导读:本文包含了原核融合蛋白表达系统论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:猪干扰素α1,胸腺肽α1,融合蛋白,活性检测
原核融合蛋白表达系统论文文献综述
张鹏[1]（2013）在《猪干扰素α1与胸腺肽α1融合蛋白原核表达系统的建立及活性检测》一文中研究指出干扰素（Interferon, IFN）是一种细胞因子，具有抗病毒、抗肿瘤、免疫调节等生物活性。猪干扰素α1(poIFNα1)具有广谱抗病毒活性，毒副作用小，速效多能。胸腺肽（Thymosin，THY）α1是由28个氨基酸组成的多肽，无明显种属特异性，能够连续诱导T细胞分化、发育和成熟，增强NK细胞功能，提高机体免疫力。医学临床表明，干扰素与胸腺肽具有协调和互补作用，联合应用优于单独使用，具有更强的抗病毒功效。当前，兽医临床缺乏高效廉价的抗病毒生物制剂，干扰素和胸腺肽在兽医临床应用较少，将poIFNα1及THYα1进行融合表达尚未见诸报道，本实验拟利用基因工程方法将二者进行融合表达，以提高其联合抗病毒活性，同时降低生产成本，为猪病毒性疾病的预防和治疗提供新方法。密码子偏爱性是影响外源蛋白在大肠杆菌中表达量的重要因素，因此本研究依据GenBank已发表的poIFNα1成熟肽基因序列，THYα1蛋白序列及大肠杆菌密码子偏爱性，对poIFNα1和THYα1基因序列进行了密码子偏爱性优化并人工合成poIFNα1和THYα1基因。为将poIFNα1及THYα1融合表达，并维持其原有的生物学活性，本实验利用SOE-PCR法在poIFNα1和THYα1之间设计3个不同序列的连接肽：ARG（LinkerA），GGGGSARGGGGGS（LinkerB），GGGGSGGGGSGGGGS（LinkerC），其中ARG为凝血酶的蛋白酶切位点，可使poIFNα1和THYα1在体内被凝血酶切开，GGGGS为柔性较高的短肽，有助于维持融合蛋白原有生物学活性。将构建的叁种融合基因及poIFNα1基因分别连接至pRSFDuet-1原核表达载体，鉴定结果表明，成功构建了poIFNα1及叁种poIFNα1-THYα1融合基因原核表达载体。将poIFNα1及叁种poIFNα1-THYα1融合基因原核表达载体分别转化BL21(DE3)感受态，IPTG诱导表达，超声破碎菌体，经SDS-PAGE和Western blot鉴定表明目的蛋白均存在于菌体裂解液上清中，为菌体内可溶性表达。为优化目的蛋白的诱导表达条件，本实验利用正交试验法设计并进行了9个平行试验，结果表明，温度30℃、IPTG浓度0.5mmol/L、诱导时间12h时目的蛋白表达量最高（P<0.001），灰度分析表明目的蛋白总量约占细菌总蛋白的22.13%。数据分析表明温度、IPTG浓度、诱导时间对于蛋白表达水平的影响程度，依次为诱导时间＞温度＞IPTG浓度。药品质量标准对于蛋白药物的纯度要求严格，为满足工业生产的要求，本实验利用强阴离子交换层析和疏水层析对poIFNα1蛋白及3种poIFNα1-THYα1融合蛋白进行初步纯化，获得了纯度约为90%的目的蛋白。为确定凝血酶酶切位点的有效性，本实验对poIFNα1-LinkerA-THYα1、poIFNα1-LinkerB-THYα1融合蛋白进行了体外酶切实验，SDS-PAGE结果表明融合蛋白在ARG处被成功切开。为测定poIFNα1蛋白及3种poIFNα1-THYα1融合蛋白的生物学活性，本实验利用细胞病变抑制法及T细胞活性测定法分别检测poIFNα1蛋白及3种poIFNα1-THYα1融合蛋白的干扰素活性和3种poIFNα1-THYα1融合蛋白的胸腺肽活性。结果表明，poIFNα1蛋白及叁种poIFNα1-THYα1融合蛋白均具有一定的抗病毒活性，叁种融合蛋白也具有一定的胸腺肽活性，其中poIFNα1-LinkerB-THYα1融合蛋白具有相对较高的干扰素活性（P<0.001），poIFNα1-LinkerA-THYα1融合蛋白具有相对较高的胸腺肽活性（P<0.05）。本研究对poIFNα1及THYα1的融合表达进行了初步探索，获得了具有一定干扰素活性和胸腺肽活性的纯度较高的融合蛋白，但是其纯度及活性尚不足以达到药品质量标准对纯度及效价的要求，需要进一步优化纯化工艺及提高其生物学活性，并通过体内试验进一步验证融合蛋白的联合抗病毒活性及其他生物学功能，从而为其大规模生产及临床应用奠定前期实验基础。(本文来源于《吉林大学》期刊2013-06-01）
