导读:本文包含了重组马立克病毒论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:鸡传染性法氏囊病,VP2基因,马立克氏病,活载体疫苗
重组马立克病毒论文文献综述
李凯[1]（2018）在《表达鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因的重组马立克氏病病毒活载体疫苗研究》一文中研究指出鸡马立克氏病(Marek's disease,MD)和鸡传染性法氏囊病(infectious bursal disease,IBD)是危害我国养禽业健康发展的两种重要的免疫抑制病,其广泛流行给我国养禽业带来了巨大的经济损失。疫苗是控制MD和IBD的主要手段。目前MD主要通过血清1型弱毒疫苗预防。用于预防IBD的疫苗主要是传统活疫苗和灭活疫苗,但传统疫苗不仅易于受到母源抗体的干扰,而且IBD中等毒力活疫苗可以造成一定程度的法氏囊损伤和免疫抑制,因此迫切需要研制更加安全有效的新型IBD疫苗。本研究对我国IBDV超强毒(wIBDV)分离株的遗传变异、抗原性和致病性进行了分析。结果发现,我国wIBDV毒株正在发生持续性进化。与我国早期wIBDV分离株相比,我国2000年后分离的vvIBDV毒株的基因组A、B节段均有一定程度的变异发生;我国vvIBDV毒株与欧洲wIBDV参考毒株的抗原性无显着差异;目前wIBDV毒株的致病性有增强趋势。wIBDV HLJ0504毒株是目前我国的wIBDV流行毒株。鸡马立克氏病病毒(Marek's disease virus,MDV)弱毒疫苗株是构建重组活载体疫苗的理想载体。为了构建表达IBDV VP2基因的重组MDV活载体疫苗,本研究将MDV血清1型弱毒疫苗814株基因组DNA分段插入Fosmid粘粒,构建了 814株基因组粘粒文库;在此基础上,选取粘粒组合,建立了 MDV 814疫苗株多片段粘粒拯救系统。将eGFP基因表达盒分别插入MDV 814 株基因组不同位点,拯救获得5株稳定表达eGFP的重组病毒。经鉴定,5株重组病毒的复制特性与原疫苗株病毒基本一致;eGFP基因在UL区叁个位点的表达水平无显着差异,高于US2位点,US10位点的表达水平最低。将wIBDV HLJ0504株的VP2基因分别插入MDV 814株基因组的UL41、US2、US10位点,获得3株表达VP2基因的重组MDV(r814UL41VP2、r814US2VP2 和 r814US10VP2)。其中,r814US2VP2免疫SPF鸡后,能够对wIBDV和wMDV的攻毒提供完全保护。通过r814US2VP2(命名为rMDV-VP2株)最小免疫剂量试验,确定了该疫苗的使用剂量为2000PFU/羽份。rMDV-VP2疫苗对wIBDV的保护效果与商品化Vaxxitek HVT-IBD疫苗相当,优于IBD中毒力活疫苗;rMDV-VP2疫苗对wMDV的保护效果与商品化MDV血清1型弱毒疫苗相当,显着优于Vaxxitek HVT-IBD疫苗。rMDV-VP2疫苗对不同的wIBDV分离株都能提供高效免疫保护,可以用于不同品种的商品蛋鸡和地方品种鸡。rMDV-VP2疫苗的免疫保护可以覆盖IBDV的易感期(3-8周龄),并具有至少6个月的抗体持续期。rMDV-VP2疫苗对靶动物和非靶动物均是安全的;rMDV-VP2疫苗的水平传播能力极低,无垂直传播现象;疫苗株病毒免疫鸡后的排毒水平极低,在使用环境中不存在该疫苗株病毒及其病毒DNA的残留。综上所述,rMDV-VP2疫苗安全有效,可以作为一种IBD-MD重组二联活疫苗用于IBD和MD的预防。(本文来源于《中国农业科学院》期刊2018-12-01）
周忠文,林桂芳,王好好,苏帅,崔治中[2]（2018）在《表达禽网状内皮组织增生病病毒env基因的重组马立克病毒的生物学特性》一文中研究指出旨在构建能够表达禽网状内皮组织增生病病毒(reticuloendotheliosis virus,REV)env基因的重组马立克病毒(Marek′s disease virus,MDV),并对其生物学特性进行初步研究。以REV SNV株DNA为模板,PCR扩增其env基因,克隆进真核表达载体pcDNA3.1(+);以其为模板,PCR扩增整个REVenv基因真核表达盒并与卡那霉素抗性基因分别克隆进pUC18载体;以其为模板,利用含有MDV SC9-1株meq基因位点两侧同源臂的引物经PCR扩增REVenv真核表达盒以及卡那霉素抗性基因,利用Red E/T同源重组技术插入SC9-1的meq位点,最终利用阿拉伯糖诱导表达flp重组酶,敲除卡那霉素抗性基因,阳性重组质粒命名为SC9-env BAC。