导读:本文包含了硫矿硫化叶菌论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:小热激蛋白,分子开关,二聚体界面,酸压力
硫矿硫化叶菌论文文献综述
刘亮[1]（2015）在《硫矿硫化叶菌Hsp14.1和Hsp20.1的结构和分子伴侣活性调控机制研究》一文中研究指出小热激蛋白是分子伴侣中的超级家族,几乎存在于所有生物体和多个细胞组织中。在压力条件下,小热激蛋白能够结合并抑制变性客户蛋白的聚集和沉淀而发挥重要的作用。生物体在缺失小热激蛋白的分子伴侣功能后会对环境压力如热,低氧,酸或碱等变得敏感。人源中的小热激蛋白的功能缺失会导致自身免疫性疾病,神经变性紊乱,白内障等多重疾病的发生。但是关于小热激蛋白在压力条件下与客户蛋白的相互作用机制以及使细胞耐受压力的机制,我们知之甚少。越来越多的研究表明大约由25个氨基酸组成的N末端对小热激蛋白与底物的结合非常关键,但是具体的底物的结合机制以及相关的分子伴侣活性调节机制仍然没有研究透彻。关于N末端怎么能够适应大小,形状,表面疏水和带电性等各异的不同种类的变性客户蛋白一直难以解释清楚。由于变性的客户蛋白是多相的且没有确定的叁维结构,很难直接研究小热激蛋白与客户蛋白的复合物结构,因此,到目前为止,也还没有获得过N末端清晰可见且处于活性状态的小热激蛋白的叁维结构。本论文以硫矿硫化叶菌(Sulfolobus solfatataricus P2)来源的小热激蛋白HSP14.1为研究对象,以结构研究为基础,并结合体内体外功能实验,验证分析N末端的构象变化以适配非活性客户蛋白的分子机制。我们解析了Hsp14.1的野生型以及突变体A102D和Del-C4的叁维结构,叁个结构都有完整而清晰的N末端,但是N末端的构象却有很大的差异。野生型的N末端呈现为直的螺旋,但是突变体的N末端螺旋却发生了严重的扭结与破坏。扭结与破坏的螺旋形成了一个疏水口袋似乎能够识别未折迭的客户蛋白。随后,功能上的突变研究表明对这个疏水口袋的关键氨基酸突变会影响宿主菌在热压力下的存活率。通过结构对比分析,发现直的N末端螺旋不能形成疏水口袋。野生型和突变体的N末端的结构差异表明N末端存在一个分子开关能够使Hsp14.1从静息状态转变到活性状态。同样的机制可能应用到同家族的其它小热激蛋白中。基于结构数据,普遍认为依靠β6链存在与否的二聚化模式可以区分后生动物和非后生动物的小热激蛋白。本研究中解析的硫矿硫化叶菌Hsp20.1 ACD二聚体结构却展示了一个完全不同的二聚体界面。我们发现,虽然没有β6链,Hsp20.1 ACD二聚体既没有像后生动物的小热激蛋白那样依靠β7链形成二聚体界面,也没有解聚成单体。这与所有已报道的小热激蛋白的结构不同。Hsp20.1 ACD二聚体结构揭示了一个可变的,高度极性的二聚体界面,有利于快速地进行亚基交换和底物识别。有趣的是,我们发现Hsp20.1的C末端突变体尽管不能形成多聚体结构,但仍然具有分子伴侣活性。进一步的突变研究表明N末端对Hsp20.1多聚体和二聚体的底物结合很关键。另外,有大量研究表明小热激蛋白在热压力下能够通过抑制聚集来保护细胞,但是关于酸压力下小热激蛋白对细胞的保护功能却不见报道。在本研究中,我们发现Hsp20.1和Hsp14.1多聚体在低p H条件下能够发生解离,甚至呈现二聚体和单体,仍然有分子伴侣活性。而它们在50°C条件下却没有显着的四级结构改变,但也有抑制底物聚集的能力。这些结果表明小热激蛋白在不同的压力条件下可能有不同的发挥功能的模式。(本文来源于《华南理工大学》期刊2015-04-15）
