本文主要研究内容
作者朱慧敏（2019）在《自噬在肠道病毒71型复制中的作用和机制初步研究》一文中研究指出：研究背景和目的肠道病毒71型(EV71)是手足口病的主要病原体之一,由EV71引起的手足口病大部分表现为轻微症状,但仍有部分患者的病情进展为重症神经系统疾病,并引起脑干脑炎,急性弛缓性麻痹,肺水肿和心肺功能衰竭,有较高的病死率。由于目前没有有效预防或治疗EV71的药物和疫苗,虽有进入临床试验的药物或疫苗,但很难广泛应用于人群,仍需继续对EV71感染的机制进行深入研究以探索新的针对EV71的药物靶点。细胞自噬(autophagy)是在真核生物中高度保守的过程,降解长寿命蛋白及衰老细胞器以实现再循环利用,发生在细胞正常生长发育、分化的生理过程中,病原体感染时也会引起自噬的发生。由于在免疫过程中的作用,自噬往往被病原体所利用以逃逸免疫,自噬体膜也可能被病原体重构以利于其复制。相关研究通过体内外实验证明了EV71感染可诱导自噬并促进EV71复制,但其具体分子机制仍未明确。EV71病毒的VP1蛋白位于病毒最外部的部分,能够结合宿主细胞表面受体来协助病毒感染,具有重要的研究意义,VP1蛋白与宿主细胞蛋白存在复杂的相互作用。因此,本研究考虑VP1蛋白可能参与了 EV71诱导自噬的调控机制。故提出猜想:EV71病毒通过其VP1蛋白参与自噬的调控和执行过程。研究方法1.EV71诱导的自噬的检测采用Western Blot技术,检测自噬的生物标志物LC3的转化;构建RD-GFP-RFP-LC3细胞株,通过荧光显微镜对荧光自噬颗粒进行检测。使用qPCR技术检测自噬抑制后的病毒含量,验证EV71病毒复制过程是否需要自噬。2.构建EV71 VP1表达载体,探索VP1蛋白是否参与EV71诱导的自噬将VP1蛋白构建于pEGFP-N1,在表达载体转染后,采用qPCR技术检测自噬相关的基因,采用Westem Blot技术检测自噬相关蛋白,验证EV71 VP1蛋白是否参与EV71诱导自噬的调控机制。3.筛选与VP1蛋白存在相互作用的自噬相关蛋白,并探索其在病毒复制中的作用联合免疫共沉淀技术及质谱技术,筛选与EV71 VP1病毒存在相互作用的自噬相关蛋白;随后设计合成相关蛋白的siRNA,沉默相关蛋白的表达,采用qPCR技术检测病毒的含量变化。结果1.RD-GFP-RFP-LC3细胞构建成功,在EV71感染后可观察到绿色和红色的自噬荧光颗粒。Western Blot检测结果显示以MOI=1感染细胞,在感染后12、24、48h,LC3 Ⅱ的含量均高于对照组;在EV71感染48h后,自噬相关蛋白ATG4B、ATG5、ATG7的蛋白含量增加,而在加入自噬抑制剂3-MA后含量减少。2.qPCR检测病毒含量显示,应用自噬抑制剂3-MA后,细胞内病毒的复制在0h、6h、12h、24h分别减少3.9倍、48.7倍、18.1倍、9.3倍,24h上清病毒含量减少8.3倍(p<0.05);应用自噬抑制剂LY294002后,9h和12h的细胞内病毒的含量减少3、2,2倍(p<0.05)。3.构建VP1表达载体,在表达载体转染后,qPCR检测显示与对照组相比,转染了pEGFP-N1-VP1后,ATG5在24h升高1.6倍,ATG7在24h时升高1.2倍(p<0.05),Western Blot检测显示与对照组和阳性对照pEGFP-N1组相比,转染了pEGFP-N1-VP1 24、48h后,LC3 Ⅱ蛋白量较对照组的明显增加,而添加3-MA抑制自噬后,LC3 Ⅱ蛋白量相对减少。在转染pEGFP-N1-VP1 24h时,自噬相关蛋白ATG4B、ATG5、ATG7的表达也较对照组增加,而添加3-MA抑制自噬后相对减少。4.构建VP1分段表达载体,在表达载体转染后,Western Blot检测显示和pEGFP-N1 相比,与pEGFP-N1-VP1一样,pEGFP-N1-VP1(6)可以引起 LC3发生酯化,LC3 Ⅱ明显增加。此外,ATG5的蛋白含量较pEGFP-N1、对照组增多。5.联合免疫共沉淀技术及质谱技术,筛选出7个与VP1及VP1(6)均存在相互作用的蛋白,其中PHB2参与自噬。6.针对PHB2设计合成siRNA,转染后感染病毒,qPCR检测显示与NC组相比,感染后12、24、48h细胞内PHB2含量减少约77%、52%、82%(p<0.05),细胞内病毒RNA含量减少57.6%(p<0.05)。结论1.EV71感染后可诱导自噬并促进病毒复制。2.EV71病毒的VP1蛋白的尾部参与EV71病毒诱导自噬的过程。3.EV71 VP1蛋白能够通过其与PHB2的相互作用,参与自噬的调控或执行过程,促进病毒自噬的复制。
Abstract
yan jiu bei jing he mu de chang dao bing du 71xing (EV71)shi shou zu kou bing de zhu yao bing yuan ti zhi yi ,you EV71yin qi de shou zu kou bing da bu fen biao xian wei qing wei zheng zhuang ,dan reng you bu fen huan zhe de bing qing jin zhan wei chong zheng shen jing ji tong ji bing ,bing yin qi nao gan nao yan ,ji xing chi huan xing ma bi ,fei shui zhong he xin fei gong neng cui jie ,you jiao gao de bing si lv 。you yu mu qian mei you you xiao yu fang huo zhi liao EV71de yao wu he yi miao ,sui you jin ru lin chuang shi yan de yao wu huo yi miao ,dan hen nan an fan ying yong yu ren qun ,reng xu ji xu dui EV71gan ran de ji zhi jin hang shen ru yan jiu yi tan suo xin de zhen dui EV71de yao wu ba dian 。