导读:本文包含了猪血凝性脑脊髓炎病毒论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:猪血凝性脑脊髓炎病毒,病毒入侵,纤维形肌动蛋白,cofilin
猪血凝性脑脊髓炎病毒论文文献综述
吕晓玲[1]（2019）在《微丝骨架介导猪血凝性脑脊髓炎病毒入侵神经细胞的作用及其机制》一文中研究指出猪血凝性脑脊髓炎病毒(Porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus,PHEV)是一种典型的嗜神经性冠状病毒,其主要感染3周龄以内的哺乳仔猪,可引起脑脊髓炎,呈现明显抽搐、呕吐等临床症状,死亡率可达100%。该病毒主要侵害神经系统,但其所致神经损伤的机制尚未完全阐明。微丝(纤维形肌动蛋白,F-actin)作为真核细胞细胞骨架的重要组成部分,是病原体进入宿主细胞的第一个物理屏障。神经细胞的形态结构和功能主要取决于F-actin的动态调节。本课题组前期研究发现,PHEV通过网格蛋白介导的内吞作用进入神经细胞依赖于F-actin的完整性。F-actin是否参与PHEV入侵过程,以及F-actin结构改变对PHEV复制的影响及其在侵袭过程中的动态调控机制目前尚不清楚。因此,从F-actin角度探讨PHEV诱导神经元损伤的机制不仅有助于阐明PHEV的发病机制,而且为寻找新的抗病毒靶点提供了理论依据。本实验在PHEV感染小鼠神经瘤母(Neuro-2a,N2a)细胞模型的基础上,利用免疫荧光染色和流式细胞术检测病毒感染早期不同时间点细胞F-actin结构变化情况。与接种灭活病毒细胞和对照组细胞相比,在PHEV感染期间,F-actin结构呈现出应力纤维溶解、丝状伪足和片状伪足逐渐形成,随后应力纤维再次形成的动态变化;流式细胞术检测结果显示,F-actin在病毒感染后5 min(mpi)快速聚合,然后在20 mpi开始解聚。这些结果表明PHEV感染N2a细胞早期可引起F-actin骨架重塑。随后,利用间接免疫荧光和qRT-PCR方法检测PHEV进入动力学。结果显示,病毒颗粒沿着丝状伪足移动进入细胞,且病毒进入主要发生在15 mpi,推测F-actin结构重塑可能与病毒进入相关。进而利用Cyto D预处理细胞破坏F-actin结构动态变化,qRT-PCR、Western blotting、间接免疫荧光及病毒生长动力学检测其对病毒进入和增殖的影响。结果表明,Cyto D以剂量依赖性方式抑制病毒进入且降低病毒滴度,证实PHEV进入细胞与其引起的F-actin骨架结构动态变化密切相关。Cofilin为细胞骨架解聚因子家族中重要的调控蛋白,可通过切割F-actin调控其动态变化。为进一步明确F-actin发挥作用的途径,本实验对cofilin在PHEV进入N2a细胞过程中的作用进行研究。利用Western blotting和间接免疫荧光技术检测病毒进入过程中cofilin激活情况。结果显示,cofilin活性出现动态变化,与F-actin变化趋势一致,推测其可能参与PHEV侵入细胞的过程。进而将cofilin siRNA、cofilin-WT(野生型)、cofilin-S3A(激活型)、cofilin-S3D(失活型)过表达载体分别转染N2a细胞后再接种PHEV,利用qRT-PCR、Western blotting和间接免疫荧光法检测病毒进入量及F-actin变化情况。结果显示,cofilin siRNA和叁种过表达载体均抑制病毒进入,表明PHEV有效进入细胞需要借助cofilin动态磷酸化而非其某一固定状态;此外,siRNA可破坏细胞应力纤维并使细胞表面形成小突起,且PHEV可减少因增强cofilin活性引起的棒状结构产生,证实cofilin活性影响PHEV诱导F-actin骨架变化和病毒进入过程。同时,检测cofilin上游激酶LIMK在PHEV感染过程中的激活情况及其对病毒进入的影响。结果显示,LIMK活性同样出现动态变化,且趋势与cofilin活性变化趋势一致;降低细胞内源性LIMK表达可抑制病毒进入,表明LIMK作为cofilin上游激酶调控PHEV侵入细胞的过程。受体酪氨酸激酶(RTKs)、整合素(integrins)、G蛋白偶联受体等信号分子均可参与F-actin细胞骨架调控过程。为进一步研究F-actin介导PHEV入侵N2a细胞的分子机制,选用针对上述多种信号分子的特异性化学抑制剂,分别阻断由其介导的信号通路,利用qRT-PCR、Western blotting、GST-pull down和间接免疫荧光法分析不同信号分子对cofilin活性及PHEV入侵的影响。结果显示,RTKs信号分子不参与病毒入侵过程;integrinα5β1不仅在PHEV附着时累积,而且还促进下游激酶FAK和PI3K/Akt信号通路的活化;Src激酶不参与病毒诱导的F-actin骨架重排过程,也不影响cofilin活性,说明PHEV使用独立于Src家族的FAK信号传导途径调节F-actin骨架重排;Rac 1和Cdc 42 GTPases为integrinα5β1-FAK途径的下游Rho GTPases,并且Rac 1和Cdc 42 GTPases都通过调节下游PAK 1分子来影响F-actin骨架重排和cofilin活性;Rho A作为integrinα5β1-PI3K/Akt途径的下游靶蛋白,并且通过调控下游ROCK激酶来影响F-actin骨架重排和cofilin活性。上述结果证实,PHEV通过integrinα5β1信号分子的FAK-Rac 1/Cdc 42-PAK 1-LIMK及PI3K/Akt-Rho A-ROCK-LIMK两条信号通路协同作用来促进cofilin磷酸化进而诱导肌动蛋白聚合,促进PHEV高效进入N2a细胞;随后病毒穿透细胞膜又激活cofilin,调节应力纤维的形成以促进病毒运输。Integrinα5β1信号分子为PHEV进入N2a细胞的关键分子,为研究其在体内对病毒感染的作用,本实验在PHEV感染小鼠模型的基础上,检测integrinα5β1信号分子及下游通路激活情况。结果显示,integrinα5β1表达量在病毒感染小鼠过程中增加,与细胞水平结果相一致;FAK-Rac 1/Cdc 42-PAK 1-LIMK通路被激活,而PI3K/Akt-Rho A-ROCK-LIMK通路未被完全激活,提示integrinα5β1-FAK-Rac 1/Cdc 42-PAK 1-LIMK-cofilin可能在体内病毒感染过程中也发挥作用。