吴玉飞,钱磊,张帆,陈晟,吴敬[2]（2012）在《重组大肠杆菌生产硫磺矿硫化叶菌β-半乳糖苷酶发酵条件初步研究》一文中研究指出为了实现来源于S.solfataricus的β-半乳糖苷酶的高效表达,对E.coli BL21(DE3)/pT7-7-lacS基因工程菌的发酵培养基进行优化,获得最优的发酵培养基为:甘油浓度为10 g/L,蛋白胨浓度为18 g/L,酵母膏浓度为18g/L,磷酸盐浓度为15 mmol/L,Mg~(2+)离子浓度为5 mmol/L,乳糖诱导浓度为5 g/L。在优化条件下,β-半乳糖苷酶的酶活由初始的43.0 U/mL提高到83.4 U/mL。在此基础上,在3 L发酵罐上进行了初步放大,于DD_(600) 50时开始流加乳糖诱导,最终酶活达172.4U/mL,为摇瓶水平的2倍,为β-半乳糖苷酶的工业化生产奠定基础。(本文来源于《工业微生物》期刊2012年06期）
胡咏梅[3]（2012）在《硫磺矿硫化叶菌Sso0660和Sso0661基因的表达与功能研究》一文中研究指出硫化叶菌是古菌遗传学、生理和生化研究的模式生物。在硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobu)solfataricusP2菌株的基因组中,推测至少有37个基因编码假定的蛋白酶、蛋白酶亚基或肽酶。然而迄今为止,仅有6个蛋白酶或肽酶(包括Sso2045、Sso2154和CPSso等)得以被鉴定和进行了酶学性质分析,其余的假定蛋白酶都没有被解析。例如,Sso0660和Sso0661在S.solfataricus P2基因组的数据库中被预测编码锌依赖的蛋白酶,因为与细菌中的TldD和TldE(PmbA)序列相似而被分别注解为TldD和TldE同源类似物。虽然体内的遗传学实验证据支持Escherichia coli的TldD和TldE具有蛋白酶活性的假说,并预测这两个蛋白可能形成蛋白酶复合物行使功能,但缺乏明确的生物化学证据;而对Thermotoga maritima中TldE(PmbA)的晶体结构分析后,并没有在其中发现金属的结合位点或任何水解酶结构域,TldE是否具有蛋白酶活性由此产生争议。在目前的文献中还没有TldD和TldE生化性质的相关报道,TldD和TldE具有怎样的生理功能还不明确。为此,本文围绕S.solfataricus P2中的Sso0660和Sso0661基因的表达和功能进行了研究,获得了以下几个方面的结果:1.通过构建 pSeSD-0660、pSeSD-0661、pET30a-0660 和 pET30a-0661 等表达载体,实现了Ss 0o60和Sso0661基因的同源与异源表达。同源表达的Sso0660和Sso0661产物可溶,而异源表达的Sso0660和Sso0661大多以包涵体的形式存在。通过凝胶过滤、质谱分析结合点突变,确定了 Sso0660单体的分子量为49851 Da,两个单体首先通过C416处的分子链间二硫键形成二聚体,在此基础上再形成36聚体;同源超表达的重组Sso0661为单体,分子量为47346 Da。2.从生化角度证实了 Sso0660和Sso0661具有蛋白酶活性。包涵体经过变性、复性可获得有活性的重组Sso0660和Sso0661蛋白酶,与可溶性的重组酶一样,可分解蛋白酶的通用底物FTC-BSA、azocasein和gelatin,最适作用pH是7。同源和异源超表达的重组Sso0660最适的作用温度分别为75℃和55℃,重组Sso0661最适的作用温度是65℃。Sso0660和Sso0661对金属蛋白酶的抑制剂EDTA和o-phenanthroline最为敏感,说明均为金属蛋白酶。火焰法原子吸收结果表明,每摩尔Sso0660分子含有1摩尔锌,而Sso0661并不含锌。多序列比对结果显示TldD和TldE拥有共同保守的"DDEG"模序,TldD则独有"HExxxH"模序以及位于C端的半胱氨酸残基。点突变结果表明,"HExxxH"和"DDEG"模序与Sso0660的锌结合有关,D278E改变切割位点,可能为活性性中心。3.揭示了古菌Sso0660同源超表达与硫化叶菌程序性死亡(PCD)之间可能存在的相关性。因为Sso0660超表达后,细胞出现基因组DNA降解、胞内caspase-like活性增高、细胞不易被培养和生长严重滞后现象,显示出古菌TldD超家族成员调控古菌程序性死亡(PCD)的重要性。