1.湖南省肿瘤医院消化泌尿内科长沙410003；2.湖南师范大学医学院病理教研室长沙410005
【摘要】目的探讨抑癌基因失活与在胃癌（GC）发生发展的关系。方法采用荧光实时定量PCR和免疫组化检测35例胃癌组织及配对癌旁非肿瘤组织中MerlinmRNA和蛋白表达水平；探索其与GC患者临床病理特征间的关系。结果MerlinmRNA和蛋白在癌旁非肿瘤组织中高表达，而在癌组织中的表达则明显下调，差异有显著性（P<0.05）；在高、中分化腺癌、I期和II期、无淋巴结转移GC中Merlin蛋白阳性率，分别高于低分化腺癌、Ⅲ期和Ⅳ期、有淋巴结转移（P<0.05）。结论Merlin基因具有抑制GC发生及侵袭转移作用。
【关键词】胃癌；Merlin；侵袭转移；抑癌基因
[Abstract]ObjectiveToinvestigatetheroleoftumorsuppressgeneinhumangastriccarcinoma（GC）progress.MethodsTheexpressionofMerlinmRNAandproteininhumanGCtumortissueandpairedadjacentnon-tumortissueweredetectedbyQuantitativereal-timePCRandImmunohistochemistry.ResultsBothMerlinmRNAandproteinishighlyexpressedinGCtissues，andexpressioninGCtissuesissignificantlymodulated（P<0.05）.ThepositiverateofMerlinproteininhighand/ormediumdifferentiatedadenocarcinoma，IphaseandIIphase，andnolymphnodemetastasisweresignificanthigherthanthoseoflowdifferentiatedadenocarcinoma，IIIanpstage，andlymphnodemetastasis（P<0.05）.ConclusionOurresultssuggestingthatMerlingenecouldplayainhibitroleintheprogressofGC.
［keywords］Gastriccancer；Merlin；Invasionandmetastasis；Tumorsuppressgene
Merlin也称NF2基因是一种瘤抑制基因，其失活可导致蛋白质的变性并可诱导肿瘤的发生。其编码的merlin蛋白与细胞的运动和增殖有着较密切的关系，磷酸化使merlin蛋白丧失了抑制肿瘤生长的能力[1]。为研究抑癌基因表达与胃癌发生发展之间的联系。笔者采用荧光实时定量PCR和免疫组化方法检测胃癌组织及配对癌旁非肿瘤组织中MerlinmRNA和蛋白表达水平，分析其表达水平与TNM分期、分化程度及淋巴结转移情况等临床病理特征因素的相关性。
1资料和方法
1.2.1一般资料及标本采集
收集湖南省肿瘤医院医院2014年1月至2014年12月间胃癌根治性手术所切除的胃癌组织标本和配对的癌旁非肿瘤组织标本共35例，且均经术后病理组织学检查诊断证实。患者术前均未行化学治疗或放射治疗。其中男21例，女14例；中位年龄50岁（22～65岁）。肿瘤大小：＜５cm10例，≥５cm25例。分化程度：高分化4例，中分化8例，低分化23例；侵及浆膜及浆膜以外者13例，未及浆膜者22例；有淋巴结转移的20例，无淋巴结转移的15例。根据2014年国际抗癌联盟/美国癌症联合委员会（UICC/AGCC）TNM分期标准：Ⅰ期3例、Ⅱ期10例，Ⅲ期18例、Ⅳ期4例。
癌旁非肿瘤组织来自于肿瘤两端的切缘，经病理证实无癌细胞浸润。部分新鲜胃癌组织标本用于检测MerlinmRNA，剩余部分病理标本经40g/L甲醛固定，常规石蜡包埋，制备为5µm厚的连续切片。所有病理标本分为胃癌组织与癌旁非肿瘤组织2组；胃癌组织根据病理类型、临床分期、有无淋巴结转移再进行分组。
1.2.3荧光定量PCR检测MerlinmRNA的表达
采用Trizol方法按操作说明书提取胃癌组织、临近癌旁非癌胃组织的总RNA。Merlin的cDNA则由大连宝生物逆转录试剂盒合成，应用分光光度法监测RNA浓度，并使用琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。实时定量PCR按照SYBRGreenqPCR试剂盒说明书（购自大连宝生物生物技术有限公司）完成，用β-actin作为内参。所有实验部分重复3次。
