述:恒温滚环扩增技术在分子诊断中的应用 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间撰写的文章目录 |
（2）MLL基因重排阳性儿童急性淋巴细胞白血病预后相关因素分析与研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 MLL基因重排儿童急性淋巴细胞白血病接受CCLG-ALL2008方案治疗疗效和预后因素分析 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 应用RNA-seq初步研究MLL重排儿童急性淋巴细胞白血病差异表达基因与预后的相关性 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 MLL基因重排儿童急性白血病研究进展 |
| 参考文献 |
| 中英文对照缩略词表 |
| 攻读博士学位期间科研成果 |
| 致谢 |
（3）基于核酸酶和杂交链式反应检测白血病融合基因的超灵敏电化学新方法（论文提纲范文）
| 英汉缩略词名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一章 绪论 |
| 1 电化学纳米生物传感器 |
| 2 DNA纳米自组装 |
| 3 功能核酸 |
| 4 本课题的提出 |
| 5 参考文献 |
| 第二章 基于核酸酶和杂交链反应检测白血病融合基因的超敏电化学新方法 |
| 1 引言 |
| 2 实验部分 |
| 3 结果与讨论 |
| 4 小结 |
| 5 参考文献 |
| 文献综述 |
| 1 前言 |
| 2 核酸酶纳米材料的分子机制 |
| 3 适配体纳米材料的分子机制 |
| 4 拆分核酶纳米材料的分子机制 |
| 5 小结与展望 |
| 6 参考文献 |
| 致谢 |
（4）复杂核型急性白血病患者的临床特征及预后分析（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1.前言 |
| 1.1 急性白血病(AL)概述 |
| 1.2 AL染色体异常概述 |
| 2.研究对象和方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 研究方法 |
| 3.结果 |
| 3.1 临床特征 |
| 3.2 细胞免疫分型 |
| 3.3 核型分析 |
| 3.4 临床疗效 |
| 3.5 复杂核型AML患者临床疗效 |
| 3.6 生存及预后分析 |
| 4.讨论 |
| 4.1 复杂核型AL患者的临床特点 |
| 4.2 复杂核型AL患者分型特点 |
| 4.3 复杂核型AL患者的染色体核型特点 |
| 4.4 复杂核型AL患者既往恶性血液病病史或病态造血与预后 |
| 4.5 复杂核型AL患者的核型复杂程度与预后 |
| 4.6 复杂核型AML患者的疗效 |
| 4.7 复杂核型AL患者的治疗和预后 |
| 5.结论 |
| 6.参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 |
| 参考文献 |
（5）Armored RNA技术在登革热病毒及白血病BCR-ABL1p210/p190融合基因检测中的应用研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 基于Armored RNA技术的登革热病毒核酸检测质控品的研制及室间质量评价 |
| 前言 |
| 1. 材料和方法 |
| 1.1. 实验材料和试剂配制 |
| 1.1.1. 实验仪器 |
| 1.1.2. 主要实验耗材 |
| 1.1.3. 主要实验试剂 |
| 1.1.4. 培养基和溶液的配制 |
| 1.1.5. 菌株和质粒 |
| 1.2. 方法 |
| 1.2.1. 合成DENV-1～4基因片段 |
| 1.2.2. 构建pACYC-MS2-DENV-1～4重组质粒 |
| 1.2.3. 重组病毒样颗粒的表达和纯化 |
| 1.2.4. 重组病毒样颗粒的鉴定 |
| 1.2.5. 重组病毒样颗粒的性能验证 |
| 1.2.6. 制备DENV-1～4质评样本及开展全国室间质量评价 |
| 1.2.7. 统计学分析 |
| 2. 结果 |
| 2.1. pACYC-MS2-DENV-1～4重组质粒的验证 |
| 2.1.1. PCR验证 |
| 2.1.2. 测序验证 |
| 2.2. 重组病毒样颗粒的表达和纯化 |