Sso0660蛋白对caspase的通用抑制剂Z-VAD-fmk敏感,能与抗人caspase-8的抗体杂交,并展现caspase-8-like的活性,说明Sso0660具有caspase8-like的免疫活性和生理活性,为古菌中的死亡蛋白酶,在古菌PCD中行使重要功能。这是首次在古菌域中鉴定具有caspase-like活性的蛋白的报道。4.构建了 pSeSD-0660/0661的共表达载体,采用共纯化和免疫共沉淀技术发现Sso0660和Sso0661形成了复合体。进一步推测TldD与TldE在体内可能存在相互制约的关系,但具体作用机制尚待深入的研究。(本文来源于《华中农业大学》期刊2012-11-01）
李东哲[4]（2011）在《硫磺矿硫化叶菌（Sulfolobus sulfataricus p2）小热激蛋白（HSP20）分子生物学特征和功能》一文中研究指出古菌常发现生活于各种极端自然环境下,如大洋底部的高压热溢口、热泉、盐碱湖、厌氧环境等。古菌其古老的进化地位、奇特的生活习性和与此相关的潜在生物技术开发前景,长期以来一直吸引着许多人的注意。比较于其他古菌,作为研究泉古菌的模式菌,硫磺矿硫化叶菌赋予它迷人的科研价值。研究小热激蛋白(sHSP)与古菌对环境的适应性和耐受性之间的关系,有利于揭示古菌适应极端环境的分子机理。本论文运用分子生物学技术较全面地研究了S.so-HSP20的生物学功能。运用实时定量PCR从mRNA水平分析了S.so-HSP20在不同生长温度、冷激处理下的表达特征。结果表明,S. so-HSP20mRNA在上述情况下都可以表达,但是当温度偏离菌体最适生长温度(75℃)或冷激处理(40C)后,S.so-HSP20mRNA的表达量会提高,在60℃和80℃时达到最大。表明S.so-HSP20的表达与温度相关,当偏离最适生长温度时S. so-HSP20mRNA表达上调以帮助体内蛋白质正确折迭。为了研究S.so-HSP20的功能,成功地构建了E. coli(pET-28a-S. so-HSP20)活性检测系统,S. so-HSP20在50℃热胁迫60min能够提高胁迫后细胞的生存率35%,在4℃寒胁迫3天后提高胁迫后细胞的生存率7.6%。这些结果表明S.so-HSP20对细胞受到热、寒损伤后起到重要的保护作用。本研究对纯化的S. so-HSP20蛋白质进行了一系列体外活性分析。通过柠檬酸合成酶和胰岛素B链混浊度实验,43℃、45℃S.so-HSP20对热引发的柠檬酸合成酶(CS)聚集的抑制作用,40℃S. so-HSP20对热引发的胰岛素B链聚集的抑制作用。结果表明S.so-HSP20具有分子伴侣活性,它活性在不同物种中发挥相似的功能。所有体外和体内的分析显示,S.so-HSP20能帮助硫磺矿硫化叶菌抵抗不适环境的变化。研究硫磺矿硫化叶菌的小热激蛋白(sHSP)有助于认识古菌的基本蛋白质折迭过程及其热适应性基础,为生命的起源和进化提供更多的信息。(本文来源于《浙江大学》期刊2011-04-01）
闻真珍[5]（2010）在《硫矿硫化叶菌小热激蛋白SsHSP14.1的功能特性研究》一文中研究指出小热激蛋白(small heat shock proteins, sHSP)广泛分布于自然界生物体内。大量研究证明,小热激蛋白具有提高细胞耐热性,并能抑制蛋白变性、促进蛋白重折迭的功能。嗜热微生物来源的小热激蛋白更是由于其具有耐高热的特性而备受关注。但是由于小热激蛋白具有多态性,对其结构研究还不够充分,其作用机制更是不甚了解。因此,对小热激蛋白的深入研究,不仅具有重要的科学价值,同时也能为其应用奠定坚实基础。本论文首次对硫矿硫化叶菌来源的小热激蛋白SsHSP14.1进行克隆、表达与纯化,并对其功能与机制进行了研究。具体内容如下:SsHSP14.1蛋白的克隆、表达与纯化:以硫矿硫化叶菌的基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到了SsHSP14.1的编码基因,与表达载体pET28a连接后成功构建了SsHSP14.1的表达质粒。