小鼠静脉注射ATN-161以降低脑组织integrinα5β1表达量,随后滴鼻接种PHEV,利用qRT-PCR、Western blotting、GST-pull down、间接免疫荧光、H&E染色等方法检测ATN-161在体内是否具有抗病毒作用。结果显示,小鼠静脉注射ATN-161后,其发病时间延缓、临床症状减轻、体重下降率降低且其生存期显着延长;H&E染色发现,ATN-161治疗后,小鼠大脑皮质神经元细胞趋于正常,并且在5 dpi时未出现典型的非化脓性脑炎病理变化;ATN-161可使小鼠脑内病毒表达量显着降低且FAK-Rac 1/Cdc 42-PAK 1-LIMK-cofilin通路激活情况被抑制。上述实验证实,integrinα5β1-FAK-Rac 1/Cdc 42-PAK 1-LIMKcofilin可促进PHEV在体内增殖;而且integrinα5β1抑制剂ATN-161在体内具有一定的抗病毒作用。综上所述,本研究首先阐明了PHEV进入N2a细胞期间F-actin骨架重塑的特定机制,并确定cofilin活性为F-actin骨架重塑和病毒进入过程之间的分子开关,为深入解析PHEV诱导神经细胞损伤的机制奠定基础。另外,integrinα5β1特异性抑制剂ATN-161在体内具有一定抗病毒作用,说明cofilin和上游信号分子可作为治疗性抗病毒策略的可行性靶标,为新型抗病毒药物的研发提供理论支撑。(本文来源于《吉林大学》期刊2019-06-01）
姜景夫[2]（2019）在《猪血凝性脑脊髓炎病毒致脑损伤相关的宿主LncRNA筛选和功能分析》一文中研究指出猪血凝性脑脊髓炎(Porcine hemagglutinating encephalomyelitis,PHE)是由β冠状病毒属的猪血凝性脑脊髓炎病毒(Porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus,PHEV)引起的一种呈全世界范围内分布的高度接触性、急性传染病。临床上该病多见于叁周龄以内的仔猪,且常常表现出两种不同的临床症状。呕吐消瘦型:可引起患病仔猪呕吐、腹泻、衰竭等症状;脑脊髓炎型:可引起患病仔猪出现明显的神经震颤、尖叫等症状,患病仔猪的死亡率可达100%。目前对于猪血凝性脑脊髓炎并无有效的预防和治疗措施,一旦爆发会给养猪业带来巨大的经济损失。PHEV主要侵害宿主的神经系统,但其所致神经损伤的具体机制尚未完全阐明。长链非编码RNA(Long noncoding RNA,lncRNA)为不具有编码能力或具有很少编码能力的RNA分子,广泛存在于真核生物中。研究发现,多种病毒感染过程都伴随着LncRNA的差异表达,如乙肝病毒、丙肝病毒、鸡马立克病毒和巨细胞病毒等,而PHEV的感染是否会引起宿主体内LncRNA差异表达以及其在该病毒致病过程中发挥的作用还未见报道。因此,从LncRNA角度探讨PHEV诱导神经元损伤的机制将有助于阐明猪血凝性脑脊髓炎发病机制。鉴于此,本实验在PHEV感染小鼠模型的基础上,首先利用高通量测序技术研究PHEV致小鼠脑损伤过程中大脑皮质区LncRNA的表达变化,发现与对照组相比,PHEV感染小鼠大脑皮质LncRNA表达谱发生显着变化,筛选得到1407个差异表达的mRNA,其中上调mRNA共1270条,下调mRNA共137条;110条差异表达LncRNA,其中上调LncRNA 83条,下调LncRNA 27条。利用LncTar软件基于序列互补原理完成LncRNA靶基因的预测。分别对差异mRNA和差异LncRNA绘制火山图,发现差异mRNA的表达量和表达倍数均高于差异LncRNA的变化;利用GO分析从生物过程、分子功能和细胞组成叁个部分完成对差异mRNA和LncRNA的功能注释;利用KEGG分析从遗传信息、环境信息、有机系统、细胞进程、代谢等方面完成对差异mRNA和LncRNA的功能注释。通过对差异mRNA与LncRNA长度、外显子数目和ORF长度等方面对二者基因结构进行对比,为后续挖掘LncRNA功能提供实验依据。为检验高通量测序的可靠性,抽取差异表达的mRNA和LncRNA,利用qPCR方法检测其在细胞和组织水平上表达情况。qPCR结果与测序结果一致,证实高通量测序结果真实、可靠。从数据库中选择上调明显的NONMMUT006579.2和NONMMUT131476.1两条LncRNA为研究对象,利用qPCR方法对PHEV感染宿主过程中NONMMUT006579.2和NONMMUT131476.1的表达量进行检测。结果显示,与对照组相比,NONMMUT006579.2和NONMMUT131476.1表达量明显上调,推测这两条LncRNA可能参与PHEV感染宿主过程。为验证这一推测,对N2a细胞转染NONMMUT006579.2 siRNA或过表达载体,接种PHEV后,qRCR结果显示,RNAi或过表达NONMMUT006579.2对PHEV的复制没有影响;而对N2a细胞转染NONMMUT006579.2 siRNA,qPCR和Western blotting方法检测其对PHEV增殖的影响,结果显示,降低NONMMUT131476.1表达后,PHEV复制量增加,即NONMMUT131476.1负向调控病毒复制增殖。LncRNA可通过调控相关靶基因的差异表达来发挥生物学的调控作用,为进一步研究差异LncRNA(NONMMUT006579.2和NONMMUT131476.1)的调控作用,本实验利用LncTar软件对可能造成脑损伤LncRNA的靶基因进行预测并与高通量测序结果进行对接,发现这些靶基因参与生态行为、内吞作用、遗传信息、生理代谢、细胞进程和免疫应答等生物学过程,如与胞吞途径相关的Washc4基因可能为NONMMUT006579.2的顺式靶基因,而与先天免疫相关的Nlrc5可能为NONMMUT131476.1顺式靶基因。为进一步研究差异LncRNA(NONMMUT006579.2和NONMMUT131476.1)的表达是否在PHEV感染过程中影响Washc4和Nlrc5的表达。