xi bao zi shi (autophagy)shi zai zhen he sheng wu zhong gao du bao shou de guo cheng ,jiang jie chang shou ming dan bai ji cui lao xi bao qi yi shi xian zai xun huan li yong ,fa sheng zai xi bao zheng chang sheng chang fa yo 、fen hua de sheng li guo cheng zhong ,bing yuan ti gan ran shi ye hui yin qi zi shi de fa sheng 。you yu zai mian yi guo cheng zhong de zuo yong ,zi shi wang wang bei bing yuan ti suo li yong yi tao yi mian yi ,zi shi ti mo ye ke neng bei bing yuan ti chong gou yi li yu ji fu zhi 。xiang guan yan jiu tong guo ti nei wai shi yan zheng ming le EV71gan ran ke you dao zi shi bing cu jin EV71fu zhi ,dan ji ju ti fen zi ji zhi reng wei ming que 。EV71bing du de VP1dan bai wei yu bing du zui wai bu de bu fen ,neng gou jie ge su zhu xi bao biao mian shou ti lai xie zhu bing du gan ran ,ju you chong yao de yan jiu yi yi ,VP1dan bai yu su zhu xi bao dan bai cun zai fu za de xiang hu zuo yong 。yin ci ,ben yan jiu kao lv VP1dan bai ke neng can yu le EV71you dao zi shi de diao kong ji zhi 。gu di chu cai xiang :EV71bing du tong guo ji VP1dan bai can yu zi shi de diao kong he zhi hang guo cheng 。yan jiu fang fa 1.EV71you dao de zi shi de jian ce cai yong Western Blotji shu ,jian ce zi shi de sheng wu biao zhi wu LC3de zhuai hua ;gou jian RD-GFP-RFP-LC3xi bao zhu ,tong guo ying guang xian wei jing dui ying guang zi shi ke li jin hang jian ce 。shi yong qPCRji shu jian ce zi shi yi zhi hou de bing du han liang ,yan zheng EV71bing du fu zhi guo cheng shi fou xu yao zi shi 。2.gou jian EV71 VP1biao da zai ti ,tan suo VP1dan bai shi fou can yu EV71you dao de zi shi jiang VP1dan bai gou jian yu pEGFP-N1,zai biao da zai ti zhuai ran hou ,cai yong qPCRji shu jian ce zi shi xiang guan de ji yin ,cai yong Westem Blotji shu jian ce zi shi xiang guan dan bai ,yan zheng EV71 VP1dan bai shi fou can yu EV71you dao zi shi de diao kong ji zhi 。3.shai shua yu VP1dan bai cun zai xiang hu zuo yong de zi shi xiang guan dan bai ,bing tan suo ji zai bing du fu zhi zhong de zuo yong lian ge mian yi gong chen dian ji shu ji zhi pu ji shu ,shai shua yu EV71 VP1bing du cun zai xiang hu zuo yong de zi shi xiang guan dan bai ;sui hou she ji ge cheng xiang guan dan bai de siRNA,chen mo xiang guan dan bai de biao da ,cai yong qPCRji shu jian ce bing du de han liang bian hua 。jie guo 1.RD-GFP-RFP-LC3xi bao gou jian cheng gong ,zai EV71gan ran hou ke guan cha dao lu se he gong se de zi shi ying guang ke li 。