导读:本文包含了多表位串联体论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:副溶血性弧菌,多表位串联肽,免疫特性
多表位串联体论文文献综述
张玉晴,汪天杰,许晓升,张峥嵘,许如苏[1]（2018）在《副溶血性弧菌外膜蛋白K的多表位串联表达研究》一文中研究指出[目的]设计和表达Omp K蛋白的多表位串联肽,综合评价其免疫效应。[方法]构建重组表达质粒p ET-32a-repis并进行原核表达,使用Ni-NTA纯化介质对表达产物进行纯化得到重组多表位串联肽(r EPIS),以r EPIS为免疫原免疫昆明小鼠,对r EPIS进行免疫原性和免疫保护性研究,Western-blot分析r EPIS的免疫反应性。[结果]r EPIS具有良好的免疫原性,能够刺激机体产生较高水平抗体,并且能够保护90%的昆明小鼠抵抗10LD50副溶血性弧菌的感染,具有良好的免疫保护效应,Western-blot结果显示重组r EPIS能够与免疫后鼠血清进行特异性结合,具有良好的免疫反应性。[结论]该研究制备的重组r EPIS具有良好的免疫特性,为副溶血弧菌多表位疫苗的研究奠定了物质基础。(本文来源于《安徽农业科学》期刊2018年23期）
张尔夫[2]（2018）在《肺孢子菌p55多表位串联基因腺病毒载体疫苗构建及其免疫原性检验》一文中研究指出目的:肺孢子菌肺炎(Pneunocystis pneumonia,PCP),是由机会性致病真菌——肺孢子菌(Pneumocystis,Pc)所引起的一种感染性疾病,最常发生于肺部,严重可致死。PCP最开始引起人们的关注是由于研究揭示了它与人类免疫缺陷病毒(HIV)感染密切相关,特别在1981年将PCP定义为获得性免疫缺陷综合症(AIDS)的标志性疾病;近年来的流行病学资料显示,随着器官移植、恶性肿瘤、长期应用激素等非HIV感染的免疫功能抑制患者增多,在这类患者中并发PCP的临床病例不断上升,PCP再次引起了国内外研究者的极大关注。目前PCP临床治疗主要以复方磺胺甲基异恶唑为主,虽然能够取得一定的疗效,但因其毒副作用较大,造成部分患者不能耐受,加之出现的耐药性等问题,药物防治PCP面临严峻挑战。于是,国内外研究者纷纷将注意力转移到针对PCP的新防治策略及相关疫苗的开发上。先前有研究发现,作为Pc抗原成分之一的P55蛋白,在抗PCP中具有重要作用。机体主动免疫天然P55蛋白后,产生的免疫反应可以使机体在感染的初期得到一定程度的保护,故有研究者认为P55蛋白最有希望成为抗PCP的候选疫苗之一。然而,由于P55蛋白存在5种变异体,再加上到目前为止Pc在体外很难培养出足够的数量用于抗原制备,以致抗原的来源受阻,造成P55蛋白疫苗的开发一直没有取得有效进展。基于上述原因,本课题组利用生物信息学和分子生物学技术,人工设计构建了包括5种变异体有效抗原表位在内的p55多表位串联基因(p55TAG),并在前期研究中用原核表达载体及真核表达载体验证出p55TAG能有效表达出目的抗原蛋白,且该基因的分子疫苗在免疫抑制的大鼠PCP模型中具有一定的免疫保护潜力。但因Pc作为一种机会性感染真菌,主要侵犯免疫功能低下患者,对于这类人群采用常规单一的分子疫苗往往难以达到预期的免疫效果,于是课题组提出采用异质性“初次-加强免疫策略”(prime-booststrategy),即用两种异质的分子疫苗进行免疫,以提高疫苗抗PCP的效果。根据上述构想,本研究计划首先利用腺病毒载体搭载p55TAG构建一个重组腺病毒载体疫苗;其次验证其在真核细胞HEK293中的蛋白表达情况;最后用包装好的重组腺病毒载体疫苗免疫小鼠,检测小鼠体内相关免疫指标,以分析构建疫苗的免疫原性。期望能为抗PCP感染的异质性“初次-加强免疫策略”提供一种具有“加强免疫”作用的制剂,为最终建立有效的抗PCP疫苗奠定前期实验基础。研究方法:第一部分:肺孢子菌p55TAG重组腺病毒载体疫苗构建及真核细胞内表达验证1.p55TAG的获取与扩增用BglⅡ和XhoⅠ双酶切pMD18-T克隆载体上p55TAG目的基因,产物测序鉴定;PCR扩增鉴定正确的目的基因,产物胶回收。2.p55TAG重组腺病毒载体构建经EcoRI酶切的腺病毒连接质粒pHBAd-EF1-MCS-GFP与p55TAG目的基因进行连接后转化到DH5α大肠杆菌感受态中,PCR扩增Amp+LB培养基上的单克隆菌落,产物测序鉴定。3.p55TAG重组腺病毒载体的病毒包装将重组腺病毒载体与腺病毒骨架质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre共转染进HEK293细胞后观察GFP表达及CPE改变,包装后的重组腺病毒命名为pHBAd-p55TAG。4.p55TAG重组腺病毒的鉴定及真核细胞中目的蛋白表达提取pHBAd-p55TAG核酸,PCR扩增后产物测序鉴定;对重组腺病毒在HEK293细胞内所表达的蛋白进行SDS-PAGE与Western blot鉴定。