N2a细胞转染NONMMUT006579.2过表达载体或siRNA后,接种PHEV,通过qPCR检测,结果显示,Washc4的表达与NONMMUT006579.2的表达呈现正相关;而转染NONMMUT131476.1 siRNA后接种PHEV,结果显示,Nlrc5的表达与NONMMUT131476.1的表达呈现正相关,推测Washc4为NONMMUT006579.2的靶基因,Nlrc5为NONMMUT131476.1的靶基因。综上所述,本实验完成了PHEV感染后宿主大脑皮质差异LncRNA的筛选以及差异LncRNA与差异mRNA的互作分析。PHEV感染宿主后引起NONMMUT006579.2和NONMMUT131476.1上调表达,而上调表达的NONMMUT006579.2和NONMMUT131476.1又分别正向调控Washc4和Nlrc5的表达,同时NONMMUT131476.1又可负向调控PHEV的复制。实验数据将对LncRNA在PHEV感染中的作用提供支持并为抗PHEV感染的治疗方案提供理论依据。(本文来源于《吉林大学》期刊2019-06-01）
李姿[3]（2018）在《miR-142a-5p在猪血凝性脑脊髓炎病毒致神经损伤中的作用机制》一文中研究指出猪血凝性脑脊髓炎是由猪血凝性脑脊髓炎病毒(porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus,PHEV)感染引起的猪的一种急性、高度接触性传染病,已成为危害我国养猪业发展的重要疫病之一。PHEV主要侵害仔猪中枢神经系统(CNS)导致其神经功能障碍,但该病毒致神经损伤的机制目前尚未阐明。在病毒与宿主长期共进化中,许多DNA/RNA病毒进化出降解、促进或劫持宿主mi RNA的分子机制,从而加速病毒感染或微调宿主细胞内环境。本课题组前期研究表明PHEV感染诱导小鼠大脑皮质miRNA/mRNA动态表达谱异常,并初步筛选到大量差异表达miRNAs参与调控PHEV感染致病。因此,本研究以PHEV感染后差异表达显着的miR-142a-5p分子为研究对象,开展其在PHEV致神经系统损伤中的生物学功能及分子调控机制研究。本研究建立了PHEV急性感染小鼠和原代大脑皮质神经元模型,为PHEV致病机制的解析提供理想的体内、体外研究支持系统。基于上述感染模型,通过qRT-PCR、原位杂交技术(FISH)检测证明,PHEV感染诱导miR-142a-5p显着上调表达,提示差异表达miR-142a-5p可能参与调控PHEV致神经损伤作用。为明确miR-142a-5p的调控功能,本研究对miR-142a-5p的靶基因进行系统鉴定。运用TargetScanMouse 6.2、miRanda、MicroT-CDS等软件预测得到106个潜在靶基因,并通过GO、KEGG、Cytoscape分析初步选择Unc-51-like kinase 1(Ulk1)为待检靶基因。通过miRNA mimics/inhibitors转染、激光共聚焦显微镜技术分析(CLSM)、双荧光素酶报告系统(DLR)、凝胶电泳迁移率检测(EMSA)等生物学实验进一步证实,miR-142a-5p特异性靶向Ulk1 mRNA 3'UTR区域,Ulk1为miR-142a-5p下游靶标并参与调控PHEV感染致病过程。为证实miR-142a-5p靶向抑制Ulk1在PHEV感染中的重要作用,本研究通过miR-142a-5p功能抑制研究发现,miR-142a-5p低表达可以降低PHEV复制增殖,且miR-142a-5p antagomir对PHEV感染小鼠脑损伤具有一定保护作用。利用透射电子显微镜技术(TEM)、DiD病毒示踪分析等证明,PHEV入侵后内化至Rab5GTP早期内体(EEs),并依赖宿主内体运输系统实现胞内转运。为揭示mi R-142a-5p促进PHEV感染的机制,本研究检测Ulk1功能异常对Rab5介导的PHEV感染周期的影响。首先,对神经元进行PHEV感染、miR-142a-5p/Ulk1差异表达等研究证明,Ulk1功能缺失上调Rab5 GTPase活性并促进PHEV内化及复制增殖。其次,通过Rab5 GTPase激活检测、内体形态观察等研究证明,PHEV有效感染依赖于Ulk1对Rab5 GTPase活性的调节。宿主差异表达miR-142a-5p不仅能够促进PHEV感染,也可以微调PHEV感染神经元的内环境致其形态发生异常。本研究通过建立Ulk1腺病毒过表达系统、CRISPR/Cas9介导Ulk1基因敲除系统的研究表明,Ulk1在促进神经元突起生长发育中发挥重要作用。对神经元形态结构定量分析表明,miR-142a-5p靶向抑制Ulk1参与调控PHEV致神经元突起退化过程,表现为轴突延伸发育不良、大量突起串珠形成、树突分枝增多、树突棘形成不稳定等。为揭示上述变性损伤的分子机制,本研究进一步探讨Ulk1及其下游因子Rab5在神经生长因子(NGF)信号转导中的作用。首先,通过CLSM、流式细胞术(FCM)等研究发现,PHEV感染下调NGF高亲和性受体TrkA磷酸化水平,并抑制Ulk1介导的NGF/TrkA内化作用。随后,通过高浓度NGF拯救、免疫共沉淀、共定位分析等研究证明,Ulk1功能缺失促进NGF/TrkA内化至激活型Rab5GTP内体,并于突起串珠病变部位发生轴突运输障碍。上述研究表明,Ulk1介导NGF/TrkA信号转导紊乱是PHEV致神经元变性受损的重要分子机制之一。综上所述,本研究揭示miR-142a-5p靶向抑制Ulk1功能在PHEV感染致神经系统损伤中的分子机制:一方面,Ulk1功能缺失促进Rab5 GTPase激活,有利于PHEV依赖Rab5GTP途径实现侵入和胞内转运,加速病毒感染周期;另一方面,高活性、不稳定的Rab5GTP内体发生轴突运输障碍,导致Ulk1/NGF/TrkA信号转导异常,从而诱发PHEV感染神经元形态异常、功能受损。该研究结果不仅为miRNA参与调控PHEV感染提供数据支持,也为深入解析PHEV的致病机理提供新的思路,具有重要的科学意义。(本文来源于《吉林大学》期刊2018-06-01）