张鹏,李明谦,郝林琳,马强,张英[2]（2012）在《猪干扰素α1与胸腺肽α1融合蛋白原核表达系统的建立》一文中研究指出依据GenBank已发表的猪干扰素α1(poIFN-α1)成熟肽基因序列,胸腺肽α1(THY-α1)蛋白序列及Escherichia coliB密码子使用频率表,优化并人工合成poIFN-α1和THY-α1基因,利用SOE-PCR法在poIFN-α1和THY-α1之间设计1个13肽Linker。将融合基因克隆至pRSFDue-t 1表达载体,转化BL21(DE3)感受态,37℃培养至菌液OD600为0.6~0.8,IPTG(0.5 mmol/L)诱导,20℃培养12h,SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果表明:目的蛋白为菌体内可溶性表达,经强阴离子交换层析和疏水层析纯化获得高纯度poIFNα1-THYα1融合蛋白。(本文来源于《吉林农业大学学报》期刊2012年04期）
方严,练雪梅[3]（2011）在《人Api6融合蛋白原核表达系统的构建》一文中研究指出目的:本研究拟采用蛋白原核表达的方法,诱导表达人Api6(Apoptosis inhibitor 6)融合蛋白,为进一步研究Api6在凋亡抑制、脂质代谢和肿瘤发生中的作用奠定基础。方法:利用PCR技术扩增人Api6基因,将其克隆至原核表达载体ppSUMO,构建重组质粒ppSUMO-Api6;重组质粒转化原核表达宿主菌E.coli Rosetta感受态;采用蛋白原核表达的方法,不同诱导前菌液浓度,不同温度、不同异丙基硫化半乳糖苷(Isopropy1-β-D-thiogalaotopyrano-side,IPTG)浓度、不同诱导时间,筛选诱导表达Api6重组蛋白的最优条件;Western blot鉴定其表达情况。结果:成功构建重组质粒ppSUMO-Api6;成功诱导Api6重组蛋白的原核表达,表达的最优条件为:OD600=0.5~0.8的重组菌,16℃、0.5 mmol/L IPTG诱导16 h。结论:含有人Api6 cDNA全长序列的重组质粒ppSUMO-Api6,经转化原核表达宿主菌E.coli Rosetta感受态细胞,在诱导前菌液OD600=0.5~0.8、16℃、0.5 mmol/LIPTG、诱导16 h这一优化的诱导条件下,重组菌ppSUMO-Api6-Rosetta可诱导重组蛋白ppSUMO-Api6的原核表达。(本文来源于《重庆医科大学学报》期刊2011年09期）
许无恨,郝林琳,王佳,于浩,刘松财[4]（2010）在《猪干扰素α1及胸腺肽融合蛋白原核表达系统的建立》一文中研究指出干扰素(IFN)是细胞分泌的小肽,具有抗病毒,抗增生和免疫调节等广泛的生物学活性。猪干扰素α1属Ⅰ型干扰素,具有广谱、高效抗病毒的功能,且对免疫系统起关键调节作用,研究结果显示其在改善临床症状和降低死亡率方面具有明显的治疗效果。胸腺肽(THY)是由胸腺的组织上皮细胞分泌的一类多肽激素,可促进T细胞的成熟,同时参与神经内分泌系统和免疫系统的相互作用,激活细胞免疫。(本文来源于《全国动物生理生化第十一次学术交流会论文摘要汇编》期刊2010-07-01）