提取SC9-env BAC质粒转染CEF细胞,拯救重组MDV,利用MDV单抗H19以及REV单抗11B118经间接免疫荧光试验鉴定阳性病毒,命名为SC9-env。分析比较SC9-env在CEF细胞上的复制水平,利用动物试验初步评价SC9-env对SPF鸡的致病性以及SC9-env对SPF鸡感染MDV、REV的免疫保护效果。结果表明,利用同源重组技术构建的重组MDV SC9-env能够稳定表达REV env蛋白,且复制水平与亲本病毒SC9-1相似;该重组毒接种SPF鸡没有明显的致病性,且对rMd5的强毒攻击提供92%的免疫保护,与SC9-1差异不显着;SC9-env显着降低REV感染SPF鸡所引起的体重减轻以及灭活苗抗体下降。构建的表达REVenv的重组MDV对感染MDV、REV的SPF鸡具有良好的免疫保护效果。(本文来源于《畜牧兽医学报》期刊2018年07期）
周忠文[3]（2018）在《表达REV env基因的重组马立克病毒的构建及生物学活性研究》一文中研究指出禽网状内皮组织增生病(Reticuloendotheliosis,RE)、马立克病(Marek's disease,MD)是危害我国养禽业健康发展的两大重要免疫抑制性疫病。前期对我省乃至全国范围内鸡群RE的检测,表明RE在鸡群的流行越来越普遍,然而,目前尚没有有效的疫苗对RE进行防控。苏帅等构建了马立克病毒(Marek's disease virus,MDV)致肿瘤基因meq的缺失疫苗SC9-1,能够为免疫鸡提供100%的免疫保护,显着高于MD商品化疫苗CVI988/Rispens的免疫保护(保护率80-90%)。本研究利用SC9-1构建了表达禽网状内皮增生病病毒(Reticuloendotheliosi s virus,REV)env基因的重组MDV,并对其生物学活性进行了研究。1、构建表达REV env的重组MDV SC9-env,并对其致病性、免疫保护效果进行了研究以REV SNV株DNA为模板,PCR扩增其env基因,克隆进真核表达载体pcDNA3.1(+);以其为模板,PCR扩增整个REV env基因真核表达盒与卡那霉素抗性基因分别克隆进pUC18载体;pUC18-env-kana为模板,利用含有MDV SC9-1株meq基因位点两侧同源臂的引物经PCR扩增REV env真核表达盒以及卡那霉素抗性基因,利用同源重组插入SC9-1的meq位点,分别筛选出阳性后,最终利用阿拉伯糖诱导表达flp重组酶,敲除卡那霉素抗性基因,阳性重组质粒命名为SC9-env BAC。选阳性重组质粒SC9-env BAC,转染CEF细胞,拯救重组MDV,利用MDV单抗H19以及REV单抗11B118经间接免疫荧光试验鉴定阳性,命名为SC9-env,分析在CEF细胞上的复制水平,利用动物实验评价SC9-env对SPF鸡的致病性以及SC9-env对SPF鸡感染MDV、REV的免疫保护效果。SC9-env接种SPF鸡没有引起死亡以及肿瘤的发生;SC9-env对感染MDV rMd5的SPF鸡能够提供92%的免疫保护,与SC9-1差异不显着;SC9-env能够降低SNV感染SPF鸡引起的体重减轻以及灭活苗抗体水平的下降。2、利用同源重组技术构建了表达REV env、gp90的不同重组MDV以REV SNV株DNA为模板,PCR扩增其env基因、gp90基因,克隆进真核表达载体pCAGGS;以其为模板,PCR扩增整个REV env基因真核表达盒、REV gp90基因真核表达盒并与卡那霉素抗性基因分别克隆进pUC18载体。以pUC18-env-kana为模板,利用含有MDV SC9-1株US10基因位点两侧同源臂的引物经PCR扩增REV env真核表达盒以及卡那霉素抗性基因;以pUC18-gp90-kana为模板,利用含有MDV SC9-1株US10基因位点两侧同源臂的引物经PCR扩增REV gp90真核表达盒以及卡那霉素抗性基因,利用同源重组插入SC9-1的US10位点;以pUC18-gp90-kana为模板,利用含有MDV SC9-1株meq基因位点两侧同源臂的引物经PCR扩增REV gp90真核表达盒以及卡那霉素抗性基因,利用同源重组插入SC9-1的meq位点。