舒婧妍[4]（2018）在《猪血凝性脑脊髓炎病毒间接Elisa抗体检测试剂盒的研制与应用》一文中研究指出猪血凝性脑脊髓炎是由猪血凝性脑脊髓炎病毒(Porcine hmagglutinating encephalomyelitis virus,PHEV)引起的一种急性、传染性疾病,其主要感染幼龄仔猪,成年猪多呈隐形感染。该病的主要临床症状表现为呕吐、腹泻和神经等症状。感染该病毒的仔猪通常会出现两种症状:呕吐消耗型症状和脑脊髓炎型症状。呕吐消耗型的临床症状表现为呕吐、腹泻、吞咽困难,最终由于长期不进食导致消瘦,机体机能衰竭而死亡,病死率在20%-80%之间。对于存活下来的仔猪,后期生长缓慢成为僵猪。脑脊髓炎型是在呕吐消瘦型症状的基础上发展而来的,主要侵袭3周龄以内的仔猪,临床表现为患病仔猪体温上升,同时也伴有呕吐,食欲减退,有明显的神经性症状,例如肌肉震颤、运动失调、后肢僵直或麻痹成犬坐、四肢呈现划水状,对外界环境和声音刺激异常敏感,发病后期出现眼球震颤、无法直立、呼吸困难,进而导致死亡。该型发病时间短,死亡率高,只有少数会转归康复,死亡率达20%-100%。该病自1952年首次在加拿大爆发后,日本、美国、欧洲等地均有感染此病的报道。1986年中国首次报道此病后,PHEV亦有增强趋势,血清学调查发现,目前该病在东北地区多发,并在吉林和辽宁有很高的感染率,所以制定有效的诊断与预防措施刻不容缓。目前对PHEV的检测方法仍然以实验室诊断为主,需要专业的实验仪器并且对检测人员的要求较高。所以建立一种快速、方便、敏感性及特异性强的诊断方法,成为研究人员亟待解决的课题。其中酶联免疫吸附试验最为符合我们诊断的需要。本研究通过对PHEV重组蛋白N的菌液的复苏,参照最佳诱导条件进行纯化并成功获得抗原,建立及优化了Elisa方法,组建了猪血凝性脑脊髓炎病毒结构蛋白N间接抗体检测试剂盒,为今后的血清学调查提供依据。具体内容如下:1 PHEV-N重组抗原蛋白的制备与质量检测参考本实验室优化所得的最佳诱导条件进行诱导,大量制备目的蛋白,随后用His Gravi Trap纯化试剂盒对其进行纯化,并将纯化后的蛋白进行SDS-PAGE电泳检测,检测蛋白的纯度及浓度等。试验方法及结果如下:复苏后的菌液按1:100接种到LB液体培养基中,置于37℃的恒温摇床内200rmp摇晃2h后取出,按1:1000的比例加入100m M的IPTG诱导6小时,超声破碎后进行纯化。取纯化后产物进行SDS-PAGE电泳检测,于55k D处观察到有明显的条带,且无杂带,表明纯化后蛋白的纯度较高。取出所得的4批中的3批纯化蛋白进行蛋白浓度检测,测得的平均浓度分别为122.497mg/m L、189.8887mg/m L、155.44257mg/m L。2 Elisa方法的建立及优化用纯化后的重组N蛋白包被Elisa酶标板,建立Elisa方法并进行优化,并与HI方法进行符合率的比较,所得结果如下:抗原的最佳包被浓度为0.0625μg/m L,血清的最佳稀释度为1:200,最佳抗原包被时间为37℃2h+4℃过夜,最佳封闭剂为3%的脱脂奶,最佳封闭时间为37℃作用2h,血清最佳作用时间为90min,酶标二抗最佳稀释倍数为1:10000,酶标二抗最佳反应时间为37℃作用90min,底物的最佳反应时间是室温作用20min。随后根据统计学原理计算得出当血清OD450nm的值大于等于0.386判定为阳性,当OD450nm的值小于0.320时判定为阴性,介于二者之间为可疑。用建立好的Elisa方法同时检测PHEV、猪δ冠状病毒(PDCo V)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的阳性血清,所得结果显示除PHEV外其他病毒的血清均为阴性,表明本试验特异性良好,无交叉反应。同时对其敏感度进行测定,结果表明当标准阳性血清倍比稀释到1:6400时,检测结果仍为阳性,说明该方法敏感性良好。最后比较Elisa和HI方法二者的符合率为77.5%,结果也表明Elisa方法较HI方法敏感。3猪血凝性脑脊髓炎病毒间接Elisa抗体检测试剂盒的研制及应用在建立的Elisa方法基础上,确定阴阳性对照血清,用纯化后的重组蛋白制备酶标板,组建3批Elisa抗体检测试剂盒,对其批内、批间重复性、保存期、敏感性、特异性等条件进行检测,最后应用于临床样本的检测。具体结果如下:对3批试剂盒进行批间和批内的测定实验,发现不同批次组装的试剂盒,变异系数在3.43%-7.56%,均小于10%。叁批组装的试剂盒,随机检测4份不同抗体效价的血清,变异系数在1.09%-2.60%,均小于3%,表明试剂盒的批间和批内检测结果稳定,重复性好。分别对叁批试剂进行敏感性测定结果发现在血清稀释度在1:6400时仍为阳性,随后检测PHEV、猪δ冠状病毒(PDCo V)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒(PCV)这5种病原的阳性血清,发现除PHEV外,其他猪病的血清均为阴性。同时对试剂盒的保存期进行测试,发现该试剂盒在-20℃可以保存6个月。最后用已组装好的猪血凝脑脊髓炎病毒间接Elisa抗体检测试剂盒分别对采集自山东、吉林、辽宁、天津等地633份血清进行检测,调查发现各地阳性血清比例均占半数以上。综上所述,本研发项目初步建立了PHEV抗体检测试剂盒,且该试剂盒具有较高的敏感性、特异性和重复性,可用于PHEV免疫抗体的检测与流行病学调查。(本文来源于《吉林大学》期刊2018-06-01）
徐囡[5]（2018）在《ATF3在猪血凝性脑脊髓炎病毒感染神经细胞过程中的作用》一文中研究指出猪血凝性脑脊髓炎(Porcine hemagglutinating encephalomyelitis,PHE)是仔猪的一种急性、高度接触性传染病,其病原是猪血凝性脑脊髓炎病毒(Porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus,PHEV),主要感染1~3周龄的哺乳仔猪,主要以呕吐衰竭和明显的神经症状为特征。转录激活因子3(activating transcription factor 3,ATF3)是转录因子ATF/CREB家族成员之一,ATF3是一个适应反应基因,在静息细胞中低表达,在受到刺激时表达量会迅速升高。前期mRNA芯片分析结果表明,小鼠大脑及小鼠神经胶质瘤细胞(N2a)感染PHEV后,ATF3均呈现高表达。但ATF3高表达的机制及其对神经细胞的影响尚不清楚。