将该表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)后,筛选获得高SsHSP14.1蛋白表达的菌株。大肠杆菌蛋白表达优化条件为:接种量5%, IPTG浓度1mM,最佳诱导温度为25℃,诱导时间6h。优化的蛋白纯化过程为:细胞破碎-镍柱亲和层析(300mM咪唑洗脱目标蛋白)-3C蛋白酶酶切-Q柱去除3C蛋白酶(pH8.0收穿透)-Q柱分离目标蛋白(pH9.0, 0.2MNaCl洗脱目标蛋白),最终得到的蛋白纯度为92%,比菌体粗提液中蛋白纯度提高了两倍,纯化后蛋白得率为27.62%。SsHSP14.1的蛋白功能特性研究:1)研究确定了SsHSP14.1能够提高大肠杆菌耐热性。研究了表达和不表达SsHSP14.1蛋白的大肠杆菌,比较了两者在高温下的存活率,大肠杆菌经50℃热激处理1h后,表达SsHSP14.1的大肠杆菌存活率为31.2%,显着高于不表达SsHSP14.1的大肠杆菌存活率(19.9%);2)研究确定了SsHSP14.1具有抗热凝集特性。大肠杆菌在80℃条件下处理2h后,加入SsHSP14.1可使46.8%的大肠杆菌蛋白保持在可溶性状态,而不加入SsHSP14.1的对照组,90%的大肠杆菌蛋白都已聚集沉淀;当以CALB为底物时,酶液在50℃条件下处理20min后,SsHSP14.1的加入可使可溶性蛋白的含量提高到原来的2倍。3)研究了SsHSP14.1对提高酶热稳定性的影响。菠萝蛋白酶在60℃条件下温育40min后均失活,而加入SsHSP14.1后,能保留40%的酶活,加热1h后仍有30%的酶活。EcoRI在60℃下温育20min后完全失活,加入SsHSP14.1后,温育40min后酶才完全失活。4)研究了ATP依赖性、聚合特性、热稳定性等特性。结果证明SsHSP14.1提高EcoRI热稳定性的功能不需要ATP的参与; SsHSP14.1以大的多聚体(360kD)形式存在,多聚体的大小与盐浓度等有关;SsHSP14.1具有极强的热稳定性,在100℃中加热15min后,仍保持其分子伴侣活性。SsHSP14.1作用机制的研究:通过同源建模,得到SsHSP14.1的二聚体结构模型,在该模型的基础上,对蛋白的关键氨基酸位点(L109、E33、K75、K75-Q79)进行突变,克隆、表达与纯化相应蛋白突变体,对突变体蛋白(L109D、K75E、E33K/K75E、DEL75-79)的结构和功能进行了分析,并与原始蛋白功能特性进行比较。结果表明,1)L109、K75、E33是决定蛋白结构与功能的关键位点。突变蛋白L109D和K75E都以单体存在,并且不具有分子伴侣活性。而K75E/E33K与SsHSP14.1都形成大的聚合物,并具有相似的功能;2) L5-7结构域对于小热激蛋白提高酶耐热性的功能具有重要作用。L5-7结构域缺失后,突变蛋白DEL75-79的聚合状态变化甚微,仍具有与SsHSP14.1相似的抗凝集特性,但失去了提高EcoRI和菠萝蛋白酶热稳定性的保护功能。ANS荧光探针检测实验证明,DEL75-79的表面疏水性降低,减弱了其与底物结合的能力,这进一步说明其功能的改变与结构相关。(本文来源于《华南理工大学》期刊2010-12-19）
徐迅[6]（2010）在《嗜热古菌硫矿硫化叶菌中小热激蛋白基因的克隆、表达和性质研究》一文中研究指出小分子量热激蛋白广泛存在于古细菌和真核生物细胞中,它们能够在体内外促进蛋白质多肽链的正确折迭,有效地抑制变性蛋白质的聚集,具有重要的作用。硫矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)是一种典型的泉古菌门硫化叶菌属嗜热古菌,具有良好的耐高温性能,虽然其基因组序列已经测定并发表,SsHsp14.1的全序列已经可以在Genbank数据库中得到,但是,关于该基因的功能的描述还是模糊的,关于这个sHsp的研究在国际上未见报道,本实验室首次克隆表达了该菌的sHsp基因,并进行了性质研究。