第二部分:肺孢子菌p55TAG重组腺病毒载体疫苗免疫原性检验5.重组腺病毒的扩增、纯化、滴度测定用pHBAd-p55TAG反复感染HEK293细胞叁次,收集最后一次的病毒液,CsCl梯度离心法纯化病毒,TCID50法测定纯化后的病毒滴度。6.重组腺病毒载体疫苗免疫动物将6～8周龄、雌性BALB/c小鼠,按随机分组原则分为pHBAd-GFP、pHBAd-p55TAG、PBS叁组,每组10只;腹腔单针免疫,注射量为50μl/只。7.重组腺病毒载体疫苗免疫原性检验于免疫后的第3d、1w、2w、3w末采集小鼠血清,MSD法检测IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-17四种细胞因子的水平;ELISA法检测3w末小鼠血清中IgG总抗体、IgG1和IgG2a抗体亚类的水平;流式细胞术对3w末小鼠脾细胞进行CD4+T和CD8+T淋巴细胞亚群分析,同时用qPCR法检测脾细胞中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-17四种细胞因子相对表达量变化。8.统计学分析采用SPSS19.0软件进行统计分析,计量资料数据以均数±标准差(X±SD)表示,多组间比较采用单因素方差分析(one-wayANOVA),两组间比较采用LSD-t检验,P<0.05表示有统计学差异。结果:第一部分:肺孢子菌p55TAG重组腺病毒载体疫苗构建及真核细胞内表达验证1.p55TAG的获取与扩增结果从本室保存的载体上经酶切、PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳检测,结果在1200bp左右处出现特异条带(p55TAG基因片段全长1164bp),测序结果与原始p55TAG目的基因序列一致。2.p55TAG重组腺病毒载体构建结果转化后,从Amp+LB平板挑选8个单克隆菌落,经PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳鉴定,有6个转化子在1500bp处出现特异性条带,选取阳性PCR产物进行测序,测序结果与原始p55TAG目的基因序列一致,证明重组腺病毒载体成功构建。3.p55TAG重组腺病毒载体的病毒包装结果重组腺病毒载体与腺病毒骨架质粒共转染HEK293细胞,48h后观察到GFP明显表达,证明转染成功;8d后细胞出现典型CPE现象,证明重组腺病毒包装成功。4.p55TAG重组腺病毒的鉴定结果PCR扩增pHBAd-p55TAG,产物电泳后在1500bp出现特异性条带,测序结果与原始p55TAG目的基因序列比对结果一致,证明包装出的腺病毒中携带有p55TAG目的基因。5.p55TAG重组腺病毒在HEK293细胞中蛋白表达结果Western blot显示:与空载病毒相比,重组腺病毒在60kDa处有一明显条带,与预期结果相符,证明pHBAd-p55TAG在HEK293细胞中成功表达出目的蛋白。第二部分:肺孢子菌p55TAG重组腺病毒载体疫苗免疫原性检验6.重组腺病毒的扩增、纯化后滴度测定结果pHBAd-p55TAG扩增叁代,纯化后的病毒采用TCID50法测定的病毒滴度为1.99×1010PFU/ml,可用于下一步动物免疫实验。7.鼠脾CD4+T和CD8+T淋巴细胞亚群流式分析结果流式细胞术分析3w末小鼠脾T淋巴细胞,统计学分析结果显示;pHBAd-p55TAG组的CD4+T淋巴细胞升高水平相较于pHBAd-GFP和PBS组具有统计学意义(P<0.05;P<0.01);而在各组CD8+T淋巴细胞水平比较中,pHBAd-p55TAG组CD8+T淋巴细胞升高水平相较于PBS组具有统计学意义(P<0.05)。8.鼠血清中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-17四种细胞因子变化水平分析结果MSD法检测鼠血清中四种细胞因子的浓度随时间变化水平,统计学分析结果显示:pHBAd-p55TAG组细胞因子IFN-γ和IL-17浓度升高水平相比其他两组具有统计学差异(P<0.01);而IL-2和IL-4的变化则不具有统计学意义(P>0.05)。9.鼠血清中总IgG抗体及IgG1和IgG2a抗体亚类变化水平分析结果ELISA法检测3w末鼠血清中IgG抗体和IgG2a亚类的变化水平,与其他两组相比,pHBAd-p55TAG组显着升高(P<0.01),而抗体IgG1亚类在叁组之间的变化水平无统计学意义(P>0.05);计算叁组IgG2a与IgG1比值,进行统计学分析结果显示pHBAd-p55TAG组与其他两组比较具有统计学差异(P<0.05)。10.