本实验首先对N2a细胞感染PHEV后不同时间段的ATF3表达水平进行了检测,同时对不同滴度PHEV感染N2a细胞后的ATF3表达水平进行了检测,以分析病毒载量与ATF3表达水平之间的关系;其次,合成ATF3siRNA,构建ATF3过表达载体,分别转染N2a细胞,建立稳定表达的细胞系,然后接种PHEV,分析PHEV的mRNA的表达水平,并检测细胞周期和细胞凋亡,以探究ATF3是否影响病毒的复制,探究在PHEV感染神经细胞过程中ATF3对宿主细胞发挥的作用。本试验在探究PHEV感染神经细胞的机制中选择N2a细胞作为模型,根据试验内容和试验目的将N2a细胞接种于六孔板进行分组培养,将PHEV吸附N2a细胞1 h后,通过RT-PCR和Western Blot方法,于感染后2 h、12 h、24 h,检测神经细胞内ATF3表达水平的变化。N2a细胞转染siRNA和表达载体后接种PHEV,设置5组:对照组、ATF3干扰接毒组、阴性对照接毒组、ATF3过表达接毒组、空载接毒组,每组3个重复,利用RT-PCR技术检测PHEV mRNA表达情况,探究ATF3是否影响病毒的复制;通过Annexin V-FITC/PI双染法检测12 h细胞凋亡,利用PI单染法检测12 h细胞周期,以测定ATF3对PHEV感染的神经细胞的凋亡和细胞周期的影响。结果表明,ATF3在正常N2a细胞中表达水平较低,随着感染时间的增加,PHEV mRNA表达量和ATF3 mRNA表达量均出现先升高后降低的趋势,二者之间呈正相关;随着感染时间的增加ATF3的蛋白表达量持续升高;随着病毒滴度的降低,ATF3表达量也随之下降转染了ATF3siRNA后,ATF3表达显着受到抑制;转染了ATF3过表达载体后,ATF3表达显着升高。利用RT-PCR技术检测PHEV mRNA表达水平,利用流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期,结果发现,ATF3干扰接毒组细胞与阴性对照接毒组相比,PHEV mRNA表达量无明显差异;早期凋亡升高;G1期阻滞加重。ATF3过表达接毒组细胞与空载接毒组细胞相比,早期凋亡率下降;S期阻滞减缓。综上所述,ATF3在PHEV感染N2a细胞的过程中与病毒的复制呈正相关,PHEV会影响ATF3的表达,但ATF3并不会影响PHEV的复制,ATF3在PHEV感染N2a细胞的过程中会起到抗凋亡和促进细胞周期的作用。(本文来源于《沈阳农业大学》期刊2018-06-01）
刘俊显[6]（2017）在《ATF3在猪血凝性脑脊髓炎病毒感染神经细胞过程中对细胞周期和凋亡的影响》一文中研究指出猪血凝性脑脊髓炎是由猪血凝性脑脊髓炎病毒(Porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus,PHEV)引起的,主要感染3周龄的仔猪,临床以呕吐衰竭和明显的神经症状为特征。前期研究结果表明,小鼠感染PHEV后大脑中ATF3呈高表达,为了探明ATF3在神经细胞感染PHEV后ATF3是否呈现高表达,以及其高表达的机制,本实验对神经细胞感染PHEV前后ATF3的表达进行了检测,同时探索JNK信号通路在猪血凝性脑脊髓炎病毒感染神经细胞过程中对ATF3表达的影响。本试验以N2a细胞作为研究PHEV感染神经细胞的模型,根据试验要求,设置4组:对照组、接毒组、JNK抑制剂组和JNK抑制剂接毒组,每组3个重复。于六孔板中培养N2a细胞到单层,以吸附法接种PHEV,然后分别在2h、12h、24h时提取细胞总RNA和总蛋白,通过荧光定量PCR和蛋白质印迹法(Western Blot)分别测定PHEV感染前后及JNK抑制剂作用前后N2a细胞中ATF3 mRNA和蛋白的表达量。同时设置6组:对照组、接毒组、DMSO组、DMSO接毒组、JNK抑制剂组和JNK抑制剂接毒组,每组3个重复,通过Annexin V-FITC/PI双染法和PI染色法检测12h和24h的细胞凋亡和细胞周期,以测定JNK抑制剂作用前后对PHEV感染的神经细胞的凋亡和细胞周期的影响。结果表明,ATF3基因在正常N2a细胞中的处于低表达,随着PHEV mRNA和蛋白表达量的降低或升高ATF3 mRNA和蛋白的表达量也随着降低或升高,两者之间的变化趋势一致且呈正相关;JNK抑制剂作用N2a细胞后,ATF3的mRNA和蛋白表达量明显降低。通过Annexin V-FITC/PI双染法标记凋亡细胞,再经流式细胞仪进行检测,结果发现与对照组相比,JNK抑制剂作用后接毒组细胞凋亡率明显上升,差异极显着(P<0.01),此时ATF3表达量降低,说明ATF3在细胞内起到抑制凋亡的作用;同时,与对照组相比,JNK抑制剂作用后接毒组细胞周期发生阻滞。N2a细胞感染PHEV后,ATF3的表达量增高。JNK抑制剂作用于N2a细胞后,ATF3表达量下降,细胞凋亡率上升,细胞周期阻滞,DNA合成受阻,细胞活力下降,抗病毒能力下降。表明神经细胞感染PHEV后JNK信号通路可调控ATF3的表达,进而影响神经细胞凋亡和细胞周期。(本文来源于《沈阳农业大学》期刊2017-06-10）
张英俊[7]（2017）在《小鼠感染猪血凝性脑脊髓炎病毒后大脑内ATF2和ATF3表达的动态变化》一文中研究指出血凝性脑脊髓炎病毒主要感染1～3周龄的哺乳仔猪,常被称为猪血凝性脑脊髓炎病毒(Porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus,PHEV),仔猪感染后可出现明显的神经症状,病死率可达20%～100%。小鼠可感染PHEV,常作为感染PHEV的病理模型。本课题组前期研究表明小鼠感染PHEV后,激活转录因子3(Activating transcription factor 3,ATF3)的表达也增加。ATF3可作为ATF2的下游靶基因,ATF2为JNK信号通路中的一员。除JNK信号通路外,ATF3还可由P53、TGF-β/smad和c-Myc等信号通路诱导激活。但是前期研究中仅发现JNK信号通路相关因子被激活。据此推测PHEV感染小鼠后,大脑中ATF3的高表达可能是由JNK信号通路所诱导的。若此推论成立,作为调控ATF3的上游基因ATF2也应呈现高表达。为验证上述假设,本实验对感染PHEV后不同时间段的小鼠大脑中的ATF2和ATF3的表达水平进行检测。