| 2.3. 重组病毒样颗粒的鉴定 |
| 2.3.1. 琼脂糖凝胶电泳鉴定 |
| 2.3.2. SDS-PAGE鉴定 |
| 2.3.3. 电镜观察DENV-1～4 VLPs |
| 2.3.4. 商品化试剂盒验证VLPs包装片段 |
| 2.4. DENV-1～4 VLPs性能验证 |
| 2.4.1. 稳定性试验 |
| 2.4.2. 基质效应试验 |
| 2.4.3. 反复冻融试验 |
| 2.5. DENV-1～4 VLPs检测的室间质量评价 |
| 2.5.1. 参评实验室项目参数统计及评分 |
| 2.5.2. DENV-1～4检测的准确度、敏感度和特异度分析 |
| 2.5.3. 不同试剂盒DENV-1～4检测结果分析 |
| 2.5.4. 质评小结和证书发放 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 基于Armored RNA技术的白血病BCR-ABL1~(p210/p190)融合基因检测质控品的研制及室间质量评价 |
| 前言 |
| 1. 材料和方法 |
| 1.1. 实验材料和试剂配制 |
| 1.1.1. 实验仪器 |
| 1.1.2. 主要实验耗材 |
| 1.1.3. 主要实验试剂 |
| 1.1.4. 培养基和溶液的配制 |
| 1.1.5. 菌株和质粒 |
| 1.2. 方法 |
| 1.2.1. pACYC-MS2质粒、p210 BCR-ABL1以及p190 BCR-ABL1阳性患者总mRNA |
| 1.2.2. 构建pACYC-MS2-p210、pACYC-MS2-p190以及pACYC-MS2-CG重组质粒 |
| 1.2.3. 重组病毒样颗粒的表达和纯化 |
| 1.2.4. 重组病毒样颗粒的鉴定 |
| 1.2.5. 重组病毒样颗粒的性能验证 |
| 1.2.6. 制备p210、p190质评样本及开展全国室间质量评价 |
| 1.2.7. 统计学分析 |
| 2. 结果 |
| 2.1. pACYC-MS2-p210、pACYC-MS2-p190、pACYC-MS2-CG重组质粒的验证 |
| 2.1.1. PCR验证 |
| 2.1.2. 测序验证 |
| 2.2. 重组病毒样颗粒的表达和纯化 |
| 2.3. 重组病毒样颗粒的鉴定 |
| 2.3.1. 琼脂糖凝胶电泳鉴定 |
| 2.3.2. SDS-PAGE鉴定 |
| 2.3.3. RT-qPCR验证VLPs包装片段 |
| 2.4. p210、p190和CG VLPs性能验证 |
| 2.4.1. 稳定性实验 |
| 2.4.2. 均一性实验 |
| 2.4.3. 反复冻融实验 |
| 2.5. BCR-ABL1~(p210/p190)融合基因检测的室间质量评价 |
| 2.5.1. 结果回报情况 |
| 2.5.2. 参评实验室项目参数统计 |
| 2.5.3. p210和p190 BCR-ABL1检测结果 |
| 2.5.4. 质评样本及盲邮样本BCR-ABL1检测结果分布 |
| 2.5.5. 重复样本和阴性样本检测结果分析 |
| 2.5.6. 不同项目检测方法BCR-ABL1定量检测结果分析 |
| 2.5.7. IS实验室p210 BCR-ABL1检测结果分析 |
| 2.5.8. CF随访结果分析 |
| 2.5.9. 参评实验室EQA评分 |
| 2.5.10. 质评小结和证书发放 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 基于Armored RNA技术的白血病BCR-ABL1~(p210/p190)融合基因检测标准品的究制及评估 |
| 前言 |
| 1. 材料和方法 |
| 1.1. 实验材料和试剂配制 |
| 1.1.1. 实验仪器 |
| 1.1.2. 主要实验耗材 |
| 1.1.3. 主要实验试剂 |
| 1.1.4. 培养基和溶液的配制 |
| 1.1.5. 菌株和质粒 |
| 1.2. 方法 |
| 1.2.1. 构建pACYC-MS2-p210FG-CG、pACYC-MS2-p190FG-CG重组质粒 |
| 1.2.2. 重组病毒样颗粒的表达和纯化 |
| 1.2.3. 重组病毒样颗粒的鉴定 |
| 1.2.4. p210FG-CG、p190FG-CG VLPs的分装与冻干 |
| 1.2.5. p210FG-CG、p190FG-CG标准品的制备及定值 |
| 1.2.6. p210FG-CG、p190FG-CG标准品的线性分析 |