分别筛选出阳性后,最终利用阿拉伯糖诱导表达flp重组酶,敲除卡那霉素抗性基因,阳性重组质粒命名为SC9-gp90-2 BAC、SC9-env-3 BAC、SC9-gp90-4 BAC;分别提取SC9-gp90-2 BAC、SC9-env-3 BAC、SC9-gp90-4 BAC质粒,转染CEF细胞,拯救叁种种重组MDV,利用MDV单抗H19以及REV单抗11B118经间接免疫荧光试验鉴定阳性,命名为SC9-gp90-2、SC9-env-3、SC9-gp90-4。本研究为进一步构建表达REV env基因的重组MDV并评价其免疫保护效果奠定基础。结果表明,利用同源重组技术构建的重组MDV SC9-env、SC9-env-3能够稳定表达REV env蛋白,SC9-gp90-2、SC9-gp90-4能够稳定表达REV gp90蛋白。重组MDV SC9-env在CEF细胞上的复制水平与亲本病毒SC9-1相似。3、不同启动子的真核重组质粒pcDNA-env、pCAGGS-env、gB-env在CEF细胞上REV env表达效果的比较比较带有不同启动子的重组质粒pcDNA-env、pCAGGS-env、gB-env在细胞上表达效果。结果表明β-actin启动子活性强于cmv启动子,而且cmv启动子活性强于gB启动子活性。重组gp90蛋白免疫鸡可诱导鸡产生特异性抗体,未发现不良反应,说明重组亚单位疫苗对雏鸡和种鸡是安全可靠的。结果表明,gp90蛋白具有良好的抗原性,RE亚单位疫苗可以诱导高水平的抗体反应,对雏鸡和种鸡均具有良好的免疫效力。本研究构建能够表达禽网状内皮组织增生病病毒(Reticuloendotheliosis virus,REV)env基因或gp90基因的重组MDV并对其生物学活性进行研究。本研究以前期构建的血清I型MDV meq基因缺失株SC9-1为载体,利用同源重组技术将REV env、gp90基因插入SC9-1的基因组,构建重组MDV,SC9-1为载体能够稳定表达外源基因,构建的重组MDV SC9-env对SPF鸡没有致病性,本研究对SPF鸡感染MDV、REV均具有一定的免疫保护效果为其它重组MDV的构建提供思路,也为REV的免疫防控奠定基础。(本文来源于《山东农业大学》期刊2018-04-15）
孙鹏[4]（2016）在《马立克氏病毒SC9-2株生物学活性的比较研究及表达NDV-F基因重组病毒的构建》一文中研究指出马立克氏病(Marek's disease, MD)是鸡的一种高度接触性肿瘤病,其主要特征是淋巴组织增生和肿瘤的形成。马立克氏病病毒(Marek's disease virus, MDV)包括叁种血清型：血清1型(MDV-1)属于能引起肿瘤的MDV,血清2型(MDV-Ⅱ)属于天然不致瘤的MDV,火鸡疱疹病毒(HVT)属于血清3型(MDV-Ⅲ)。2001年,本实验室张志等从中国广西省某鸡场分离得到一株自然重组禽网状内皮组织增生症病毒(REV)长末端重复序列(LTR)的1型MDV野毒株GX0101。为了解GX0101的生物学活性,我们使用细菌人工染色体(BAC)技术构建了GX0101的BAC克隆BAC-GX0101,在BAC-GX0101的基础上,敲除两个致肿瘤的meq基因,同时诱导掉重组过程中插入的Kan+表达盒,得到了meq基因缺失株MDV GXO101△meq△Kan,即SC9-1株MDV。研究表明,SC9-1株不仅失去了1型MDV的致病性而且能够提供比商品化CVI988/Rispens疫苗更好的免疫保护效果。在SC9-1的基础之上,我们通过cre-loxp重组系统进一步敲除SC9-1中的BAC骨架得到SC9-2株MDV,本研究旨在比较不同代次SC9-2的生物学活性及以SC9-1为载体构建表达NDV-F基因的重组MDV。1.SC9-1中细菌人工染色体(BAC)序列自我敲除的分子鉴定为了对缺失meq基因的MDV SC9-1感染性克隆基因组中BAC的自我敲除进行分子鉴定。将含有表达cre重组酶真核表达盒的SC9-1重组质粒通过转染鸡胚成纤维细胞(CEF)拯救SC9-1重组病毒。将SC9-1重组病毒在CEF细胞上进行连续传代培养,利用病毒表达的cre重组酶在传代过程中逐步敲除病毒的BAC序列。分别提取1-10代不同代次SC9-1重组病毒的DNA作为模板,利用BAC序列特异性引物对病毒基因组中的BAC进行PCR检测。同时利用针对BAC序列gpt基因的特异性检测引物,以MDV保守基因pp38作为内参,对不同代次病毒基因组中BAC序列进行荧光定量PCR的检测。