刘慧玉[5]（2009）在《猫干扰素ω3与胸腺肽α1融合蛋白原核表达系统的建立》一文中研究指出猫干扰素ω属Ⅰ型干扰素(interferon,IFN),具有广谱、高效抗病毒的功能,且对免疫系统起关键调节作用,研究结果显示其在改善临床症状和降低死亡率方面具有明显的治疗效果。对细小病毒有抑制作用,并具有速效性。犬病毒性肠炎的临床治疗研究结果显示,干扰素治疗可以明显降低死亡率。胸腺肽干扰素胸腺肽(Thymic peptide,THY)是由胸腺的组织上皮细胞分泌的一类多肽激素,可促进T细胞的成熟,同时参与神经内分泌系统和免疫系统的相互作用,激活细胞免疫。本实验采用无种属特异性,抗病毒及免疫调节能力相对较强的猫IFN-ω3基因与THY-α1基因构建融合基因。在IFN-ω3和THY-α1中间设计了一个15肽的linker,氨基酸序列为(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)_3。通过搭桥PCR的方法,获得IFNω3-THYα1的串联基因,构建pBVIL-IFNω3,pBVIL-IFNω3-THYα1原核表达质粒。将质粒转入Rosseta(DE3)受体菌,经诱导高效表达后,融合蛋白以包涵体的形式存在于胞内,融合蛋白的分离纯化工艺一般包括以下几步:菌体的收集、破碎,包涵体的收集、洗涤、蛋白质的体外变性复性以及纯化、鉴定等。经BCA试剂盒测定纯化后的IFN-ω3,IFNω3-THYα1蛋白样品,浓度分别为1.6 mg/mL,0.98 mg/mL。由于纯化后的目的蛋白占总蛋白的80%左右,所以得到的IFN-ω3,IFNω3-THYα1融合蛋白浓度应分别为1.28mg/mL,0.78mg/mL。利用E玫瑰花环形成试验和细胞病变抑制试验检测融合蛋白活性。E玫瑰花环形成试验,表明融合蛋白能够提高花环形成率,具有THY-α1促进细胞表面受体表达的活性。细胞病变抑制试验,采用IFN-ω3做对照,试验结果显示二者的活性基本相同,具有一定的保护细胞不受病毒攻击的活性。结果表明IFNω3-THYα1融合蛋白中的两种蛋白均较好地保持各自的生物功能,为下一步的研究奠定基础。(本文来源于《吉林大学》期刊2009-06-01）
孙卫国[6]（2009）在《DsbA-DsbA~（mut）融合蛋白作为分子伴侣在原核表达系统中的作用研究》一文中研究指出大肠杆菌因为遗传背景清楚,代时短,易控制成为生产重组蛋白的主要工程菌。目前在利用原核系统表达重组蛋白的过程中常常遇到几个难题是重组蛋白常常以包含体的形式存在、表达量低、生物活性不高和容易降解等。高度还原性的大肠杆菌细胞质环境使表达的重组蛋白不易形成正确的二硫键和完整的四级结构,真核来源的功能蛋白或细胞因子常因原核表达系统的局限性而不能得到类似天然活性的重组蛋白。大肠杆菌自身二硫键的形成都是在其具有氧化性环境的周质腔进行的,大肠杆菌周质腔内二硫键形成蛋白家族成员是大肠杆菌自身蛋白形成正确二硫键的关键因素,它们一级结构都含有活性位点Cys-X-X-Cys,只是中间的氨基酸组成不同。二硫键形成蛋白A(Disulfide bond formation protein A ,DsbA)直接参与二硫键的形成,是迄今所发现的硫氧还蛋白家族中氧化性最强的一个,在体内和体外DsbA均能协助蛋白质折迭。DsbA的突变体DsbA~(mut)蛋白(DsbA mutant protein)是将DsbA的功能区域Cys-Pro-His-Cys中的两个Cys定点突变为Ser,构成Ser-Pro-His-Ser结构,突变后的DsbA蛋白即DsbA~(mut)蛋白不再具有氧化还原酶的功能,但仍然具有促目的蛋白可溶和细胞定位的作用。本课题基于DsbA和DsbA~(mut)蛋白结构和性质特点,对它们在原核表达系统上的作用进行系统研究。我们首先以人神经生长因子(hNGF)作为目标蛋白,比较了几种硫氧还蛋白家族蛋白成员在融合蛋白共复性上作用,发现相对于Trx和DsbC而言,DsbA蛋白在促进hNGF折迭和维持其生物活性上更具有优势作用。