| 1.2.7. p210FG-CG、p190FG-CG标准品的性能验证 |
| 1.2.8. p210FG-CG、p190FG-CG标准品的区域性试验 |
| 1.2.9. 统计学分析 |
| 2. 结果 |
| 2.1. pACYC-MS2-p210FG-CG、pACYC-MS2-p190FG-CG重组质粒的验证 |
| 2.1.1. PCR验证 |
| 2.1.2. 测序验证 |
| 2.2. 重组病毒样颗粒的表达和纯化 |
| 2.3. 重组病毒样颗粒的鉴定 |
| 2.3.1. 琼脂糖凝胶电泳鉴定 |
| 2.3.2. SDS-PAGE鉴定 |
| 2.3.3. RT-qPCR验证VLPs包装片段 |
| 2.4. p210FG-CG和p190FG-CG标准品性能验证 |
| 2.4.1. 稳定性实验 |
| 2.4.2. 均一性实验 |
| 2.5. p210FG-CG、p190FG-CG标准品定值 |
| 2.5.1. p210FG-CG标准品dPCR检测结果 |
| 2.5.2. p190FG-CG标准品dPCR检测结果 |
| 2.6. p210FG-CG、p190FG-CG标准品的线性分析结果 |
| 2.7. p210FG-CG、p190FG-CG标准品的区域性验证结果 |
| 2.7.1. 结果回报情况 |
| 2.7.2. p210和p190模拟样本转化前后结果分析 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 基于Armored RNA技术的白血病BCR-ABL1~(p210/p190)融合基因检测二级参考物质的制备及标准化研究 |
| 前言 |
| 1. 材料和方法 |
| 1.1. 实验材料和试剂配制 |
| 1.1.1. 实验仪器 |
| 1.1.2. 主要实验耗材 |
| 1.1.3. 主要实验试剂 |
| 1.1.4. 培养基和溶液的配制 |
| 1.1.5. 菌株和质粒 |
| 1.2. 方法 |
| 1.2.1. 构建pACYC-MS2-p210-p190FG、pACYC-MS2-23S重组质粒 |
| 1.2.2. 重组病毒样颗粒的表达和纯化 |
| 1.2.3. 重组病毒样颗粒的鉴定 |
| 1.2.4. 二级参考物质的制备 |
| 1.2.5. 二级参考物质的定值 |
| 1.2.6. 二级参考物质的性能验证 |
| 1.2.7. 二级参考物质的区域性试验 |
| 1.2.8. 统计学分析 |
| 2. 结果 |
| 2.1. pACYC-MS2-23S、pACYC-MS2-p210-p190FG重组质粒的验证 |
| 2.1.1. PCR验证 |
| 2.1.2. 测序验证 |
| 2.2. 重组病毒样颗粒的表达和纯化 |
| 2.3. 重组病毒样颗粒的鉴定 |
| 2.3.1. 琼脂糖凝胶电泳鉴定 |
| 2.3.2. SDS-PAGE鉴定 |
| 2.3.3. RT-qPCR鉴定 |
| 2.4. 二级参考物质定值 |
| 2.4.1. 商品化试剂盒定值 |
| 2.4.2. 自建方法定值 |
| 2.4.3. 商品化试剂盒和LDT对1~(st) WHO国际参考盘和二级参考物质检测结果比较 |
| 2.5. 二级参考物质的性能验证 |
| 2.5.1. 稳定性实验 |
| 2.5.2. 均一性实验 |
| 2.6. 二级参考物质的区域性验证 |
| 2.6.1. 结果回报情况 |
| 2.6.2. 区域性验证结果分析 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 论文综述 A novel delivery platform based on Bacteriophage MS2 virus-like particles |
| References |
| 附录 |
| 附录1: pACYCDuet-1载体详细信息 |
| 附录2: 关于开展全国登革热病毒核酸检测室间质量评价预研的通知及回执 |
| 附录3: 2016年全国登革热病毒核酸检测室间质量评价活动安排及回报表 |
| 附录4: 关于开展全国白血病BCR-ABL1~(p210/p190)融合基因检测室间质量评价及一致性研究预研的通知及回执 |
| 附录5: 2017年全国白血病BCR-ABL1~(p210/p190)融合基因检测室间质量评价及一致性研究活动安排及回报表 |
| 附录6: 关于开展全国白血病BCR-ABL1~(p210/p190)融合基因检测标准化预研的通知及回执 |