利用PCR扩增SC9-1病毒敲除BAC序列后基因组中残留loxp位点两端序列,通过测序分析进一步验证BAC序列的敲除。利用BAC序列特异性引物对不同代次病毒基因组中BAC序列的检测结果显示：1-5代的病毒DNA均能扩增出600 bp的特异性目的条带,证实病毒的基因组中含有BAC序列。6-10代病毒DNA均不能扩增出特异性目的条带,证实病毒的基因组中没有BAC序列。荧光定量PCR的结果显示,病毒基因组中的BAC序列随着病毒的传代逐渐减少,直至第6代已经完全检测不到BAC序列。在病毒BAC序列敲除的过程中,对每代病毒BAC序列敲除后残留loxp位点序列进行PCR测序鉴定,结果显示BAC序列敲除后基因组中仅留下一个loxp位点,序列同源性均在99.7%以上。结果表明,利用cre-loxp系统将病毒在CEF细胞上连续6代传代培养可将SC9-1中的BAC序列完全敲除掉,且同源重组酶敲除BAC序列具有高度的一致性。2.马立克氏病病毒疫苗株SC9-2在CEF细胞上的传代致弱及其免疫抑制作用和保护效果的评估MD是由α-疱疹病毒MDV引起的鸡的一种淋巴组织增生性疾病。之前的研究表明,敲除meq基因的超强MDV (w MDV)能够提供比商品化CVI988/Rispens更好的免疫保护,而且在鸭胚成纤维细胞(DEV)连续传40代后能够消除病毒在母源抗体阴性鸡中引起的免疫器官(胸腺和法氏囊)萎缩以及体重的减轻。本研究中,我们将meq基因敲除株SC9-2株MDV在鸡胚成纤维细胞(CEF)上连续传代。结果表明,接种40代SC9-2(SC9-2/40th)的SPF鸡的体重及胸腺和法氏囊相对于体重的指数要高于免疫10代SC9-2(SC9-2/10th)的SPF鸡,但都显着低于空白对照组。SC9-2/40th和809-2/10th对于禽流感(AIV)和新城疫(NDV)灭活苗产生的抗体水平差异不显着,但都低于空白对照组,而且存在显着差异。接种809-2/40th的SPF鸡在羽毛囊中的病毒载量要低于809-2/10th的病毒载量,但是免疫保护效果没有差异,同时免疫保护指数明显好于CVI988/RispenS。所有结果表明,SC9-2/40th的免疫抑制显着降低,但仍需要继续传代减弱免疫抑制。本研究为细胞传代致弱缺失meq基因的超强MDV提供了依据。3.表达NDV-F基因重组MDV的构建及其在鸡体内外的复制以敲除meq基因的MDV-I型弱毒SC9-1 (GX0101△meq△Kan)为载体构建一株表达外源基因NDV-F的重组病毒。将外源基因NDV-F的ORF插入到真核表达载体pcDNA3.1 (-)中,扩增含有CMV启动子的NDV-F表达盒,同时扩增筛选基因Kan+表达盒,将他们插入到载体pMD18-T中。用含有MDV-US2区50 bp同源臂的引物扩增串联表达盒,将产物电转进含有SC9-1的EL250宿主菌中,1%阿拉伯糖诱导掉阳性重组病毒基因组中的Kan+表达盒。挑选敲除Kan+表达盒的阳性克隆提取质粒,转染CEF细胞拯救重组病毒。将重组病毒腹腔注射鸡体,观察其在鸡体内的生长复制。成功拯救插入外源基因NDV-F的重组MDVrMDV-F,重组病毒在CEF细胞内能很好的复制表达且其在鸡体内也能很好的生长复制。以SC9-1为载体,结合Red E/T和FLP/FRT重组系统成功构建了表达外源基因NDV-F的重组病毒,为我们重组病毒的研究奠定了基础。(本文来源于《山东农业大学》期刊2016-04-28）
宿靖伟,滕蔓,罗俊,迟佳琦,余祖华[5]（2016）在《马立克病病毒与禽网状内皮增生病病毒的混合感染及在传代过程中的重组》一文中研究指出旨在了解国内鸡群马立克病病毒(MDV)和禽网状内皮增生病病毒(REV)的混合感染及自然重组状况,探讨两种病原的基因重组对MDV病原学特性的潜在影响及危害。利用PCR扩增、序列测定及间接免疫荧光试验(IFA),对来自河南商品蛋鸡群的17个MDV分离株进行研究。结果表明,其中两个毒株HNGS206和HNXZ103的病毒基因组中存在REV—LTR的重组插入。进一步的IFA结果显示,HNGS206和HNXZ103并非MDV与REV的自然重组流行毒株,这两个毒株基因组中LTR的插入发生于临床病例鸡混合感染后的病毒分离及传代培养过程中。结果提示,虽然目前国内鸡群中MDV和REV的混合感染较为普遍,但MDV与REV自然重组毒株的流行状况仍需要进一步的流行病学监测。(本文来源于《畜牧兽医学报》期刊2016年01期）