鼠脾细胞中四种细胞因子Real-time PCR相对定量检测结果pHBAd-p55TAG组与pHBAd-GFP组相比PBS组四种细胞因子的表达量均有所升高,pHBAd-p55TAG组相较于PBS组,除IL-4外,其余叁种细胞因子的升高水平都具有不同程度的统计学差异,其中IL-17的升高具有极显着差异(P<0.001);在pHBAd-p55TAG组与pHBAd-GFP组的统计学比较中,只有IL-17的升高水平具有统计学意义(P<0.001)。结论:1.本研究成功构建出p55多表位串联基因腺病毒载体;2.包装后的p55多表位串联基因腺病毒载体疫苗,可在真核细胞HEK293中成功表达出目的蛋白;3.构建的p55多表位串联基因腺病毒载体疫苗免疫BALB/c小鼠后,能诱发小鼠体内细胞和体液免疫反应,验证其具有一定的免疫原性,为进一步抗肺孢子菌感染新策略、新疫苗研究奠定了实验基础。(本文来源于《中国医科大学》期刊2018-03-01）
张尔夫,薛婷,何丽,安春丽[3]（2018）在《表达肺孢子菌p55多表位串联基因腺病毒重组载体的构建》一文中研究指出目的构建携带肺孢子菌p55多表位串联基因(p55TAG)的腺病毒重组载体,鉴定其在真核细胞HEK293中的表达情况。方法将人工合成的p55TAG目的片段与腺病毒载体(p HBAd-EF1-MCS-GFP)连接后转化到DH5α大肠杆菌感受态中,经Amp抗性筛选得到重组载体p HBAd-p55TAG,将重组载体与腺病毒骨架质粒p BHGlox(delta)E1,3Cre共转染HEK293细胞,通过绿色荧光蛋白(GFP)验证转染结果,收集包装成功的病毒进行PCR扩增,扩增产物测序验证,用Western blot检测病毒在感染细胞后的目的蛋白表达情况。结果构建的p HBAd-p55TAG腺病毒重组载体转染HEK293细胞后检测到绿色荧光蛋白表达,包装好的病毒PCR扩增产物测序结果与原始序列一致,Western blot检测结果显示在60 k Da处有成功表达目的条带。结论本研究成功构建了表达肺孢子菌p55多表位串联基因的腺病毒重组载体,并验证其能在真核细胞中有效表达。构建的载体为进一步研究抗肺孢子菌感染疫苗奠定了基础。(本文来源于《中国卫生检验杂志》期刊2018年01期）
侯丽英[4]（2015）在《β-乳球蛋白抗原表位谱的解析及关键抗原表位串联体的重组表达与鉴定》一文中研究指出目的:血清特异性IgE是诊断食物过敏的重要手段,标准化已知抗原是研制体外特异性IgE诊断试剂的重要前提,制备食物致敏组分的抗原表位重组蛋白是解决抗原标准化的重要措施。本研究以牛奶中最重要的过敏原“β-乳球蛋白”为例,从分析其抗原表位入手,分析重要抗原表位与患者血清sIgE的反应频率,从而筛选出其关键抗原表位并构建关键抗原表位重组体,尝试采用抗原表位重组体替代天然蛋白的可能性。方法:(1)β-乳球蛋白关键抗原表位筛选及其血清异质性分析:首先在NCBI数据库查得牛奶β-乳球蛋白的氨基酸序列(162个氨基酸),用末端重迭的方法合成β-乳球蛋白的多肽,然后用斑点印迹的方法,以20例牛奶过敏患者血清中的特异性IgE作为一抗,观察多肽与牛奶过敏患者的反应频率有无差异及不同个体间所识别的多肽有无差异。(2)β-乳球蛋白关键抗原表位串联重组体的构建及其初步应用研究:将反应频率最高的3个多肽进行串联表达,相邻两个多肽之间用一个甘氨酸做接头,首先用DNAStar生物信息学软件对3个表位的6种组合方式进行预测,选出最佳组合方式;委托上海生工生物有限公司合成关键抗原表位串联体的DNA序列,并与pET-42a(+)质粒载体进行连接,将构建好的质粒转化到BL21(DE3)感受态细胞中,用IPTG诱导剂进行诱导表达,最后利用镍柱纯化出单一组分的关键抗原表位串联体重组蛋白,最后采用western-blot、斑点印迹方法和活性氧传递均相发光免疫测定技术鉴定重组蛋白的免疫学活性。结果:(1)患者血清中sIgE所识别抗原表位的异质性分析:在20例牛奶过敏患者血清的斑点印迹结果中有一部分血清所识别的多肽相同,如1号、5号、6号、11号牛奶过敏患者血清所识别的表位均为1号多肽,有一部分牛奶过敏患者血清所识别的表位均不完全相同。根据多肽反应频率的不同,筛选出β-乳球蛋白最主要表位的氨基酸序列为AA76-95、AA1-20、AA106-125,主要表位的氨基酸序列为AA91-110、AA61-81、AA121-140,次要表位的氨基酸序列为AA 46-65、AA 31-50、AA 151-162。(2)β-乳球蛋白关键抗原表位串联体重组蛋白的表达及鉴定:通过DNAStar软件对理论上6种组合方式进行了分析,得到最佳组合方式,成功构建了大肠杆菌原核表达载体,IPTG诱导表达后,获得大小为36kDa左右的融合蛋白,并纯化得到单一组分的36kDa大小的重组蛋白,并经免疫印迹法、斑点印迹法鉴定其免疫活性,并利用重组蛋白作为检测抗原建立了一种活性氧传递均相发光免疫测定技术来检测血清sIgE。结论:本研究对牛奶主要过敏原β-乳球蛋白的抗原表位进行了解析,不同牛奶过敏患者血清所识别的抗原表位具有异质性。成功表达了β-乳球蛋白关键抗原表位串联体重组蛋白,并鉴定了关键抗原串联体重组蛋白具有良好的免疫学活性,在检测牛奶过敏疾病中有可能代替天然抗原,为新一代诊断试剂的制备奠定基础。(本文来源于《天津医科大学》期刊2015-05-01）