本实验首先构建了 PHEV急性感染小鼠的模型,采用颅内接种方式,以小鼠在接毒后第5天全部死亡的接种剂量最为最佳接种剂量。选取4周龄SPF雌性昆明小鼠30只,随机分两组,接毒组和对照组,每组15只。接毒组以最佳接种剂量颅内接种PHEV,对照组以相同剂量颅内接种PBS。于接毒后的第1天,2天,3天,4天,5天每组随机选取3只小鼠进行剖杀。采取大脑,一部分固定于福尔马林溶液,另一部分冻存于液氮中。固定于福尔马林溶液中的大脑用于病理组织学病变的观察;冻存于液氮中的大脑,采用Real-time PCR和Western Blot法检测ATF2和ATF3 mRNA和蛋白在大脑内的表达情况。采用2-△△Ct相对表达量检测ATF2、ATF3和PHEVmRNA的表达水平,采用半定量法检测其蛋白的表达水平,并采用SPSS 17.0软件进行数据分析和处理。结果显示,小鼠感染PHEV后主要表现为非化脓性脑炎的病理组织学变化,且随着感染时间的延长,病理损伤逐渐加重。同时,随着感染时间的延长,ATF2、ATF3与PHEV的mRNA和蛋白表达水平均呈逐渐上升趋势。经相关性分析,ATF2和ATF3的表达呈正相关(p<0.01),ATF2表达与PHEV之间呈正相关(p<0.01),ATF3和PHEV之间表达呈正相关(p<0.01)。接毒第5天达到峰值,经One-Way ANOVA分析均具有显着性差异(p<0.01)。说明小鼠感染PHEV后大脑中的病理损伤逐步加重,且随着ATF2的表达量的增高,ATF3表达和PHEV病毒载量也增高。小鼠感染PHEV后ATF3的高表达可能是JNK信号通路激活后由ATF2诱导调控的。本研究为进一步探明PHEV感染的神经细胞过程中ATF3高表达的机制指引了新方向,为深入解析PHEV的分子致病机制提供重要的理论依据。(本文来源于《沈阳农业大学》期刊2017-06-10）
尹洋[8]（2017）在《猪血凝性脑脊髓炎病毒双抗夹心ELISA抗原检测试剂盒的研制与应用》一文中研究指出猪血凝性脑脊髓炎(Porcine Hemagglutinating encephalomyelitis,PHE)是猪血凝性脑脊髓炎病毒(Porcine Hemagglutinating encephalomyelitis virus,PHEV)感染猪后引起的一种以呕吐、衰竭和显着神经症状为临床特征的急性、高度接触性传染病。成年猪多呈隐性感染。但3周龄以内的仔猪尤为易感,一旦发病,死亡率最高可达100%。目前针对PHE的诊断方法有多种,但有的需要大型仪器设备、有的容易出现假阳性或敏感性不够,使得这些方法不利于在临床上对疫情做出快速准确的诊断,在疫情紧急时,甚至阻碍了该病防治工作的快速进行。所以,本实验通过制备PHEV N蛋白单克隆抗体及其多克隆抗体,成功构建并组装双抗夹心ELISA抗原诊断试剂盒并初步用于临床检测,旨在帮助基层养殖户在疫情发生或流行时做出准确及时的判定。具体研究内容如下:1.PHEV N蛋白基因大肠杆菌表达载体的构建及N蛋白的纯化根据N蛋白基因序列,使用Primer5.0设计N蛋白表达引物。将该基因片段克隆至原核表达载体p ET-28a,成功构建重组表达载体p ET-28a-N。再将重组载体转化至大肠杆菌(BL21)中,经过IPTG诱导、SDS-PAGE和Western-blot鉴定,获得大小为55KDa的重组蛋白N。用Ni-NTA亲和层析进行重组蛋白的纯化后测定蛋白浓度,获得重组N蛋白浓度为:1659.3ug/m L、1139.1ug/m L和726.8ug/m L。2.PHEV单克隆抗体的制备将纯化的重组N蛋白,对6~8周龄健康Balb/c小鼠背部皮下多点注射,进行免疫。四次免疫之后,ELISA检测小鼠血清抗体效价,P/N>2.1时,取小鼠脾细胞与培养好的SP2/0细胞进行融合,用间接ELISA方法对融合后的细胞进行筛选。获得四株可稳定分泌抗PHEV的单克隆抗体,并进行亚类鉴定,分别是2H2(Ig G1)、2A1(Ig G1)、1E2(Ig G2a)、4D4(Ig G1);四株效价均在1:12800~1:51200之间;经Western blot分析,编号2A1可识别非结构蛋白N;经间接ELISA和间接免疫荧光鉴定,4株单抗均能与PHEV特异性结合。3.PHEV抗体阴性及阳性对照血清、兔抗PHEV多克隆抗体的制备将PHEV-67N标准毒株对健康家兔进行人工皮下注射,制备阳性对照血清及兔抗PHEV多克隆抗体。当ELISA检测血清效价达到105以上,无菌采血并分离血清作为阳性对照血清,过滤除菌之后存于-20℃中。阴性对照血清采自健康6月龄家兔,采血并分离血清后,经PCR及ELISA检测血清PHEV抗体均为阴性。对两份血清分别进行PEDV、TGEV、PCV2和PRV的ELISA检测,结果均呈阴性。4.PHEV抗原捕获ELISA检测方法的建立、试剂盒的组装及质量检测用制备的兔抗PHEV多克隆抗体包被酶标板,以抗N蛋白单克隆抗体作为检测抗体,建立双抗夹心ELISA检测方法,并对其反应条件进行优化:多抗最佳稀释倍数为8000倍;单克隆抗体最佳工作浓度为0.5μg/m L;最佳封闭液是5%BSA,时间为2h;捕获抗体(兔多抗)最佳包被时间为4℃过夜处理、检测抗体(单抗)在37℃条件下孵育1h时效果最佳;显色时间最佳为15min。经过特异性、灵敏度试验,结果显示该方法特异性良好,无交叉反应;能够检测出的最低PHEV浓度为63.12ng/m L。根据建立的检测方法,完成了对试剂盒的组装,并对其质量进行了评估:试剂盒批内变异系数(CV%)介于4.8%~9.6%之间,批间变异系数(CV%)介于3.2%~8.9%之间,均小于10%,具有良好的重复性;通过37℃加速老化试验,显示试剂盒在4℃温度下能够密封保存6个月左右;应用组装的ELISA试剂盒与实验室建立的RT-PCR检测方法分别对人工感染的小鼠和对吉林省范围内采集的200份疑似病猪进行检测,结果显示两种方法阳性检出总符合率都在90%以上。综上所述,本实验成功建立双抗夹心ELISA检测方法,完成了对ELISA检测试剂盒的组装与质量评估。经检测,该试剂盒在灵敏度、重复性及稳定性上均达到要求,为后期试剂盒的转化和市场化应用奠定了坚实的基础。(本文来源于《吉林大学》期刊2017-06-03）