孙鹏,李思菲,张芙寿,苏帅,董宣[6]（2015）在《表达NDV-F基因重组马立克病病毒的构建及其在鸡体内外的复制》一文中研究指出以敲除meq基因的MDV-Ⅰ型弱毒GX0101△meq为载体构建一株表达外源基因NDV-F的重组病毒。将外源基因NDV-F的ORF插入到真核表达载体pcDNA3.1(-)中,扩增含有CMV启动子的NDV-F表达盒,同时扩增筛选基因Kan+表达盒,将他们插入到载体PMD18-T中。用含有MDV-US2区50bp同源臂的引物扩增串联表达盒,将产物电转进含有GX0101△meq的EL250宿主菌中,1%阿拉伯糖诱导掉阳性重组病毒基因组中的Kan+表达盒。挑选敲除Kan+表达盒的阳性克隆提取质粒,转染CEF细胞拯救重组病毒。将重组病毒腹腔注射鸡体,观察其在鸡体内的生长复制。成功拯救插入外源基因NDV-F的重组马立克病病毒rMDV-F,重组病毒在CEF细胞内能很好的复制表达且其在鸡体内也能很好的生长复制。以GX0101△meq为载体,结合Red E/T和FLP/FRT重组系统成功构建了表达外源基因NDV-F的重组病毒,为我们重组病毒的研究奠定了基础。(本文来源于《病毒学报》期刊2015年04期）
夏菁[7]（2015）在《表达禽呼肠孤病毒σB、σC蛋白的重组马立克氏病毒的构建》一文中研究指出禽呼肠孤病毒(Avian reovirus, ARV)感染可以引起的鸡和火鸡的以关节炎、键鞘炎、吸收障碍为特征的免疫抑制病。该病可导致鸡的死亡率增加、病鸡增重减少、饲料转化率下降、产蛋下降、孵化率/受精率降低,给养禽业带来巨大经济损失。国内外的研究表明目前使用的弱毒疫苗S1133仍可能具有一定的致病性,因此研制安全、有效的新型疫苗对ARV感染的防控具有重要意义。本研究采用RT-PCR扩增ARV GX/2010/1株的σB、σC基因,定向克隆至pEASY-M1表达载体中；再分别将σB、σC基因的表达盒与含有马立克氏病毒(MDV) CVI988疫苗毒株sorfl/sorf2序列pU/D载体相连,构建含σB、σC基因的转移载体质粒pU/D-aB和pU/D-aC。分别将pU/D-aB和pU/D-aC与含有GFP报告基因的MDV CVI988基因组DNA以磷酸钙沉淀法共转染CEF细胞,通过筛选、纯化获得重组病毒r-MDV-σB和r-MDV-aC。经PCR、Western blot和IFA分析,σB、σC基因分别正确插入到MDV CVI988毒株基因组中,并可以成功表达ARV σB蛋白和σC蛋白。本研究评价了1日龄SPF鸡接种重组病毒r-MDV-σB和r-MDV-aC后对ARV GX/2010/1株及MDV RB1B超强毒株的免疫保护效力。将70只1日龄SPF鸡随机分成5组：rMDV-σB免疫组、rMDV-aC免疫组、S1133疫苗免疫组、非免疫攻毒对照组和健康对照组,从发病率、死亡率、临床症状、病理组织学变化、对增重的影响和抗体水平等方面评价免疫效力。前两组的试验鸡1日龄时分别颈部皮下接种5000空斑形成单位(PFU)的r-MDV-aB和r-MDV-aC,第叁组于7日龄接种1羽份的S1133疫苗；21日龄时,前四组试验鸡均用104.0EID50/鸡的ARV GX/2010/1毒株攻击,攻毒第14天进行剖杀。结果显示rMDV-σB免疫组和rMDV-σC免疫组在ARV攻毒后的发病率分别为40%和26.7%与非免疫攻毒对照组发病率100%存在显着差异(p<0.05)；攻毒前后(21日龄～35日龄)各免疫组增重差异不显着(p>0.05),但S1133疫苗组和rMDV-σB免疫组增重小于rMDV-σC免疫组。经临床检查,攻毒后rMDV-σC免疫组的脾脏病变较S1133疫苗免疫组和rMDV-σB免疫组轻微。本研究还评价了r-MDV-σB和r-MDV-σC分别对MDV RB1B超强毒株攻击的免疫保护效果。将80只1日龄SPF鸡随机分为4个试验组：rMDV-σB免疫组、rMDV-σC免疫组、CVI988/Rispens免疫组和攻毒对照组,每组20只试验鸡；rMDV-σB免疫组、rMDV-aC免疫组和CVI988/Rispens免疫组的试验鸡分别于1日龄时颈部皮下接种5000 PFU/鸡的相应疫苗；7日龄时,所有试验鸡经腹腔接种500 PFU/鸡的MDV RB1B超强毒株。连续观察90天,记录各试验组鸡的发病和死亡情况。rMDV-aB免疫组和rMDV-aC免疫组对MDVRBlB强毒株攻击能够提供完全保护,与MDV CVI988/Rispens免疫组的效果相当。综上所述,本研究构建的重组病毒rMDV-aC是较理想的新型疫苗候选毒株。(本文来源于《扬州大学》期刊2015-06-01）