董林,王艳萍,沈志强,柳增善[5]（2014）在《猪圆环病毒2型多表位串联体诱导表达及其免疫活性》一文中研究指出为了获得体外诱导表达的具有良好免疫原性的PCV2多表位串联体。本试验筛选PCV2主要抗原表位,顺序组成多表位串联体,人工合成其cDNA序列,通过BamHⅠ和SalⅠ定向克隆至原核表达载体pEGX-4T-1多克隆位点,转化BL21感受态细胞,筛选阳性克隆,进行IPTG诱导表达。使用SDS-PAGE对目的基因表达情况进行分析,提取与纯化融合蛋白多肽,Western blot鉴定表达多表位串联蛋白免疫活性。融合蛋白多肽免疫BALB/c小鼠,ELISA测定其抗体,评价其免疫原性。结果显示,成功构建了含7个PCV2抗原表位串联体的表达重组质粒pEGX-4T-1-ep,SDS-PAGE分析显示,融合蛋白多肽在大肠杆菌中获得了有效表达,其分子量约35ku,主要以可溶性形式存在。Western blot结果显示,提取与纯化融合蛋白多肽与PCV2阳性血清具有良好的反应原性。ELISA检测结果显示,纯化的融合蛋白多肽可有效刺激机体产生PCV2特异性抗体,具有良好的免疫原性。结果表明,构建的PCV2多表位串联体表达重组体具有良好的体外表达特性,表达蛋白具有良好的免疫原性。该研究为PCV2表位筛选,功能鉴定及多表位疫苗研究奠定了一定基础。(本文来源于《中国兽医学报》期刊2014年11期）
欧长灿[6]（2014）在《NDV F和IBDV VP2多表位串联苗诱导小鼠体液免疫的初步比较》一文中研究指出新城疫(ND)和传染性法氏囊病(IBD)是危害养禽业的两大疾病,其死亡率高,能够造成极大的经济损失。疫苗免疫是预防这两种疾病的有效手段。目前疫苗的使用使这两种病得到一定的控制。但是也存在着ND多次免疫仍出现非典型ND现象,IBD也出现强毒株的感染,屡屡导致免疫失败。当前,多表位疫苗是研究热点之一。与传统疫苗相比,其应用性和可操作性极大,表位的联合、修饰或改造在质粒水平上可以及时方便的操作。研究表明,恒定链(invariant chain, Ii)在抗原递呈过程中起重要作用。Ii中与CLIP区N端相连的四个氨基酸序列LRMK称为Ii-key,具有增强免疫应答的作用。Ii-key己被作为免疫载体与抗原表位相连；Ii的其他区域能促进这种免疫增强作用。文章旨在以鼠Ii功能片段作为免疫载体,构建含NDV、IBDV的4组不同串联方式的多表位疫苗,研究多表位苗能否诱导产生针对不同病毒的抗体,及表位串联顺序的不同对免疫原性是否有影响,以期获得最佳的免疫原性。首先,选择了NDV抗原表位F306及IBDV抗原表位VP2与鼠Ii的胞浆区、跨膜区、Ii-key构建串联嵌合体：Cyt/TM/Ii-key/F306、Cyt/TM/Ii-key/F306/VP2、 Cyt/TM/Ii-key/VP2、Cyt/TM/Ii-key/VP2/F306。以实验室原有的质粒pEGFP-Cl-Ii、 pET-32a-F306、pET-32a-VP2为模板,根据设计成功的引物,将扩增出来的目的片段插入原核表达载体pET-32a中。通过质粒双酶切鉴定及质粒测序结果比对,表明构建了正确的重组质粒：pET-32a-Cyt/TM/Ii-key/F306 pET-32a-Cyt/TM/Ii-key/F306/VP2、pET-32a-Cyt/TM/Ii-key/VP2、pET-32a-Cyt/TM/ Ii-key/VP2/F306,同时以构建的pGEX-4T-1-F306、pGEX-4T-1-VP2作为检测抗原。其次,将构建的重组质粒转化大肠杆菌Rosetta工程菌中,通过优化融合蛋白的表达条件,确定最佳诱导时间为4h,最佳诱导浓度为0.8mmol/L。用此最佳表达方法进行蛋白的大量表达。经改良KCl染色切胶法纯化回收目的蛋白,最后获得分子量约为41.35kDa、43.22kDa.31.56kDa、43.22kDa、37.22kDa、27.43kDa的六组纯化蛋白。采用Folin-酚法检测各融合蛋白的浓度,六组蛋白浓度检测结果：His-Cyt/TM/Ii-key/F306为1.47mg/mL、His-Cyt/TM/Ii-key/F306/VP2为0.91 mg/mL、His-Cyt/TM/Ii-key/VP2为0.78 mg/mL、His-Cyt/TM/Ii-key/VP2/F306为0.96 mg/mL、GST-F306为0.93 mg/mL、GST-VP2为0.85 mg/mL,均达到后续实验的要求。最后,免疫Balb/c小鼠,叁免后采血制备多克隆抗体。确定最佳抗原工作浓度为2.0μg/mL,最佳抗体稀释浓度为1：2000。用间接ELISA方法检测血清抗体效价,测得抗体效价在2.1×104至8.6×10‘之间。