本研究将SsHsp14.1基因克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,构建了重组融合表达质粒pSEPHLK1,转化至E.coli BL21(DE3)中,用IPTG诱导,优化表达条件,并分离纯化了重组融合蛋白。结果表明:首次成功利用大肠杆菌表达体系表达出SsHsp14.1蛋白,表达的蛋白分子量约17kDa。优化出的表达条件:1.0mM IPTG、37oC诱导8h后,表达的目的蛋白大部分可溶。利用重组蛋白N-末端的组氨酸标签,通过Ni2+柱亲和层析和SephadexG50凝胶层析纯化后,最终我们获得了纯度达90%以上的重组目的蛋白蛋白性质研究表明,体内表达重组SsHsp14.1可以提高大肠杆菌菌体内蛋白的热稳定性,阻止了部分蛋白遇热聚集沉降,进而提高大肠杆菌菌体的耐热性。也许改善了细胞膜的稳定性,从而增加了细菌细胞的活力;重组SsHsp14.1在体外具有分子伴侣活性,不仅体现在对胰岛素B链在DTT还原时的聚集的抑制,而且在60°C下阻止了这种CALB(Candida antarctica lipase B)酶蛋白的受热变性后的聚集沉降,也表明了这种sHsp可以单独对加热下有聚集沉降倾向的蛋白提供保护而不需要辅助蛋白;重组目的蛋白可以提高部分酶的热稳定性,我们选择的是菠萝蛋白酶和限制性内切酶EcoR I作为作用底物,也说明了目的蛋白作用底物的多样性。另外,重组SsHsp14.1本身具有很好的热稳定性,不仅在80°C下4h后仍处在可溶状态,而且纯化后的该蛋白还具有体外的分子伴侣活性,即阻止其他蛋白的遇热变性沉淀。这一特性也许和硫矿硫化叶菌这一嗜热古菌的耐高温性有关,而且启发了对该蛋白纯化的简化思路。一系列的性质研究为进一步了解嗜热古菌sHsp的作用特点和机制奠定了良好的基础。(本文来源于《华南理工大学》期刊2010-05-01）
吕新萍[7]（2009）在《硫矿硫化叶菌P2分子伴侣的ATPase活性对其功能影响》一文中研究指出Ⅱ型分子伴侣广泛存在于古细菌和真核生物胞液中,他们能够在体内外促进蛋白质多肽链的正确折迭,有效地抑制变性蛋白质的聚集,具有重要作用。硫矿硫化叶菌(Sulfolobus solfatariCUS)P2是一种典型的泉古菌门硫化叶菌属嗜热古菌,具有良好的耐高温性能,但其分子伴侣研究在国际上未见报道,本实验室首次报道克隆表达了该菌分子伴侣基因并证实了其分子伴侣是由不同的亚基组成的8元旋转对称双环结构,具有分子伴侣功能功能,发现该分子伴侣具有明显ATPase活性。但ATP对古菌P2分子伴侣功能影响至今未见任何报道。本研究以硫矿硫化叶菌P2β分子伴侣为研究对象,通过与其他Ⅱ型分子伴侣序列的保守性比对及空间结构寻找与ATPase活性有关的位点,利用重迭延伸PCR技术成功构建P2分子伴侣基因定点突变,将该分子伴侣的Asp104突变成Arg104,Ala418突变为Thr,并将这个突变基因在大肠杆菌BL21(DE3)中实现了高效表达,获得ATPase活性变化的分子伴侣突变体。在此基础上,对突变分子伴侣蛋白的性质与功能进行进一步的研究。硫矿硫化叶菌P2分子伴侣突变表达工程菌,经IPTG诱导表达后,所收集的菌体用超声波破碎。破碎后的上清经75℃高温处理30min去除大量杂蛋白,再经80%饱和度的(NH4)2SO4盐析以及Resouce Q离子柱层析纯化后,得到了突变分子伴侣的单体。纯化后的分子伴侣单体,在ATP和Mg2+存在的条件下经过5h可聚合成典型的双层面包圈结构的分子伴侣八聚体。利用孔雀石绿方法,在不同温度下对两个突变体进行分子伴侣ATPase测定,结果表明一个突变体ATPase活性丧失,另一个ATPase活性增加,可见我们设计的基因突变位点确实与ATPase活性有关。以绿色荧光蛋白(GFP)为研究对象,分析P2分子伴侣野生型及突变型对酸变性蛋白重新折迭的促进作用,结果发现该分子伴侣ATPase活性增加的突变体对外源GFP的复性与野生型相比具有更为明显的促进作用,而ATPase活性丧失的突变体则不能促进GFP的折迭。