宗立伟[8]（2015）在《表达基因Ⅶ型新城疫病毒F或HN糖蛋白的重组马立克氏病毒构建及其免疫效力试验》一文中研究指出新城疫(Newcastle disease, ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)引起的一种高度接触性传染病,给世界养禽业带来巨大的经济损失。当前,Ⅶ型NDV是在中国、日本、韩国等地呈优势流行的基因型。由于常规NDV疫苗毒株与当前流行的NDV毒株分属于不同基因型,导致免疫鸡群仍然时常发生非典型新城疫,因此有必要研制与流行株基因型匹配的新型疫苗。本研究以马立克氏病病毒(Marek's disease virus, MDV) CVI988/Rispens疫苗毒株为载体,分别构建表达基因Ⅶ型NDV主要保护性抗原F和HN蛋白的重组病毒,并对这两株重组病毒的免疫保护效果进行评价,为基因Ⅶ型NDV的防控提供新型疫苗。为了使目的基因在重组MDV中高效表达,本研究首先对目的基因的启动子进行了筛选。分别构建含有Pec和CMV两个启动子的绿色荧光蛋白(GFP)重组质粒,转染DFl细胞,通过观测荧光强度以及western-blot试验来判定两个启动子的活性,结果显示CMV启动子的活性强于Pec启动子。采用RT-PCR扩增基因Ⅶ型NDV(DT-2014)的F和HN基因,并分别克隆入含有CMV启动子的pEASY TM-M1表达载体中,阳性质粒命名为pEASY-M1-F和pEASY-M1-HN。扩增F、HN基因的表达盒与本室构建的含有MDV CVI988/Rispens疫苗毒株sorfl/sorf2序列的pU/D质粒连接,得到的转移载体命名为pU/D-F、pU/D-HN。将转移载体pU/D-F和pU/D-HN分别与表达GFP的重组MDV (rMDV-GFP)的基因组共转染鸡胚成纤维细胞(CEF)。通过有限稀释的方法获得不含GFP的能稳定表达相对应F、HN基因的重组病毒昱rMDV-F和rMDV-HN。对获得的重组病毒rMDV-F和rMDV-HN进行聚合酶链式反应(PCR)、免疫印迹试验(Western- Blot)、间接免疫荧光试验(IFA)鉴定,确定新城疫病毒的F、HN基因在马立克病毒中插入正确,且能够稳定表达。本研究还评价了rMDV-F以及rMDV-HN两株重组病毒对基因Ⅶ型NDV强毒株DT-2014和MDV超强毒株RBIB的免疫保护效力。在重组病毒对NDV的免疫保护试验中,100只1日龄SPF鸡随机分成5组,依次为rMDV-F免疫组、rMDV-HN免疫组、弱毒疫苗免疫组、攻毒对照组以及空白对照组。前2组分别于1日龄颈部皮下接种5000噬斑形成单位(PFU)的rMDV-F或rMDV-HN重组病毒；弱毒疫苗组参照疫苗推荐剂量在7日龄滴鼻点眼免疫LaSota弱毒疫苗,21日龄时对除空白对照组外的其余4组用105EID50的DT-2014毒株攻毒,攻毒后连续观察7天,结果显示攻毒对照组的死亡率为100%,同各免疫组之间的差异极显着。重组病毒和弱毒疫苗均能在面临NDV攻击时对鸡群提供有效的保护,其中rMDV-F免疫组的保护率为85%,rMDV-HN免疫组的保护率为80%,弱毒疫苗免疫组的保护率为90%；针对各组免疫后抗体增长的检测结果显示两个重组病毒免疫组自免疫后抗体水平持续升高,LaSota弱毒疫苗于7日龄免疫,免疫一周后弱毒疫苗组抗体水平迅速增高。在重组病毒对MDV的免疫保护试验中,两个重组病毒对MDV RBIB强毒株的攻击都能够提供完全的保护,保护效力和CVI988/Rispens疫苗毒株相当。综上所述,本次试验成功构建了两株重组病毒rMDV-F和rMDV-HN,在面临新城疫强毒株攻击时对SPF鸡能够提供有效的保护,为ND的防制提供了新型疫苗。(本文来源于《扬州大学》期刊2015-06-01）