结果表明：基于免疫载体Cyt/TM/Ii-key的含两个表位的抗原肽His-Cyt/TM/Ii-key/F306/VP2 His-Cyt/TMIi-key/VP2/F306分别与只含单个抗原表位的His-Cyt/TM/Ii-key/F306、 His-Cyt/TM/Ii-key/VP2相比,抗体效价没有降低；经统计学软件分析,两个表位的串联顺序(即表位基因F306、VP2与免疫载体Cyt/TM/Ii-key之间的间隔大小)的不同,其免疫效果差异不显着(P>0.05)。Western Blot分析,各组纯化的融合蛋白具有良好的免疫原性。综上,Cyt/TM/Ii-key作为免疫载体的NDV、IBDV多表位串联疫苗能诱导产生针对不同抗原表位的抗体,而且多表位的串联顺序对免疫效果影响不显着。这为Ii这一新型免疫载体应用于新城疫及法氏囊病的防治提供实验依据。(本文来源于《安徽农业大学》期刊2014-05-25）
孙寅剑[7]（2010）在《IBDV-VP2多表位串联基因的原核表达及表达产物免疫原性分析》一文中研究指出传染性法氏囊病(Infectious bursal disease, IBD)是由传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus, IBDV)引起鸡的急性、高度接触性传染病,是危害世界养禽业的主要传染病之一。该病毒主要侵害鸡的中枢免疫器官——法氏囊,从而导致免疫抑制,造成对其他疫病的易感性增强。近年来,IBDV分子生物学研究虽然取得了较大进展,但在分子水平对IBDV的免疫机理、致病机制、病毒分子的结构与功能方面仍有许多问题有待于进一步深入研究。而鉴定IBDV抗原表位则有助于揭示病毒与机体相互作用的本质,从而进一步探索IBDV的致病机制和免疫机理。抗原表位,又称抗原决定簇,它是蛋白质抗原性的物质基础,具有刺激机体产生抗体或致敏淋巴细胞并能够与之抗体结合或致敏淋巴细胞识别的特性,在蛋白质抗原的结构与功能中扮演着重要的角色。可见正确而详细地绘制抗原表位图谱对疾病的诊断、设计无毒副作用的多表位疫苗以及免疫治疗试剂等具有积极的意义。目前在预防医学领域许多关于以表位为基础的,如表位疫苗和特异性诊断试剂等的研究也就成了热点。而多表位疫苗因其携带更多的中和表位信息,可以提供更多的保护,本课题以其为出发点,对IBDV多表位疫苗的分子设计及表达产物的人工保护试验进行了研究,结果证明该多表位疫苗的研究思路不仅可提供vvIBDV新的防制制剂,而且将为分子免疫学以及高效基因工程疫苗的研究奠定基础。本研究共分两部分:一、IBDV多表位串联基因的原核表达及免疫原性分析本研究室前期研究利用4株IBDV-VP2单克隆抗体(McAb)从噬菌体随机肽库中筛选得到了4个含有不同IBDV-VP2抗原表位的模拟肽序列。在此基础上,将4个抗原模拟表位用GGGS四肽连接构建多表位串联基因4epis。将该基因合成、克隆后,构建原核表达质粒pET-4epis,于大肠杆菌E.coli BL21(DE3)pLysS中表达重组多表位蛋白r4EPIS。SDS-PAGE分析表明目的蛋白获得了表达,并以包涵体形式存在,经包涵体洗涤、蛋白纯化,其纯度可达90%以上,分子量约30kDa。将纯化后的表达产物免疫SPF鸡,ELISA分析其抗血清效价在1:10240以上,Western-blot分析表明表达产物r4EPIS能与IBDV单克隆抗体发生反应,从而证明该多表位基因4epis在原核中得到了表达,且表达产物具有良好的免疫原性。这为研究超强毒IBDV的免疫机理及基因工程亚单位疫苗的研制奠定了基础。二、IBDV-VP2多表位蛋白的人工保护试验本研究选取7日龄SPF鸡160只,随机分成8组,平均每组20只,按照以下组别进行试验:对照组、IBDV疫苗组、弗氏佐剂组、表达蛋白4EPIS组、VP2抗原组、4EPIS+弗氏佐剂(1:2) (体积比)组、4EPIS+弗氏佐剂(1:1)组和4EPIS+弗氏佐剂(2:1)组。根据组别分别于14日龄一免、21日龄二免,对照组则用生理盐水替代。7d后即28日龄时进行IBDV攻毒,分别于攻毒前、攻毒后的第3d、7d、14d的时候采样(胸腺、法氏囊、脾脏、血清等)。进行免疫器官指数、ANAE+淋巴细胞百分率、血清SOD活性以及抗体效价等的测定。试验结果表明:用200个ELD50超强毒IBDV攻击SPF鸡,4EPIS+弗氏佐剂(2:1)组攻毒保护率最高,达90%以上。说明目的蛋白r4EPIS联合免疫佐剂构建的多表位疫苗能够促进鸡体免疫器官的发育并有效的阻止IBDV对机体的损伤,能够维持较高的抗体水平、显着提高ANAE+淋巴细胞百分率和血清SOD活性,从而提高机体的免疫力。试验证明表达产物r4EPIS可诱导机体产生抗IBDV感染的保护性免疫应答,预示构建的多表位串联基因4epis可作为IBD多表位疫苗研究的候选基因。(本文来源于《山东农业大学》期刊2010-06-12）