| 附录7: 2018年白血病BCR-ABL1~(p210/p190)融合基因检测标准化活动安排及回报表 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（6）探讨IL-7在骨髓间充质干细胞促进慢粒白血病细胞对TKIs耐药中的作用及其机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 慢性粒细胞白血病概述 |
| 1.2 慢性粒细胞白血病治疗进展 |
| 1.3 骨髓造血微环境 |
| 1.4 骨髓间充质干细胞 |
| 1.5 IL-7 的生物学性状 |
| 1.6 IL-7 与血液系统肿瘤 |
| 1.7 JAK/STAT信号通路 |
| 1.8 PI3K/AKT信号通路 |
| 1.9 本课题的研究思路 |
| 第2章 骨髓间充质干细胞在体外对慢粒白血病细胞增殖和凋亡的影响 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 临床标本收集 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要实验设备和仪器 |
| 2.1.4 骨髓间充质干细胞的培养 |
| 2.1.5 流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞的免疫表型标志 |
| 2.1.6 CCK-8 法检测骨髓间充质干细胞对白血病细胞增殖的影响 |
| 2.1.7 流式细胞仪检测不同骨髓间充质干细胞对白血病细胞细胞周期的的影响 |
| 2.1.8 AnnexinV/PI双染法检测不同骨髓间充质干细胞对白血病细胞细胞凋亡的影响 |
| 2.1.9 ELISA法检测骨髓和间充质干细胞培养液中IL-7 的含量 |
| 2.1.10 荧光定量PCR检测单个核细胞中IL-7mRNA的表达 |
| 2.1.11 数据的统计分析和图像处理 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 原代培养的骨髓间充质干细胞 |
| 2.2.2 骨髓和间充质干细胞培养液中IL-7 的含量 |
| 2.2.3 骨髓单个核细胞中IL-7mRNA的表达 |
| 2.2.4 不同骨髓间充质干细胞对白血病细胞增殖的影响 |
| 2.2.5 不同骨髓间充质干细胞对白血病细胞周期的影响 |
| 2.2.6 不同骨髓间充质干细胞对伊马替尼和尼罗替尼处理后白血病细胞增殖和凋亡的影响 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 结论 |
| 第3章 IL-7 在骨髓间充质干细胞促进慢粒白血病细胞对TKIs耐药中的作用机制 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 主要试剂 |
| 3.1.2 主要实验设备和仪器 |
| 3.1.3 主要试剂的配制 |
| 3.1.4 观察加入IL-7 抗体后耐药骨髓间充质干细胞对白血病细胞增殖和凋亡的影响 |
| 3.1.5 观察敲降IL-7 基因后耐药骨髓间充质干细胞对白血病细胞增殖和凋亡的影响 |
| 3.1.6 Western blot检测白血病细胞BCR/ABL信号通路相关蛋白的表达水平 |
| 3.1.7 Western blot检测白血病细胞PI3K/AKT信号通路相关蛋白的表达水平 |
| 3.1.8 Western blot检测白血病细胞JAK/STAT信号通路相关蛋白的表达水平 |
| 3.1.9 数据的统计分析和图像处理 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 加入IL-7 抗体后耐药骨髓间充质干细胞对白血病细胞增殖和凋亡的影响 |
| 3.2.2 敲降耐药骨髓间充质干细胞IL-7 基因后对白血病细胞增殖和凋亡的影响 |
| 3.2.3 Western blot检测白血病细胞BCR/ABL信号通路相关蛋白的表达水平 |
| 3.2.4 Western blot检测白血病细胞PI3K/AKT信号通路相关蛋白的表达水平 |
| 3.2.5 Western blot检测白血病细胞JAK/STAT信号通路相关蛋白的表达水平 |
| 3.2.6 Western blot检测白血病细胞内JAK/STAT 信号通路相关蛋白的表达水平 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 结论 |