宿靖伟[9]（2015）在《2011-2014年河南省鸡群马立克氏病病毒流行株的分子进化及基因重组分析》一文中研究指出马立克氏病病毒(Marek’s disease virus,MDV)是少数感染自然宿主后,可诱发淋巴瘤的禽疱疹病毒之一,其感染引起的鸡马立克氏病(Marek’s disease,MD)也是最早可以用抗病毒疫苗来预防肿瘤发生的疾病。为了解鸡MDV流行毒株的分子特征,本研究对2012-2014年河南省发病鸡群的临床病料进行了采集,并对MDV 132 bp重复序列进行了PCR扩增,同时对meq、gE和gI基因进行了克隆和序列测定。结果表明,9份病料中均可扩增出与132bp双拷贝大小相符的PCR主产物;meq、gE和gI基因的核苷酸序列同源性与国内外参考毒株相比,分别为98.5%~100%、98.8%~100%和98.0%~100%;基于这些基因构建系统发生树的分析结果表明,与美国、澳大利亚、日本以及印度的MDV分离株相比,目前河南鸡群中流行的MDV与此前分离的河南流行株进化关系较近,并且与其他国内分离株共同形成一个较大的独立进化分支。除了MDV,禽网状内皮增生症病毒(Reticuloendotheliosis virus,REV)也是导致家禽免疫抑制性疾病和肿瘤病最重要的病原之一。由于MDV和REV具有相似的组织嗜性,常混合感染于同一鸡群,因此这两种病毒的共感染对家禽养殖业危害巨大。此前研究表明,MDV基因组中可人工或自然重组REV的部分基因组片段,如长末端重复序列(long terminal repeat,LTR),这种重组对MDV的病原学特性可能具有重要影响。为了解国内鸡群MDV和REV的共感染和自然重组状况,本研究对分离自河南商品蛋鸡群的17个MDV分离株进行了分析,结果发现其中HNGS206和HNXZ103的病毒基因组中存在REV-LTR的重组插入。进一步的研究表明这两个毒株不是MDV与REV自然重组的流行毒株,其基因组中LTR的插入可能发生于临床病例鸡共感染后的病毒分离培养过程中。本研究的结果提示河南鸡群中MDV和REV的共感染较为普遍,但MDV与REV自然重组毒株的流行状况仍需要进一步的流行病学监测。(本文来源于《河南农业大学》期刊2015-06-01）
张芙寿[10]（2015）在《表达H5N2亚型禽流感病毒HA抗原重组马立克氏病病毒的构建》一文中研究指出马立克氏病(Marek’s disease,MD)是鸡的一种高度接触性肿瘤病,以淋巴组织的增生和肿瘤的形成为特征。马立克氏病病毒(MDV)包括叁个血清型。所有能引起肿瘤的MDV病毒属于血清1型(MDV-1),天然不致瘤的MDV属于血清2型,火鸡疱疹病毒(HVT)属于血清3型。2001年,从中国广西某鸡场中分离得到一株1型MDV GX0101,其特点是:有禽网状内皮组织增生症病毒(REV)长末端重复序列(LTR)的插入。为了解REV长末端重复序列(LTR)的插入给GX0101带来的影响,在将该毒株构建成细菌人工染色体(BAC)克隆的基础上,将REV-LTR敲除构建成了重组病毒GX0101ΔLTR,通过动物证明,REV-LTR的插入导致了GX0101的水平传播能力的显着增强;在BAC—GX0101的基础上,进一步敲除两个致肿瘤基因Meq,得到的缺失株GX0101Δmeq,后期研究发现,该缺失株在失去对鸡群的致病性和免疫抑制的同时,还能对鸡群起到很好的保护作用,其保护效果要超出现有CVI988疫苗。本研究以GX0101ΔMeq作为载体表达H5N2禽流感病毒的HA基因,成功构建了一株重组病毒。1.抗H5N2-HA鼠多克隆抗体的制备及H5N2-HA真核表达载体的构建为了验证以GX0101ΔMeq为载体构建的表达H5N2-HA的重组病毒中的HA基因在体外能否正常表达,首先需要制备抗H5N2禽流感HA的鼠多克隆抗体。HA基因,先从NCBI上获取H5N2禽流感JX534549株的HA基因全序列,再由生工生物工程(上海)有限公司合成。将其分成两段分别插入到PET-32a原核表达系统,构建了能够分段表达HA蛋白的原核表达质粒,将两个质粒导入到BL21菌株。通过诱导表达发现,只有一段HA蛋白能够大量表达,而另一段没有表达,我们用大量表达的该段的HA蛋白作为抗原免疫小鼠,叁免后采集鼠的血清,为了检测该血清能否作为针对HA蛋白的多克隆抗体,我们以此血清作为一抗,通过IFA检测,经禽流感JX534549株的HA基因的感染性克隆转染的CEF细胞中的HA蛋白,IFA结果显示100倍稀释的该鼠的血清能够检测到细胞中HA蛋白的存在。结果可证明:在本研究中,鼠的血清可以作为多克隆抗体检测HA蛋白的存在,并可在后续研究中用于检测重组MDV中HA基因的表达。构建表达H5N2-HA的重组病毒,首先我们需要构建能够在真核系统中表达HA基因的真核表达质粒。将HA—ORF完整的克隆进真核表达载体pc DNA3.1(-)中,并将该重组质粒转染CEF细胞。以制备的HA多克隆抗体作为一抗,通过IFA验证,真核表达质粒中的HA基因能够成功表达。