以柠檬酸合酶为研究对象,分析该P2分子伴侣对外源蛋白热聚集的影响,结果发现该分子伴侣防止外源蛋白聚集的作用与ATPase有关。本研究表明:硫矿硫化叶菌P2分子伴侣104位的天冬氨酸和418位的丙氨酸是影响该型古菌分子伴侣对ATP结合和水解能力的关键位点,它们的突变可以引起ATPase活性的变化。在失去ATPase活性后,P2分子伴侣同时也失去了介导变性荧光蛋白GFP重新折迭复性的能力;同时也不再具有提高柠檬酸合酶抗热聚集的能力。而ATPase活性增加的分子伴侣突变体可以更好的促进变性蛋白的复性和防止蛋白的热聚集,足以说明古菌P2β分子伴侣在行使分子伴侣功能时需要ATP水解提供能量,为进一步研究Ⅱ型分子伴侣的作用过程和机制奠定了良好的基础。(本文来源于《山东大学》期刊2009-05-05）
褚鑫,王丽,何永志,董志扬[8]（2008）在《硫矿硫化叶菌P2分子伴侣基因的克隆表达及其性质》一文中研究指出【目的】研究重组表达的硫矿硫化叶菌P2分子伴侣β亚基体外同源聚合体的结构和生化功能。【方法】利用PCR技术从硫矿硫化叶菌P2的基因组DNA中克隆得到分子伴侣β亚基的基因,将该基因克隆到表达载体pET-21a(+)上并在大肠杆菌BL21(DE3)中实现了表达。对纯化后的β亚基单体进行体外聚合,利用透射电镜观察β分子伴侣的结构,并对其促蛋白折迭性质进行了研究。【结果】硫矿硫化叶菌P2分子伴侣β亚基基因在大肠杆菌BL21中实现了高效表达,纯化后的分子伴侣β亚基单体在ATP和Mg2+存在的条件下可自组装形成分子伴侣聚合体。透射电镜观察表明:该β分子伴侣具有Ⅱ型分子伴侣典型的双层面包圈结构,每个环由8个亚基构成。该β分子伴侣具有ATPase活性,最适反应温度为80℃;它不仅能够促进变性的绿色荧光蛋白(GFP)重新折迭,而且还能有效的提高木聚糖酶的热稳定性。【结论】本文根据P2基因组序列分析预测的分子伴侣基因设计引物,克隆表达了硫矿硫化叶菌P2分子伴侣的β亚基,纯化后对其进行体外聚合,透射电镜观察表明该聚合体具有Ⅱ型分子伴侣的经典结构,功能分析表明该β分子伴侣能够在体外促进异源蛋白质的折叠、提高其它酶分子的热稳定性。这为进一步深入研究嗜热古菌耐热抗逆的分子机制,奠定了良好的基础。(本文来源于《微生物学报》期刊2008年10期）
蒋培霞[9]（2007）在《硫磺矿硫化叶菌Orc1/Cdc6蛋白在DNA复制起始中的调控功能研究》一文中研究指出DNA复制是生命现象最本质的内容,是由众多蛋白共同参与的能确保遗传信息精确及时传递的复杂的生物学过程。古菌是一类区别于真核生物与真细菌的第叁域生命形式,最近的研究表明它们的DNA复制系统与真核生物类似,而且更为简单。因此,对古菌DNA复制的研究能够为最终阐明高等真核生物复杂的DNA复制机制提供重要线索。Cdc6和MCM是与真核生物DNA复制起始有关的两种蛋白。已经报道极端嗜热古菌硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)的环状染色体含有叁个活性复制原点,其基因组编码叁个Orcl/Cdc6同源蛋白(SsoCdc6-1、-2和-3)和一个MCM复制性解旋酶同源蛋白(SsoMCM)。尽管硫化叶菌有巨大潜力作为一种模式菌株来研究真核生物的重要复制机制,但目前有关古菌和真核生物复制起始蛋白如何介导原点DNA的解链以及复制起始复合物形成等有关的分子细节还很不清楚。本研究依据硫磺矿硫化叶菌两个复制原点oriC1和oriC2的结构特征,设计了叁组分别具有平端和分叉结构的特异性DNA底物,通过EMSA、细菌双杂交以及Pull-down/western blot等试验,对S.solfataricus叁个Orc1/Cdc6同源物之间以及它们与MCM、polB1和SSB之间的物理和功能相互作用进行了系统的研究,主要取得了的以下四个方面的研究结果:1.叁个SsoCdc6差异性结合原点特异性DNA分子:SsoCdc6-1和-3不仅以结构特异性而且以序列特异性方式结合原点DNA底物。SsoCdc6-1对oriC1起源的DNA底物有较高的结合活性,对其平端底物的结合能力略高于分叉底物。