| 第4章 骨髓间充质干细胞在裸鼠体内对白血病细胞耐药性的影响 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 细胞株 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 主要实验设备和仪器 |
| 4.1.5 裸鼠皮下移植瘤模型的建立 |
| 4.1.6 观察裸鼠一般情况 |
| 4.1.7 观察皮下移植瘤体积的变化并计算抑瘤率 |
| 4.1.8 免疫荧光检测Caspase3,Bcl-2和Bax在皮下移植瘤组织内的表达情况 |
| 4.1.9 免疫荧光检测JAK/STAT信号通路相关蛋白在皮下移植瘤组织内的表达情况 |
| 4.1.10 Western blot检测皮下移植瘤组织内JAK/STAT信号通路相关蛋白的表达水平 |
| 4.1.11 数据的统计分析和图像处理 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 裸鼠皮下移植瘤的生长曲线 |
| 4.2.2 伊马替尼对裸鼠皮下移植瘤的抑制作用 |
| 4.2.3 免疫荧光检测裸鼠皮下移植瘤组织内Casepase3、Bcl-2和Bax的表达情况 |
| 4.2.4 免疫荧光检测裸鼠皮下移植瘤组织内JAK/STAT信号通路相关蛋白的表达情况 |
| 4.2.5 Western blot检测移植瘤组织内JAK/STAT信号通路相关蛋白的表达水平 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 结论 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述一 |
| 参考文献 |
| 综述二 |
| 参考文献 |
（7）工具酶辅助信号放大的DNA电化学传感器（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 基于末端脱氧核苷酸转移酶的DNA电化学传感器 |
| 1.1 仪器与试剂 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 结果与讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第二部分 基于连接酶链式反应的DNA电化学传感器 |
| 2.1 仪器与试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 结果和讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三部分 基于Poly-HRP和连接酶链式反应双重信号放大的DNA电化学传感器 |
| 3.1 仪器与试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 结果和讨论 |
| 3.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（8）194例CML患者染色体核型及ABL激酶区突变检测的临床意义分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一章 194例CML患者的临床特征和染色体核型分析 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 结论 |
| 参考文献 |
| 第二章 伊马替尼耐药CML患者ABL激酶区突变检测及临床意义分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 参考文献 |
| 第三章 附文 |
| 3.1 罕见e13a3融合基因阳性CML患者尼洛替尼治疗后达完全细胞遗传学缓解：一例报告及文献复习 |
| 3.2 CML合并内脏全反位：一例报告及文献复习 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（9）31种融合基因在儿童急性白血病中的表达及临床意义（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 31种融合基因在儿童急性淋巴细胞白血病中的表达 |
| 前言 |
| 1 资料和方法 |