韩婷[8]（2010）在《牛乳β-乳球蛋白过敏原表位串联体的表达》一文中研究指出牛乳过敏是一种常见的食物过敏反应,其中β-乳球蛋白是公认的主要乳过敏原之一,大约82%的牛乳过敏患者对β-乳球蛋白过敏。另外,表位是引发食物过敏的物质基础,对食物过敏原表位的探索是食物过敏研究的重要组成部分。因此,开展牛乳p-乳球蛋白表位的研究具有重要意义。此外,本研究将p-乳球蛋白表位构建成表位串联体,优化组合的串联体将具有独立的抗原性,在基于食物过敏原表位检测的研发中具有潜在的应用价值。本论文工作研究内容包括牛乳p-乳球蛋白线性表位串联体的分子设计,表位串联体在原核系统中的表达及纯化,抗表位串联体多克隆抗体的制备及表位串联体的抗原性和过敏原性评估。研究的主要方法、结果及结论如下：1.以牛乳p-乳球蛋白与人血清IgE结合的7个B细胞线性表位(B1,B2,B3,B4,B5,B6,B7)和1个T细胞表位(T)为研究对象,选择适当的间隔序列将其串联。理论上有5040种组合方式。通过DNAStar及SOMPA网络服务器筛选合适的组合方式,使构建的串联体中各表位具有独立的抗原性。B细胞表位之间的间隔序列为甘氨酸(G),T细胞与B细胞表位之间的间隔序列是两个赖氨酸(KK)。最后设计出的串联体分子组合结构为T-K-K-B1-G-B6-G-B5-G-B3-G-B7-G-B2-G-B4。2.在设计好的串联体分子两端分别加上酶切位点BamHI和EcoRI后进行基因合成,合成的基因克隆到载体pMD19-T中。经过双酶切、连接、转化等步骤,成功构建了表达载体pGEX-4T-1-串(pGEX-4T-1-tan),并转化到表达菌株E.coliBL21 (DE3)pLysS中。3.构建好的载体经IPTG诱导表达,表达出的蛋白为串联体融合蛋白,分子量约为39.5kD。经过SDS-PAGE和Western blotting鉴定,表达结果正确。同时通过对诱导温度、时间及IPTG浓度的优化,得到目的蛋白可溶性表达的最佳条件为：23℃诱导4h,IPTG浓度为0.3mmo1／L。表达的蛋白带有GST标签,纯化后其蛋白浓度为4mg／ml。4.以纯化的串联体融合蛋白为抗原,按常规的免疫程序对两只日本大白耳兔进行免疫,间接ELISA检测结果表明,纯化的串联体蛋白具有良好的抗原性,日本大白耳兔对其具有很好的免疫应答。得到的抗体效价分别1：128,000和1：64,000。通过间接ELISA及免疫印迹实验,结果表明本实验纯化的串联体蛋白与牛乳β-乳球蛋白存在较强的免疫交叉反应。5.用牛乳过敏患者血清检测串联体融合蛋白的过敏原性,结果显示串联体融合蛋白具有一定的过敏原性。(本文来源于《南昌大学》期刊2010-06-01）
段秀梅,车媛媛,黄晶,石旭,李丹[9]（2010）在《CEA抗原表位串联体与FL共表达基因疫苗抑制小鼠肝癌细胞体内生长的研究》一文中研究指出目的:观察CEA抗原表位串联体与FL共表达基因疫苗抑制荷瘤小鼠肿瘤生长。方法:利用基因重组技术将CEA抗原表位叁串联体和FL基因片段克隆到质粒pcDNA3.0上,肌注免疫BALB/c小鼠,观察重组基因疫苗对CEA阳性肿瘤的抑制作用、小鼠生存时间及其诱导小鼠杀伤效应细胞的活性。结果:pcDNA-triCEA625-667-sFL免疫组小鼠生存时间延长,肿瘤生长速度缓慢,瘤块较小,与对照组小鼠比较有显着性差异(P<0.01);经pcDNA-triCEA625-667-sFL免疫的小鼠脾细胞对H22-CEA+的杀伤率明显升高,差异有显着性(P<0.01)。结论:共表达叁倍体CEA抗原表位和FL的基因疫苗可以有效抑制CEA阳性肿瘤在小鼠体内的生长,并增强小鼠杀伤效应细胞的活性。(本文来源于《中国免疫学杂志》期刊2010年04期）
韩婷,陈红兵,李欣[10]（2009）在《β-乳球蛋白表位串联体的原核表达与纯化》一文中研究指出目的:β-乳球蛋白(β-LG)是牛乳中的主要过敏原之一,而表位则是引发食物过敏的物质基础。本实验利用基因重组技术将β-乳球蛋白表位重组,在原核系统中表达该表位串联体(T)并对其抗原性进行分析,为后续的研究工作提供实验材料。方法:表位串联体基因克隆到pGEX-4T-1原核表达载体,构建好的pGEX-4T-1-T质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS进行IPTG诱导表达;通过优化得到可溶性GST-T融合蛋白的最佳表达条件,并采用免疫印迹方法检测表达蛋白的抗原性。同时利用GST-Sepharose4B亲和层析方法对GST-T融合蛋白进行纯化。结果:GST-T融合蛋白可溶性表达的最佳条件为:IPTG0.3mmol/L、诱导温度23℃、诱导时间4h。SDS-PAGE和Western blotting检测结果表明,表达的目的蛋白确定为β-乳球蛋白表位串联体,并与天然的β-乳球蛋白有相同的抗原性。菌体裂解上清经亲和纯化后得到纯度较高的融合蛋白,分子量为39.5kD。讨论:选择合适的表达载体和表达菌株能使目的蛋白得到有效表达,同时通过优化表达条件,能最大程度的得到可溶性蛋白,为相关的蛋白表达研究提供思路。(本文来源于《中国食品科学技术学会第六届年会暨第五届东西方食品业高层论坛论文摘要集》期刊2009-11-11）