接下来,我们在寻找可以促使hNGF原核细胞质可溶性表达融合伴体研究上,发现极少数融合伴体能促使hNGF原核表达可溶性形式,但将DsbA和DsbA~(mut)蛋白串联形成DsbA-DsbA~(mut)融合蛋白作为融合伴体时获得了hNGF原核可溶性的融合表达,并且获得的重组蛋白DsbA-DsbA~(mut)-hNGF是具有良好生物活性功能。鉴于DsbA-DsbA~(mut)融合蛋白在原核表达上特点和作用,我们构建了一种新型高效融合表达载体(pET-dsbA-dsbA~(mut)),并以此载体实现了多个真核来源的功能蛋白原核可溶性的融合表达,生物活性测定实验证实,DsbA-DsbA~(mut)融合蛋白可以促进目的蛋白的空间折迭并维持目的蛋白的天然活性,因此我们所构建的融合表达载体在表达真核活性蛋白上具有通用性。由于构建的融合表达载体表达的融合蛋白可以保持目的蛋白的空间折迭状态,因此利用此载体可以进行蛋白质的结构和功能研究。我们以此融合载体为平台,表达了9个hNGF突变体蛋白,生物活性测定实验发现,当删除hNGF的N末端或C末端的多个氨基酸时,其天然生物活性显着降低或丢失。由于DsbA-DsbA~(mut)融合蛋白与目的蛋白融合表达还需要进一步的切割,为了便于下游目的蛋白的分离纯化,我们又尝试了利用DsbA-DsbA~(mut)融合蛋白与目的蛋白hNGF在原核系统的共表达。目前结果表明,在原核系统共表达hNGF尚有困难。为了进一步探索DsbA蛋白家族在原核系统共表达的可能性,我们又尝试将DsbA蛋白与其家族另一成员DsbC融合,并作为伴侣分子与目的基因hNGF在原核系统共表达。结果表明,将DsbA-DsbC融合蛋白与hNGF在原核表达系统内以单质粒双启动子模式进行共表达,获得了hNGF原核细胞质可溶性表达。而单独的DsbA或DsbC蛋白没有这种作用。通过本课题的研究,我们根据DsbA和DsbA~(mut)蛋白的性质特点获得了一种原核通用融合表达载体,该载体在表达真核来源的活性蛋白或细胞因子具有促可溶和保持目的蛋白天然活性的功能。其次,利用该融合表达载体可以应用于蛋白质结构和功能研究。另外,我们以DsbA-DsbC融合蛋白与hNGF在原核表达系统内共表达,第一次实现了重组hNGF原核细胞质可溶性表达,这种共表达模式在表达其它蛋白尤其是那些含有多个二硫键的功能蛋白上具有潜在参考价值。(本文来源于《中国人民解放军军事医学科学院》期刊2009-05-20）
刘宇鹏,吴琼,张明军,郝林琳,刘慧玉[7]（2008）在《犬干扰素α1与胸腺肽α1融合蛋白原核表达系统的建立》一文中研究指出依据IFNα1和THYα1的分子结构特征设计了1个连接肽,根据氨基酸序列和大肠杆菌密码子的偏爱性,采用PCR方法合成了叁者融合基因,将该基因克隆至pGEX4T-2载体中,构建了pGEX4T-2-IFNα1-THYα1原核表达质粒。将重组质粒转化至BL21(DE3)受体菌中,37℃培养至D600为0.6~1.0时,IPTG(1.0 mmol/L)诱导培养4 h,经SDS-PEGA和Western-blot鉴定,目的蛋白获得高效表达。(本文来源于《中国兽医学报》期刊2008年12期）
刘松财,王佳,孙铭泽,赵宇[8]（2008）在《鸡干扰素α1及胸腺肽α1融合蛋白原核表达系统的建立》一文中研究指出目前研究表明,细胞因子融合蛋白的应用有可能减少细胞因子单独使用时的毒副作用。干扰素(IFN)和胸腺肽(THY)具有相似的生物活性,如抗病毒,抗肿瘤和免疫调节等。鸡干扰素α1是细胞分泌的小肽,主要生物学功能是抑制病毒的复制,具有广谱抗病毒活性。胸腺肽在不同种属间高度保守,主要作为免疫调节剂使用,还具有增强NK细胞功能,(本文来源于《吉林省第六届生命科学大型学术报告会论文集》期刊2008-12-01）