| 2 试验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 31种融合基因在儿童急性髓细胞白血病中的表达 |
| 前言 |
| 1 资料和方法 |
| 2 试验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 ETV6/RUNX1、E2A/PBX1或MLL基因在儿童急性B淋巴细胞白血病微量残留病监测中的价值 |
| 前言 |
| 1 资料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间撰写论文与研究成果 |
（10）基于GC-MS联用技术的慢性粒细胞白血病代谢组学研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 基于GC-MS联用技术的慢性粒细胞白血病代谢轮廓分析 |
| 1.引言 |
| 2.病例和方法 |
| 2.1 病例资料 |
| 2.2 样品的采集 |
| 2.2.1 CML患者的血浆采集 |
| 2.2.2 健康对照的血浆采集 |
| 2.3 主要实验仪器及试剂 |
| 2.3.1 实验仪器 |
| 2.3.2 实验试剂 |
| 2.4 GC-MS血浆样品制备方法 |
| 2.5 色谱及质谱分析条件 |
| 2.6 代谢物成分鉴定和解析 |
| 2.7 数据处理 |
| 3.结果 |
| 3.1 GC-MS数据采集中的质量控制 |
| 3.2 血浆代谢谱分析 |
| 3.3 模式识别(pattern recognition,PR)分析 |
| 3.4 潜在诊断标志物的发现 |
| 3.5 代谢通路分析 |
| 4.讨论 |
| 5.参考文献 |
| 第二部分 GC-MS联用技术的代谢组学在酪氨酸激酶抑制剂治疗慢性粒细胞白血病研究中的应用 |
| 1 引言 |
| 2.病例和方法 |
| 2.1 病例资料 |
| 2.2 经TKIs治疗的CML患者的血浆采集 |
| 2.3 主要实验仪器及试剂 |
| 2.4 GC-MS血浆样品制备方法 |
| 2.5 色谱及质谱分析条件 |
| 2.6 代谢物成分鉴定和解析 |
| 2.7 数据处理 |
| 3.结果 |
| 3.1 GC-MS数据采集中的质量控制 |
| 3.2 血浆代谢谱分析 |
| 3.3 整体代谢轮廓分析 |
| 3.4 模式识别分析 |
| 3.4.1 CML患者TKI治疗前、后对比 |
| 3.4.2 结合TKI疗效治疗前、后对比 |
| 3.5 潜在治疗标志物的发现 |
| 4.讨论 |
| 5.参考文献 |
| 结论 |
| 综述 代谢组学及其在疾病中的应用 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词汇表 |
| 攻读学位期间公开发表的文章 |
| 致谢 |
四、一种灵敏检测慢性粒细胞性白血病融合基因的方法:RT-nested-PCR（论文参考文献）
- [1]基于基因融合介导滚环扩增的BCR/ABLp210超灵敏分型新方法[D]. 罗妮妮. 重庆医科大学, 2020(12)
- [2]MLL基因重排阳性儿童急性淋巴细胞白血病预后相关因素分析与研究[D]. 孙伊娜. 苏州大学, 2019(06)
- [3]基于核酸酶和杂交链式反应检测白血病融合基因的超灵敏电化学新方法[D]. 段郁. 重庆医科大学, 2019(01)
- [4]复杂核型急性白血病患者的临床特征及预后分析[D]. 宋红云. 安徽医科大学, 2019(08)
- [5]Armored RNA技术在登革热病毒及白血病BCR-ABL1p210/p190融合基因检测中的应用研究[D]. 付煜. 北京协和医学院, 2018(02)
- [6]探讨IL-7在骨髓间充质干细胞促进慢粒白血病细胞对TKIs耐药中的作用及其机制[D]. 张小燕. 南昌大学, 2017(05)
- [7]工具酶辅助信号放大的DNA电化学传感器[D]. 陈锦元. 福建医科大学, 2017(04)
- [8]194例CML患者染色体核型及ABL激酶区突变检测的临床意义分析[D]. 孙云霞. 兰州大学, 2017(02)
- [9]31种融合基因在儿童急性白血病中的表达及临床意义[D]. 肖剑文. 重庆医科大学, 2017(11)
- [10]基于GC-MS联用技术的慢性粒细胞白血病代谢组学研究[D]. 杨冰玉. 苏州大学, 2017(05)
标签：白血病论文; 急性淋巴细胞白血病论文; 融合基因论文; 慢性粒细胞白血病论文; 急性髓性白血病论文;