l.2.4免疫组化检测Merlin蛋白的表达
所有标本均经福尔马林固定、脱水、常规石蜡包埋，并经常规HE染色病理检查。再行SP法免疫组化染色检查（试剂盒购自福州迈新生物技术公司），Merlin单克隆抗体工作浓度1：500（购自英国Abcame公司），设阴性对照检测抗体特异性。
l.2.5免疫组化染色结果评判
细胞膜上及胞浆中出现棕黄褐色颗粒为阳性细胞，PBs替代一抗作为阴性对照。x200高倍镜下随机计数10个视野，首先按细胞染色强度评分，无染色计0分，棕黄色计2分，棕褐色计3分。再按阳性细胞所占百分比评分，无阳性细胞计0分，阳性细胞≤10％计1分，11％-50％计2分，5l％-75％计3分，>75％计4分。染色强度计分与阳性细胞百分比计分乘积>3者为免疫组化阳性。
1.2.5统计学处理
采用SPSS18.0统计软件分析结果。对多组实验数据采用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1MerlinmRNA在胃癌组织和癌旁非肿瘤组织中的表达水平
在癌组织水平，与邻近癌旁非癌胃组织对比，Merlin在胃癌组织中的表达则明显下调（0.64±0.12vs.1.23±0.32），差异具有统计学意义（P<0.05）。
图1MerlinmRNA在胃癌及癌旁非肿瘤组织中表达
2.2Merlin蛋白在胃癌组织和癌旁非肿瘤组织中的表达水平
免疫组化检测结果显示（图2），Merlin阳性表达的细胞呈现黄棕褐色，Merlin表达阴性的细胞呈现蓝紫色。癌旁非肿瘤组织中Merlin阳性率（85.7％，30/35）高于癌组织（20.0％，7/35），差异有非常显著性（P<0.01）。见表l。
3讨论
Merlin蛋白由肿瘤抑制基因NF2编码而来[1]。Merlin蛋白主要定位于与细胞骨架重塑有关的区域，主要参与上皮细胞中细胞骨架与胞膜之间的连接，具有维持细胞形态和运动、连接黏附分子及调节信号转导等功能，还是第1个被发现具有肿瘤抑制作用的蛋白质[2]。研究发现当其编码基因发生突变时，Merlin蛋白失活，生长抑制功能丧失，最终导致肿瘤的形成[3]。
Merlin蛋白在肿瘤的发生、发展进程中发挥抑癌的作用[4]。在许多肿瘤的发生发展中，Merlin蛋白有不同程度的表达下降或缺失，与Wnt/β-catenin信号通路活化有关[5]。Jackson等在研究Merlin蛋白在晚期乳腺癌的表达时，发现Merlin蛋白表达显著减少，可能与肿瘤促进转化生长因子（TGF）的表达增加有关[6]。TGF参与上皮间质转化，不仅广泛分布于基质等多种正常组织和细胞中，而且在许多肿瘤组织中都过量表达。TGF的升高可作为晚期乳腺癌的标志。在肝癌的体外研究中发现，Merlin蛋白在肝癌的细胞系都是减少的[7]。对于胰腺癌的体外研究发现：肿瘤细胞转染NF2基因后与未转染组和空白质粒转染组相比，其生长、增殖水平和迁移能力以及细胞与基质黏附附能力均表现出明显的降低[8]，说明Merlin蛋白通过折叠蛋白KSR1调节肿瘤抑制作用[9]。
也有一些研究表明Merlin蛋白在一些肿瘤中的表达是升高的，Merlin蛋白起着肿瘤蛋白的作用。Merlin蛋白在非小细胞肺癌中的表达及临床意义的研究中发现：Merlin蛋白在肺癌组织的阳性率为73.33％[10]。在一些卵巢癌的细胞系和卵巢癌患者腹水的肿瘤细胞中，Merlin蛋白表达升高，Merlin在此起研究发现在着癌基因的作用[11]。这些研究结果提示Merlin蛋白表现出复杂的调控特性，Merlin蛋白功能具有双重性，根据细胞的不同类型和不同状态等，发挥抑癌基因或癌基因的功能。
本课题通过荧光定量PCR和免疫组化方法检测MerlinmRNA和蛋白在在胃癌组织和癌旁组织中的表达，MerlinmRNA在胃癌组织中的表达则明显下调。临床分析发现Merlin蛋白在高、中分化腺癌Merlin阳性率高于低分化腺癌。临床分期I、II期胃癌Merlin阳性率高于Ⅲ、Ⅳ期胃癌。有淋巴结转移的胃癌中Merlin阳性率明显低于无淋巴结转移者。说明Merlin蛋白表达与胃癌的病理类型、临床分期、淋巴结转移呈负相关，提示Merlin基因具有抑制胃癌浸润和转移作用。由于本研究使用的样本量较小，今后尚需加大样本量对Merlin蛋白与胃癌预后的关系进行进一步的深入研究。
参考文献：
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资助项目：湖南省科技厅基金（2013FJ3013）