王佳,孙铭泽,赵宇,刘宇鹏,刘慧玉[9]（2008）在《鸡干扰素α1及胸腺肽α1融合蛋白原核表达系统的建立》一文中研究指出根据GenBank已发表的鸡干扰素α1(IFNα1)基因序列,设计1对特异性引物,采用PCR方法,从鸡基因组中扩增出鸡IFNα1基因。根据胸腺肽α1(THYα1)氨基酸序列,选用大肠杆菌偏爱密码子,设计基因序列,同时在IFNα1-THYα1之间设计1个5肽Linker。在IFNα1基因结构基础上,设计4条寡核苷酸单链作为下游引物,以搭桥的方式延伸和扩增,最终获得IFNα1-THYα1融合基因;将该基因克隆至pGEX4T-1载体后,转化至BL21(DE3)受体菌中,37℃培养至菌液D600为0.6～1.0时,IPTG(1.0mmol/L)诱导培养4h;经western blot鉴定证实,成功构建了鸡干扰素α1及胸腺肽α1融合蛋白原核表达系统,表达产物以包涵体形式存在,获得高纯度的IFNα1-THYα1蛋白。以细胞病变抑制试验及E玫瑰花结形成试验对目的蛋白进行体外活性检测,结果显示该蛋白具有生物活性。(本文来源于《中国兽医学报》期刊2008年10期）
王佳,孙铭泽,赵宇,刘宇鹏,刘慧玉[10]（2008）在《鸡干扰素α1及胸腺肽融合蛋白原核表达系统的建立》一文中研究指出干扰素(IFN)和胸腺肽(THY)具有相似的生物活性,研究证实干扰素和胸腺肽联合应用具有协同促进 T 细胞生长、增殖、分化和激活 NK 细胞活性等功能,可增强机体的免疫能力。目前国内外对干扰素和胸腺肽都是单独生产,临床上一般也是分别给药。利(本文来源于《全国动物生理生化第十次学术交流会论文摘要汇编》期刊2008-07-01）
原核融合蛋白表达系统论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
依据GenBank已发表的猪干扰素α1(poIFN-α1)成熟肽基因序列,胸腺肽α1(THY-α1)蛋白序列及Escherichia coliB密码子使用频率表,优化并人工合成poIFN-α1和THY-α1基因,利用SOE-PCR法在poIFN-α1和THY-α1之间设计1个13肽Linker。将融合基因克隆至pRSFDue-t 1表达载体,转化BL21(DE3)感受态,37℃培养至菌液OD600为0.6~0.8,IPTG(0.5 mmol/L)诱导,20℃培养12h,SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果表明:目的蛋白为菌体内可溶性表达,经强阴离子交换层析和疏水层析纯化获得高纯度poIFNα1-THYα1融合蛋白。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
原核融合蛋白表达系统论文参考文献
[1].张鹏.猪干扰素α1与胸腺肽α1融合蛋白原核表达系统的建立及活性检测[D].吉林大学.2013
[2].张鹏,李明谦,郝林琳,马强,张英.猪干扰素α1与胸腺肽α1融合蛋白原核表达系统的建立[J].吉林农业大学学报.2012
[3].方严,练雪梅.人Api6融合蛋白原核表达系统的构建[J].重庆医科大学学报.2011
[4].许无恨,郝林琳,王佳,于浩,刘松财.猪干扰素α1及胸腺肽融合蛋白原核表达系统的建立[C].全国动物生理生化第十一次学术交流会论文摘要汇编.2010
[5].刘慧玉.猫干扰素ω3与胸腺肽α1融合蛋白原核表达系统的建立[D].吉林大学.2009
[6].孙卫国.DsbA-DsbA~（mut）融合蛋白作为分子伴侣在原核表达系统中的作用研究[D].中国人民解放军军事医学科学院.2009
[7].刘宇鹏,吴琼,张明军,郝林琳,刘慧玉.犬干扰素α1与胸腺肽α1融合蛋白原核表达系统的建立[J].中国兽医学报.2008
[8].刘松财,王佳,孙铭泽,赵宇.鸡干扰素α1及胸腺肽α1融合蛋白原核表达系统的建立[C].吉林省第六届生命科学大型学术报告会论文集.2008
[9].王佳,孙铭泽,赵宇,刘宇鹏,刘慧玉.鸡干扰素α1及胸腺肽α1融合蛋白原核表达系统的建立[J].中国兽医学报.2008
[10].王佳,孙铭泽,赵宇,刘宇鹏,刘慧玉.鸡干扰素α1及胸腺肽融合蛋白原核表达系统的建立[C].全国动物生理生化第十次学术交流会论文摘要汇编.2008