丁宁[9]（2017）在《Snapin在猪血凝性脑脊髓炎病毒诱导神经细胞自噬中的功能研究》一文中研究指出猪血凝性脑脊髓炎病毒(Porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus,PHEV)属于β冠状病毒属的成员,是造成临床上感染病猪出现典型脑脊髓炎症状的主要病原体之一。PHEV主要危害仔猪,尤其是哺乳期仔猪感染后,死亡率可达20~100%。PHEV感染机体后主要导致神经损伤。在脑组织中,神经细胞是该病毒复制的场所,未见其感染胶质细胞的证据。通常情况下,病毒对细胞的入侵会激发细胞的免疫应激反应,旨在清除外源入侵的病原体以维持细胞稳态,但病毒也可利用细胞内的一些成分为其复制提供原材料,进而造成机体的损伤。细胞自噬是病原体侵害细胞过程中发挥上述作用的一个重要过程。现已证实,细胞自噬与肿瘤、神经退行性疾病、代谢相关疾病、免疫性疾病等发病过程密切相关,而且在多种病毒、细菌等病原体感染细胞过程中均有细胞自噬诱导或抑制现象的发生。如前所述,PHEV在体内主要感染神经细胞,其感染过程是否能诱导神经细胞的自噬现象,目前尚未见报道。因此,为了明确PHEV是否能够诱导神经细胞发生自噬,我们通过一系列自噬的相关实验对该过程进行研究。将PHEV感染小鼠神经瘤母细胞(N2a细胞),通过透射电镜观察发现,在胞浆内有典型的双层或单层膜结构的自噬体生成。此外,利用间接/直接免疫荧光以及Western blot实验,发现PHEV能够促使GFP-LC3在N2a细胞内形成荧光聚点,并促进LC3蛋白的型别转化,说明PHEV感染能够诱导神经细胞自噬的发生。然而,在PHEV感染的过程中,自噬底物蛋白p62蛋白并没有发生降解,同时利用氯喹(CQ)处理后,PHEV的感染也显着下调。随后,针对自噬溶酶体降解的过程我们进行了进一步的研究,在串联标记的荧光报告基因mRFP-GFP-LC3(ptfLC3)转染N2a细胞,以及利用酸性晚期内体和溶酶体标记物LysoTracker标记N2a细胞中,我们发现PHEV感染组中,自噬体并没有与溶酶体融合,ptfLC3荧光报告质粒显示未淬灭,并且GFP-LC3与LysoTracker也未见共定位的现象。同时,针对溶酶体相关膜蛋白1(LAMP1)的表达情况进行分析表明,PHEV感染导致LAMP1发生了异常积累,并随感染时间的延长而加剧,进一步说明PHEV抑制了自噬体与溶酶体的融合。根据上述研究结果,说明PHEV能够诱导自噬并引起一种不完全的自噬效应。为了进一步明确PHEV诱导神经细胞自噬的机制,我们利用酵母双杂交系统筛选PHEV在诱导自噬过程中的互作蛋白。经过初步筛选以及测序鉴定,得到14个候选的互作基因,对结果进行分析,确定Snapin蛋白可能参与PHEV诱导自噬的过程。Snapin蛋白是一种新型的小分子蛋白,其不仅在囊泡运输机制中发挥转运功能,并且在晚期内体的降解以及自噬溶酶体形成过程中发挥重要作用。随后,我们首先利用酵母双杂交回转实验、免疫共沉淀以及直接/间接免疫荧光等方法,验证了二者之间的相互作用。在细胞中过表达Snapin蛋白后感染PHEV,病毒的复制并没有发生明显的改变,而利用siRNA干扰细胞内源性Snapin蛋白的表达后感染PHEV,却发现病毒的复制量受到明显抑制。同时,对LAMP1进行检测发现,自噬溶酶体的积累与对照组相比明显增多。该结果进一步证实了Snapin蛋白参与了PHEV感染的过程,并很有可能与PHEV诱导不完全自噬效应有关。上述结果不仅为PHEV致神经损伤的机制研究奠定了基础,而且将为其能够作为神经退行性疾病模型提供重要的理论依据。(本文来源于《吉林大学》期刊2017-06-01）
单长见[10]（2016）在《猪血凝性脑脊髓炎病毒重组N蛋白间接ELISA检测方法的建立与应用》一文中研究指出猪血凝性脑脊髓炎病毒(Porcine Hemagglutinating encephalomyelitis virus,PHEV)属于β-冠状病毒属成员,可引起仔猪发生猪血凝性脑脊髓炎(Porcine Hemagglutinating encephalomyelitis,PHE)。PHE 是一种高度接触性的急性传染病。发病仔猪在临床上以明显的神经症状或呕吐、衰竭、下痢为主要特征,死亡率可达100%。该病一旦暴发流行,其危害十分严重。目前,针对PHE已经建立了多种诊断方法:电镜观察、巢式PCR、RT-PCR、LAMP、Real-time PCR、血清中和试验等。这些方法虽在PHE的鉴别诊断中发挥重要作用,但也存在操作繁杂,耗时费力等不足之处。此外,虽然本课题组前期以纯化的PHEV全病毒作为包被抗原建立的检测PHEV血清抗体的ELISA(HEV-ELISA)方法具有操作简单、廉价、敏感性和特异性强等特点,但是该方法存在抗原制备困难和容易散毒的缺点。因此,建立一种安全、简便、高特异性和敏感性的诊断方法应用于临床PHE的诊断显得尤为重要。冠状病毒核衣壳蛋白(N)高度保守,在病毒的结构蛋白中所占比例较大,在感染早期即可检测到抗N蛋白的高水平抗体,因此N蛋白作为诊断抗原在检测病毒感染和评价疫苗免疫效果中具有重要的应用价值。为建立包被抗原制备简易以及操作过程更加安全的间接ELISA方法,本研究首先根据GenBank上发表的PHEVN蛋白基因序列,设计合成特异性引物,再经PCR扩增、连接、转化和酶切鉴定等过程,成功构建了 PHEV N蛋白原核表达重组质粒pET28a-N;将其转入BL21(DE3)表达菌中,用IPTG诱导表达,经菌体的超声破碎、尿素变性和亲和层析法纯化等得到目的蛋白;SDS-PAGE检测结果表明:PHEV重组N蛋白主要以包涵体的形式在大肠埃希菌中表达,纯化后成功获得浓度较高,大小约为55 kDa的融合蛋白。而Western blot检测发现纯化的重组N蛋白能被PHEV或PHEV N蛋白的阳性血清所识别,表明纯化后的蛋白具有良好的免疫原性。之后,本研究以纯化的重组N蛋白作为包被抗原,通过方阵试验确定了抗原的最适包被浓度为2 μg/mL,酶标二抗的最佳稀释倍数为1:10000等条件,成功建立了用于PHEV血清抗体检测的间接ELISA方法(N-ELISA)。最后,我们用该方法对天津市地区采集到的200份猪血清样品进行检测,阳性检出率为83.5%,而与HEV-ELISA检测出率相比,符合率为90.91%;而应用该方法对PHEV与PRV、TGEV、PEDV、CSFV等进行检测,发现并无交叉反应,表明该方法具有较好的敏感性和特异性。总之,以重组N蛋白为包被抗原所建立的用于PHEV血清抗体检测的ELISA方法不仅能够用于检测PHEV感染和相关的流行病学调查,而且还能为PHE的临床鉴别诊断提供新思路。(本文来源于《吉林大学》期刊2016-10-01）