Western Blotjian ce jie guo xian shi yi MOI=1gan ran xi bao ,zai gan ran hou 12、24、48h,LC3 Ⅱde han liang jun gao yu dui zhao zu ;zai EV71gan ran 48hhou ,zi shi xiang guan dan bai ATG4B、ATG5、ATG7de dan bai han liang zeng jia ,er zai jia ru zi shi yi zhi ji 3-MAhou han liang jian shao 。2.qPCRjian ce bing du han liang xian shi ,ying yong zi shi yi zhi ji 3-MAhou ,xi bao nei bing du de fu zhi zai 0h、6h、12h、24hfen bie jian shao 3.9bei 、48.7bei 、18.1bei 、9.3bei ,24hshang qing bing du han liang jian shao 8.3bei (p<0.05);ying yong zi shi yi zhi ji LY294002hou ,9hhe 12hde xi bao nei bing du de han liang jian shao 3、2,2bei (p<0.05)。3.gou jian VP1biao da zai ti ,zai biao da zai ti zhuai ran hou ,qPCRjian ce xian shi yu dui zhao zu xiang bi ,zhuai ran le pEGFP-N1-VP1hou ,ATG5zai 24hsheng gao 1.6bei ,ATG7zai 24hshi sheng gao 1.2bei (p<0.05),Western Blotjian ce xian shi yu dui zhao zu he yang xing dui zhao pEGFP-N1zu xiang bi ,zhuai ran le pEGFP-N1-VP1 24、48hhou ,LC3 Ⅱdan bai liang jiao dui zhao zu de ming xian zeng jia ,er tian jia 3-MAyi zhi zi shi hou ,LC3 Ⅱdan bai liang xiang dui jian shao 。zai zhuai ran pEGFP-N1-VP1 24hshi ,zi shi xiang guan dan bai ATG4B、ATG5、ATG7de biao da ye jiao dui zhao zu zeng jia ,er tian jia 3-MAyi zhi zi shi hou xiang dui jian shao 。4.gou jian VP1fen duan biao da zai ti ,zai biao da zai ti zhuai ran hou ,Western Blotjian ce xian shi he pEGFP-N1 xiang bi ,yu pEGFP-N1-VP1yi yang ,pEGFP-N1-VP1(6)ke yi yin qi LC3fa sheng zhi hua ,LC3 Ⅱming xian zeng jia 。ci wai ,ATG5de dan bai han liang jiao pEGFP-N1、dui zhao zu zeng duo 。5.lian ge mian yi gong chen dian ji shu ji zhi pu ji shu ,shai shua chu 7ge yu VP1ji VP1(6)jun cun zai xiang hu zuo yong de dan bai ,ji zhong PHB2can yu zi shi 。6.zhen dui PHB2she ji ge cheng siRNA,zhuai ran hou gan ran bing du ,qPCRjian ce xian shi yu NCzu xiang bi ,gan ran hou 12、24、48hxi bao nei PHB2han liang jian shao yao 77%、52%、82%(p<0.05),xi bao nei bing du RNAhan liang jian shao 57.6%(p<0.05)。jie lun 1.EV71gan ran hou ke you dao zi shi bing cu jin bing du fu zhi 。2.EV71bing du de VP1dan bai de wei bu can yu EV71bing du you dao zi shi de guo cheng 。3.EV71 VP1dan bai neng gou tong guo ji yu PHB2de xiang hu zuo yong ,can yu zi shi de diao kong huo zhi hang guo cheng ,cu jin bing du zi shi de fu zhi 。
论文参考文献
论文详细介绍
论文作者分别是来自南方医科大学的朱慧敏，发表于刊物南方医科大学2019-09-02论文，是一篇关于自噬论文,病毒论文,蛋白论文,蛋白论文,南方医科大学2019-09-02论文的文章。本文可供学术参考使用，各位学者可以免费参考阅读下载，文章观点不代表本站观点，资料来自南方医科大学2019-09-02论文网站，若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权，请联系我们删除。
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