SsoCdc6-3对oriC2起源的两种结构的DNA底物都有较高的结合活性,低浓度下结合分叉底物的能力高于平端底物,高浓度下没有明显的差异。而SsoCdc6-2对于叁组DNA底物的结合活性没有表现出明显的序列特异性,但总体对平端底物的结合能力低于分叉结构DNA。另外,利用EMSA实验分析我们发现叁个SsoCdc6 C-末端WH结构域缺失的突变体在体外也能结合原点特异性DNA底物,但是比全长的蛋白结合能力明显减弱。我们推测不仅SsoCdc6 C-端WH结构域,N-端结构域和DNA序列也会影响它们结合DNA的能力。2.叁个SsoCdc6可以通过其N-端催化结构域发生物理和功能相互作用并且这种相互作用对它们的原点DNA结合活性有调控作用:细菌双杂交和Pull-down/westernblot实验表明叁个SsoCdc6之间可以通过其N-端结构域相互作用;EMSA试验表明SsoCdc6-1刺激SsoCdc6-3原点DNA结合活性,而且叁者可能形成较大的SsoCdc6-1/SsoCdc6-3/DNA复合物。相反SsoCdc6-3和SsoCdc6-1都分别抑制SsoCdc6-2的DNA结合活性,而且SsoCdc6-1能和SsoCdc6-2相互作用形成大的SsoCdc6-1/SsoCdc6-2/DNA复合物。这些结果表明这些复制起始蛋白可能在功能上相互作用并调控彼此在原点上的集结,作为预复制复合体(Pre-RC)的组件共同发挥作用来调控DNA复制的起始。3.叁个SsoCdc6通过不同的结构域和SsoMCM相互作用,并且这些相互作用在调控SsoMCM募集到原点DNA过程中起着重要的作用:细菌双杂交和Pull-down/western blot以及EMSA实验表明SsoCdc6-2通过其C-端结构域和SsoMCM相互作用,并促进SsoMCM加载到原点DNA上。相反,SsoCdc6-1和-3通过其N-端结构域和MCM相互作用,并抑制SsoMCM和原点DNA的结合。虽然叁个SsoCdc6蛋白都可以和SsoMCM解旋酶相互作用,相对SsoCdc6-1和-3,SsoCdc6-2和SsoMCM的相互作用要更紧密一些,并可能在解旋酶加载方面起作用。4.细菌双杂交分析S.solfataricus Cdc6、DNA聚合酶polB1、MCM以及SSB之间的物理相互作用,结果表明:SsoCdc6-1△C/SsopolB1、SsoCdc6-3/SsopolB1、SsoCdc6-2/SsoSSB、SsoCdc6-3/SsoSSB、SsoSSB/SsoMCM、SsopolB1/SsoMCM和SsopolB1/SsoSSB之间存在物理相互作用。总结以上研究结果我们推测,S.solfaricus叁个SsoCdc6在DNA复制早期过程中可能扮演不同角色,但它们之间能够相互协作共同调控DNA复制原点的起始。编码SsoCdc6-1和SsoCdc6-3的基因分别与复制原点oriC1和oriC2相邻,可能在特异性识别原点中起作用,因而可以是真核生物ORC和细菌DnaA的功能同源物;而SsoCdc6-2编码的基因与编码SsoMCM的基因相邻而不与任何一个复制原点相邻可能负责MCM的加载,因而可能是真核生物Cdc6和细菌DnaC的同源物。我们的这些重要的结论已经对古菌和真核生物DNA复制起始机理的认识提供了重要线索。(本文来源于《华中农业大学》期刊2007-11-01）
陈晓斌,林建平,金志华,岑沛霖[10]（2006）在《硫矿硫化叶菌麦芽寡糖基海藻糖合成酶基因的克隆与表达》一文中研究指出The gene of maltooligosyl trehalose synthase(MTSase)from Sulfolobus solfataricus ATCC 35092 was amplified by using polymerase chain reaction (PCR).The expression plasmids,pTrc99a-MTSase and pET-28a(+)-MTSase,were