猪血凝性脑脊髓炎病毒论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
猪血凝性脑脊髓炎(Porcine hemagglutinating encephalomyelitis,PHE)是由β冠状病毒属的猪血凝性脑脊髓炎病毒(Porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus,PHEV)引起的一种呈全世界范围内分布的高度接触性、急性传染病。临床上该病多见于叁周龄以内的仔猪,且常常表现出两种不同的临床症状。呕吐消瘦型:可引起患病仔猪呕吐、腹泻、衰竭等症状;脑脊髓炎型:可引起患病仔猪出现明显的神经震颤、尖叫等症状,患病仔猪的死亡率可达100%。目前对于猪血凝性脑脊髓炎并无有效的预防和治疗措施,一旦爆发会给养猪业带来巨大的经济损失。PHEV主要侵害宿主的神经系统,但其所致神经损伤的具体机制尚未完全阐明。长链非编码RNA(Long noncoding RNA,lncRNA)为不具有编码能力或具有很少编码能力的RNA分子,广泛存在于真核生物中。研究发现,多种病毒感染过程都伴随着LncRNA的差异表达,如乙肝病毒、丙肝病毒、鸡马立克病毒和巨细胞病毒等,而PHEV的感染是否会引起宿主体内LncRNA差异表达以及其在该病毒致病过程中发挥的作用还未见报道。因此,从LncRNA角度探讨PHEV诱导神经元损伤的机制将有助于阐明猪血凝性脑脊髓炎发病机制。鉴于此,本实验在PHEV感染小鼠模型的基础上,首先利用高通量测序技术研究PHEV致小鼠脑损伤过程中大脑皮质区LncRNA的表达变化,发现与对照组相比,PHEV感染小鼠大脑皮质LncRNA表达谱发生显着变化,筛选得到1407个差异表达的mRNA,其中上调mRNA共1270条,下调mRNA共137条;110条差异表达LncRNA,其中上调LncRNA 83条,下调LncRNA 27条。利用LncTar软件基于序列互补原理完成LncRNA靶基因的预测。分别对差异mRNA和差异LncRNA绘制火山图,发现差异mRNA的表达量和表达倍数均高于差异LncRNA的变化;利用GO分析从生物过程、分子功能和细胞组成叁个部分完成对差异mRNA和LncRNA的功能注释;利用KEGG分析从遗传信息、环境信息、有机系统、细胞进程、代谢等方面完成对差异mRNA和LncRNA的功能注释。通过对差异mRNA与LncRNA长度、外显子数目和ORF长度等方面对二者基因结构进行对比,为后续挖掘LncRNA功能提供实验依据。为检验高通量测序的可靠性,抽取差异表达的mRNA和LncRNA,利用qPCR方法检测其在细胞和组织水平上表达情况。qPCR结果与测序结果一致,证实高通量测序结果真实、可靠。从数据库中选择上调明显的NONMMUT006579.2和NONMMUT131476.1两条LncRNA为研究对象,利用qPCR方法对PHEV感染宿主过程中NONMMUT006579.2和NONMMUT131476.1的表达量进行检测。结果显示,与对照组相比,NONMMUT006579.2和NONMMUT131476.1表达量明显上调,推测这两条LncRNA可能参与PHEV感染宿主过程。为验证这一推测,对N2a细胞转染NONMMUT006579.2 siRNA或过表达载体,接种PHEV后,qRCR结果显示,RNAi或过表达NONMMUT006579.2对PHEV的复制没有影响;而对N2a细胞转染NONMMUT006579.2 siRNA,qPCR和Western blotting方法检测其对PHEV增殖的影响,结果显示,降低NONMMUT131476.1表达后,PHEV复制量增加,即NONMMUT131476.1负向调控病毒复制增殖。LncRNA可通过调控相关靶基因的差异表达来发挥生物学的调控作用,为进一步研究差异LncRNA(NONMMUT006579.2和NONMMUT131476.1)的调控作用,本实验利用LncTar软件对可能造成脑损伤LncRNA的靶基因进行预测并与高通量测序结果进行对接,发现这些靶基因参与生态行为、内吞作用、遗传信息、生理代谢、细胞进程和免疫应答等生物学过程,如与胞吞途径相关的Washc4基因可能为NONMMUT006579.2的顺式靶基因,而与先天免疫相关的Nlrc5可能为NONMMUT131476.1顺式靶基因。为进一步研究差异LncRNA(NONMMUT006579.2和NONMMUT131476.1)的表达是否在PHEV感染过程中影响Washc4和Nlrc5的表达。N2a细胞转染NONMMUT006579.2过表达载体或siRNA后,接种PHEV,通过qPCR检测,结果显示,Washc4的表达与NONMMUT006579.2的表达呈现正相关;而转染NONMMUT131476.1 siRNA后接种PHEV,结果显示,Nlrc5的表达与NONMMUT131476.1的表达呈现正相关,推测Washc4为NONMMUT006579.2的靶基因,Nlrc5为NONMMUT131476.1的靶基因。综上所述,本实验完成了PHEV感染后宿主大脑皮质差异LncRNA的筛选以及差异LncRNA与差异mRNA的互作分析。PHEV感染宿主后引起NONMMUT006579.2和NONMMUT131476.1上调表达,而上调表达的NONMMUT006579.2和NONMMUT131476.1又分别正向调控Washc4和Nlrc5的表达,同时NONMMUT131476.1又可负向调控PHEV的复制。实验数据将对LncRNA在PHEV感染中的作用提供支持并为抗PHEV感染的治疗方案提供理论依据。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
猪血凝性脑脊髓炎病毒论文参考文献
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标签：猪血凝性脑脊髓炎病毒; 病毒入侵; 纤维形肌动蛋白; cofilin;