多表位串联体论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
目的:肺孢子菌肺炎(Pneunocystis pneumonia,PCP),是由机会性致病真菌——肺孢子菌(Pneumocystis,Pc)所引起的一种感染性疾病,最常发生于肺部,严重可致死。PCP最开始引起人们的关注是由于研究揭示了它与人类免疫缺陷病毒(HIV)感染密切相关,特别在1981年将PCP定义为获得性免疫缺陷综合症(AIDS)的标志性疾病;近年来的流行病学资料显示,随着器官移植、恶性肿瘤、长期应用激素等非HIV感染的免疫功能抑制患者增多,在这类患者中并发PCP的临床病例不断上升,PCP再次引起了国内外研究者的极大关注。目前PCP临床治疗主要以复方磺胺甲基异恶唑为主,虽然能够取得一定的疗效,但因其毒副作用较大,造成部分患者不能耐受,加之出现的耐药性等问题,药物防治PCP面临严峻挑战。于是,国内外研究者纷纷将注意力转移到针对PCP的新防治策略及相关疫苗的开发上。先前有研究发现,作为Pc抗原成分之一的P55蛋白,在抗PCP中具有重要作用。机体主动免疫天然P55蛋白后,产生的免疫反应可以使机体在感染的初期得到一定程度的保护,故有研究者认为P55蛋白最有希望成为抗PCP的候选疫苗之一。然而,由于P55蛋白存在5种变异体,再加上到目前为止Pc在体外很难培养出足够的数量用于抗原制备,以致抗原的来源受阻,造成P55蛋白疫苗的开发一直没有取得有效进展。基于上述原因,本课题组利用生物信息学和分子生物学技术,人工设计构建了包括5种变异体有效抗原表位在内的p55多表位串联基因(p55TAG),并在前期研究中用原核表达载体及真核表达载体验证出p55TAG能有效表达出目的抗原蛋白,且该基因的分子疫苗在免疫抑制的大鼠PCP模型中具有一定的免疫保护潜力。但因Pc作为一种机会性感染真菌,主要侵犯免疫功能低下患者,对于这类人群采用常规单一的分子疫苗往往难以达到预期的免疫效果,于是课题组提出采用异质性“初次-加强免疫策略”(prime-booststrategy),即用两种异质的分子疫苗进行免疫,以提高疫苗抗PCP的效果。根据上述构想,本研究计划首先利用腺病毒载体搭载p55TAG构建一个重组腺病毒载体疫苗;其次验证其在真核细胞HEK293中的蛋白表达情况;最后用包装好的重组腺病毒载体疫苗免疫小鼠,检测小鼠体内相关免疫指标,以分析构建疫苗的免疫原性。期望能为抗PCP感染的异质性“初次-加强免疫策略”提供一种具有“加强免疫”作用的制剂,为最终建立有效的抗PCP疫苗奠定前期实验基础。研究方法:第一部分:肺孢子菌p55TAG重组腺病毒载体疫苗构建及真核细胞内表达验证1.p55TAG的获取与扩增用BglⅡ和XhoⅠ双酶切pMD18-T克隆载体上p55TAG目的基因,产物测序鉴定;PCR扩增鉴定正确的目的基因,产物胶回收。2.p55TAG重组腺病毒载体构建经EcoRI酶切的腺病毒连接质粒pHBAd-EF1-MCS-GFP与p55TAG目的基因进行连接后转化到DH5α大肠杆菌感受态中,PCR扩增Amp+LB培养基上的单克隆菌落,产物测序鉴定。3.p55TAG重组腺病毒载体的病毒包装将重组腺病毒载体与腺病毒骨架质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre共转染进HEK293细胞后观察GFP表达及CPE改变,包装后的重组腺病毒命名为pHBAd-p55TAG。4.p55TAG重组腺病毒的鉴定及真核细胞中目的蛋白表达提取pHBAd-p55TAG核酸,PCR扩增后产物测序鉴定;对重组腺病毒在HEK293细胞内所表达的蛋白进行SDS-PAGE与Western blot鉴定。第二部分:肺孢子菌p55TAG重组腺病毒载体疫苗免疫原性检验5.重组腺病毒的扩增、纯化、滴度测定用pHBAd-p55TAG反复感染HEK293细胞叁次,收集最后一次的病毒液,CsCl梯度离心法纯化病毒,TCID50法测定纯化后的病毒滴度。6.重组腺病毒载体疫苗免疫动物将6～8周龄、雌性BALB/c小鼠,按随机分组原则分为pHBAd-GFP、pHBAd-p55TAG、PBS叁组,每组10只;腹腔单针免疫,注射量为50μl/只。7.重组腺病毒载体疫苗免疫原性检验于免疫后的第3d、1w、2w、3w末采集小鼠血清,MSD法检测IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-17四种细胞因子的水平;ELISA法检测3w末小鼠血清中IgG总抗体、IgG1和IgG2a抗体亚类的水平;流式细胞术对3w末小鼠脾细胞进行CD4+T和CD8+T淋巴细胞亚群分析,同时用qPCR法检测脾细胞中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-17四种细胞因子相对表达量变化。