这些证明,本研究中构建的真核表达质粒能够成功表达HA基因,可以用于进一步的研究。2.以GX0101ΔMeq为载体,应用RedE/T重组系统和Flp/FRT重组系统构建一株表达H5N2-HA基因的重组病毒r GX-CMV-HA第一步:在HA基因表达盒前引入Kanr抗性筛选基因,以后电转进大肠杆菌EL250中,在重组系统Red E/T的作用下,这段带有Kanr抗性筛选基因的HA表达盒就作为外源插入片段整合到载体GX0101ΔMeq上;第二步:在L-阿拉伯糖的诱导下,利用重组系统Flp/FRT将Kanr从重组质粒中敲除掉。通过验证,从含有完全敲除了Kanr抗性筛选基因的重组质粒pr GX-CMV-HA的EL250大肠杆菌中提取质粒,转染CEF细胞,通过IFA验证重组病毒中HA基因的表达。结果表明,通过以上两步重组方法,成功获得了重组病毒r GX-CMV-HA,并且IFA验证表明HA基因能在重组病毒中成功表达。(本文来源于《山东农业大学》期刊2015-04-28）
重组马立克病毒论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
旨在构建能够表达禽网状内皮组织增生病病毒(reticuloendotheliosis virus,REV)env基因的重组马立克病毒(Marek′s disease virus,MDV),并对其生物学特性进行初步研究。以REV SNV株DNA为模板,PCR扩增其env基因,克隆进真核表达载体pcDNA3.1(+);以其为模板,PCR扩增整个REVenv基因真核表达盒并与卡那霉素抗性基因分别克隆进pUC18载体;以其为模板,利用含有MDV SC9-1株meq基因位点两侧同源臂的引物经PCR扩增REVenv真核表达盒以及卡那霉素抗性基因,利用Red E/T同源重组技术插入SC9-1的meq位点,最终利用阿拉伯糖诱导表达flp重组酶,敲除卡那霉素抗性基因,阳性重组质粒命名为SC9-env BAC。提取SC9-env BAC质粒转染CEF细胞,拯救重组MDV,利用MDV单抗H19以及REV单抗11B118经间接免疫荧光试验鉴定阳性病毒,命名为SC9-env。分析比较SC9-env在CEF细胞上的复制水平,利用动物试验初步评价SC9-env对SPF鸡的致病性以及SC9-env对SPF鸡感染MDV、REV的免疫保护效果。结果表明,利用同源重组技术构建的重组MDV SC9-env能够稳定表达REV env蛋白,且复制水平与亲本病毒SC9-1相似;该重组毒接种SPF鸡没有明显的致病性,且对rMd5的强毒攻击提供92%的免疫保护,与SC9-1差异不显着;SC9-env显着降低REV感染SPF鸡所引起的体重减轻以及灭活苗抗体下降。构建的表达REVenv的重组MDV对感染MDV、REV的SPF鸡具有良好的免疫保护效果。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
重组马立克病毒论文参考文献
[1].李凯.表达鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因的重组马立克氏病病毒活载体疫苗研究[D].中国农业科学院.2018
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[3].周忠文.表达REVenv基因的重组马立克病毒的构建及生物学活性研究[D].山东农业大学.2018
[4].孙鹏.马立克氏病毒SC9-2株生物学活性的比较研究及表达NDV-F基因重组病毒的构建[D].山东农业大学.2016
[5].宿靖伟,滕蔓,罗俊,迟佳琦,余祖华.马立克病病毒与禽网状内皮增生病病毒的混合感染及在传代过程中的重组[J].畜牧兽医学报.2016
[6].孙鹏,李思菲,张芙寿,苏帅,董宣.表达NDV-F基因重组马立克病病毒的构建及其在鸡体内外的复制[J].病毒学报.2015
[7].夏菁.表达禽呼肠孤病毒σB、σC蛋白的重组马立克氏病毒的构建[D].扬州大学.2015
[8].宗立伟.表达基因Ⅶ型新城疫病毒F或HN糖蛋白的重组马立克氏病毒构建及其免疫效力试验[D].扬州大学.2015
[9].宿靖伟.2011-2014年河南省鸡群马立克氏病病毒流行株的分子进化及基因重组分析[D].河南农业大学.2015
[10].张芙寿.表达H5N2亚型禽流感病毒HA抗原重组马立克氏病病毒的构建[D].山东农业大学.2015