constructed by inserting the DNA fragments into E.coli expression vectors,pTrc99a and pET-28a(+).These two plasmids were separately transformed into E.coli BL21(DE3),JM109(DE3)and BL21-Codonplus(DE3)-RIL,and the highest specific activity of MTSase was obtained in BL21(DE3)/pTrc99a system,which was 31.3 U·(g wet cell)~ -1 .To increase the expression level,the rare codons in the 5′-and 3′-end of the gene were substituted with E.coli preferred ones,and the present termination codon,UAG,was substituted with efficient translational termination sequence UAAU.By these modifications in the DNA sequence of MTSase gene,the specific activity of MTSase in E.coli cell was doubled.(本文来源于《化工学报》期刊2006年10期）
硫矿硫化叶菌论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
为了实现来源于S.solfataricus的β-半乳糖苷酶的高效表达,对E.coli BL21(DE3)/pT7-7-lacS基因工程菌的发酵培养基进行优化,获得最优的发酵培养基为:甘油浓度为10 g/L,蛋白胨浓度为18 g/L,酵母膏浓度为18g/L,磷酸盐浓度为15 mmol/L,Mg~(2+)离子浓度为5 mmol/L,乳糖诱导浓度为5 g/L。在优化条件下,β-半乳糖苷酶的酶活由初始的43.0 U/mL提高到83.4 U/mL。在此基础上,在3 L发酵罐上进行了初步放大,于DD_(600) 50时开始流加乳糖诱导,最终酶活达172.4U/mL,为摇瓶水平的2倍,为β-半乳糖苷酶的工业化生产奠定基础。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
硫矿硫化叶菌论文参考文献
[1].刘亮.硫矿硫化叶菌Hsp14.1和Hsp20.1的结构和分子伴侣活性调控机制研究[D].华南理工大学.2015
[2].吴玉飞,钱磊,张帆,陈晟,吴敬.重组大肠杆菌生产硫磺矿硫化叶菌β-半乳糖苷酶发酵条件初步研究[J].工业微生物.2012
[3].胡咏梅.硫磺矿硫化叶菌Sso0660和Sso0661基因的表达与功能研究[D].华中农业大学.2012
[4].李东哲.硫磺矿硫化叶菌（Sulfolobussulfataricusp2）小热激蛋白（HSP20）分子生物学特征和功能[D].浙江大学.2011
[5].闻真珍.硫矿硫化叶菌小热激蛋白SsHSP14.1的功能特性研究[D].华南理工大学.2010
[6].徐迅.嗜热古菌硫矿硫化叶菌中小热激蛋白基因的克隆、表达和性质研究[D].华南理工大学.2010
[7].吕新萍.硫矿硫化叶菌P2分子伴侣的ATPase活性对其功能影响[D].山东大学.2009
[8].褚鑫,王丽,何永志,董志扬.硫矿硫化叶菌P2分子伴侣基因的克隆表达及其性质[J].微生物学报.2008
[9].蒋培霞.硫磺矿硫化叶菌Orc1/Cdc6蛋白在DNA复制起始中的调控功能研究[D].华中农业大学.2007
[10].陈晓斌,林建平,金志华,岑沛霖.硫矿硫化叶菌麦芽寡糖基海藻糖合成酶基因的克隆与表达[J].化工学报.2006