8.统计学分析采用SPSS19.0软件进行统计分析,计量资料数据以均数±标准差(X±SD)表示,多组间比较采用单因素方差分析(one-wayANOVA),两组间比较采用LSD-t检验,P<0.05表示有统计学差异。结果:第一部分:肺孢子菌p55TAG重组腺病毒载体疫苗构建及真核细胞内表达验证1.p55TAG的获取与扩增结果从本室保存的载体上经酶切、PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳检测,结果在1200bp左右处出现特异条带(p55TAG基因片段全长1164bp),测序结果与原始p55TAG目的基因序列一致。2.p55TAG重组腺病毒载体构建结果转化后,从Amp+LB平板挑选8个单克隆菌落,经PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳鉴定,有6个转化子在1500bp处出现特异性条带,选取阳性PCR产物进行测序,测序结果与原始p55TAG目的基因序列一致,证明重组腺病毒载体成功构建。3.p55TAG重组腺病毒载体的病毒包装结果重组腺病毒载体与腺病毒骨架质粒共转染HEK293细胞,48h后观察到GFP明显表达,证明转染成功;8d后细胞出现典型CPE现象,证明重组腺病毒包装成功。4.p55TAG重组腺病毒的鉴定结果PCR扩增pHBAd-p55TAG,产物电泳后在1500bp出现特异性条带,测序结果与原始p55TAG目的基因序列比对结果一致,证明包装出的腺病毒中携带有p55TAG目的基因。5.p55TAG重组腺病毒在HEK293细胞中蛋白表达结果Western blot显示:与空载病毒相比,重组腺病毒在60kDa处有一明显条带,与预期结果相符,证明pHBAd-p55TAG在HEK293细胞中成功表达出目的蛋白。第二部分:肺孢子菌p55TAG重组腺病毒载体疫苗免疫原性检验6.重组腺病毒的扩增、纯化后滴度测定结果pHBAd-p55TAG扩增叁代,纯化后的病毒采用TCID50法测定的病毒滴度为1.99×1010PFU/ml,可用于下一步动物免疫实验。7.鼠脾CD4+T和CD8+T淋巴细胞亚群流式分析结果流式细胞术分析3w末小鼠脾T淋巴细胞,统计学分析结果显示;pHBAd-p55TAG组的CD4+T淋巴细胞升高水平相较于pHBAd-GFP和PBS组具有统计学意义(P<0.05;P<0.01);而在各组CD8+T淋巴细胞水平比较中,pHBAd-p55TAG组CD8+T淋巴细胞升高水平相较于PBS组具有统计学意义(P<0.05)。8.鼠血清中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-17四种细胞因子变化水平分析结果MSD法检测鼠血清中四种细胞因子的浓度随时间变化水平,统计学分析结果显示:pHBAd-p55TAG组细胞因子IFN-γ和IL-17浓度升高水平相比其他两组具有统计学差异(P<0.01);而IL-2和IL-4的变化则不具有统计学意义(P>0.05)。9.鼠血清中总IgG抗体及IgG1和IgG2a抗体亚类变化水平分析结果ELISA法检测3w末鼠血清中IgG抗体和IgG2a亚类的变化水平,与其他两组相比,pHBAd-p55TAG组显着升高(P<0.01),而抗体IgG1亚类在叁组之间的变化水平无统计学意义(P>0.05);计算叁组IgG2a与IgG1比值,进行统计学分析结果显示pHBAd-p55TAG组与其他两组比较具有统计学差异(P<0.05)。10.鼠脾细胞中四种细胞因子Real-time PCR相对定量检测结果pHBAd-p55TAG组与pHBAd-GFP组相比PBS组四种细胞因子的表达量均有所升高,pHBAd-p55TAG组相较于PBS组,除IL-4外,其余叁种细胞因子的升高水平都具有不同程度的统计学差异,其中IL-17的升高具有极显着差异(P<0.001);在pHBAd-p55TAG组与pHBAd-GFP组的统计学比较中,只有IL-17的升高水平具有统计学意义(P<0.001)。结论:1.本研究成功构建出p55多表位串联基因腺病毒载体;2.包装后的p55多表位串联基因腺病毒载体疫苗,可在真核细胞HEK293中成功表达出目的蛋白;3.构建的p55多表位串联基因腺病毒载体疫苗免疫BALB/c小鼠后,能诱发小鼠体内细胞和体液免疫反应,验证其具有一定的免疫原性,为进一步抗肺孢子菌感染新策略、新疫苗研究奠定了实验基础。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
多表位串联体论文参考文献
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