（湖州师范学院医学院浙江湖州313000）
【摘要】黄连素作为治疗腹泻和糖尿病的中药已经被广泛使用了数十年，最近G蛋白偶联受体GPR40已被确定为是黄连素的受体。GPR40在胰岛素分泌细胞中大量表达，它与促进胰岛素分泌和低血糖密切相关。激活的GPR40偶联到Gq蛋白上并且增加细胞内Ca2+浓度，已成为作了一种新的治疗2型糖尿病的靶点。在目前的研究中，我们使用CHO细胞系，发现随着GPR40介导的钙的增加，黄连素以剂量依赖性方式活化ERK1/2和AMPK。此外，为了研究黄连素降血糖效果,我们采用腹腔注射葡萄糖和黄连素,发现黄连素较GPR40内源性配体亚油酸更显著的降低血糖浓度。总之，我们的研究可能为黄连素通过GPR40诱导ERK1/2和AMPK磷酸化提供新的药理作用和生理功能机制。
【关键词】黄连素；GPR40；Ca2+；ERK1/2；AMPK
【中图分类号】R285.5【文献标识码】A【文章编号】1007-8231（2017）07-0260-04
缩写
细胞外信号调节激酶1和2，ERK1/2；腺苷5’-磷酸腺苷活化蛋白激酶，AMPK；亚油酸，LA；黄连素，黄连素；磷酸二酯酶，PDEs；3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，IBMX；肌醇1,4,5-三磷酸，IP3；甘油二酯，DAG；蛋白激酶C，PKC；蛋白激酶A，PKA；百日咳毒素，PTX；葡萄糖刺激的胰岛素分泌，GSIS；游离脂肪酸，FFAs；表皮生长因子受体，EGFR；钙/钙调蛋白依赖的蛋白激酶，CaMKK
1.简介
黄连素（黄连素）是一种季铵盐属于异喹啉类生物碱，存在于多种植物之中，包括俄勒冈葡萄、伏牛，和黄连根茎[1]。黄连素具有包括抗微生物活性、抗炎、降血糖、降血脂、抗高血压等多种生物和药理作用[2,3]。其中，黄连素也起到显著的降血糖和降血脂的作用，可以用于治疗2型糖尿病及其并发症[4,5]。最近的研究表明，黄连素能增加胰腺β细胞分泌胰岛素，改善胰岛素的敏感性，调节肝脏葡萄糖和脂质代谢，减少肠道对葡萄糖的吸收[6]。然而，黄连素介导胰岛素分泌和敏感性的机制仍不清楚。有趣的是，最近的一份报告表明黄连素是GPR40的一种理想的激动剂[7]。在GPR40内源性表达Min6细胞系和在胰腺β细胞中，黄连素诱导葡萄糖刺激的胰岛素分泌（GSIS）和胰高血糖素样肽（GLP-1）分泌[8,9]。因此，有理由相信由黄连素介导的抗糖尿病功能可能与GPR40下游信号通路的激活相关。
几乎所有的G蛋白偶联受体信号通过ERK信号通路，从而调节多种细胞过程，包括细胞增殖、分化、迁移、存活和凋亡[10]。据观察，在乳腺癌细胞MCF-7，用油酸和n-3脂肪酸的MDA-MB-231细胞中，GPR40诱导ERK1/2可通过不同的机制包括：EGFR—依赖的激活和EGFR—非依赖激活[11]。此外，在小鼠胚胎干细胞中，亚油酸通过p44/42MAPK信号调节细胞周期蛋白[12]。相矛盾的是，在NIT-1细胞中，不饱和脂肪酸诱导GPR40下游ERK1/2活化的已被证明与脂毒性有关[13]。然而，黄连素调节GPR40介导ERK1/2激活的途径的潜在机制尚未研究。此外，我们对GPCR和AMPK信号通路之间的联系还知道的太少。然而，黄连素上调AMPK可显著提高胰岛素敏感性[14]。同时，通过GPR40/AMPK通路，GPR40的合成激动剂GW9508，也能抑制HepG2细胞中的脂质积累[15]。因此，我们推测，GPR40在黄连素介导的AMPK活化中可能是一个关键角色。
目前的研究阐明了GPR40介导ERK1/2和AMPK激活的信号通路是通过黄连素。我们的研究结果可能提供了新的证据，有助于定义GPR40介导ERK1/2和AMPK磷酸化的分子机制。
2.材料与方法
2.1材料
细胞培养基和胎牛血清从Hyclone获得。脂质体2000，G418，和Opti-MEM购自Invitrogen公司。FLAG的构建向量购买自Sigma。3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)来自Calbiochem，anti-phospho-ERK1/2(Thr-202/Tyr-204)，anti-ERK1/2antibodies,anti-AMPKantibodies,anti-AMPKα(Thr172)和horseradishperoxidase-conjugatedanti-rabbitIgG来自CellSignalingTechnology。
2.2细胞培养
cho-k1细胞单层培养在50:50的DMEM培养基中/10%的Ham’sF-12包含胎牛血清（FBS）和2mm谷氨酰胺。质粒转染或共转染到CHO-K1细胞中，用脂质体2000，根据制造商的指示。所有细胞均培养在37℃，5%的二氧化碳，95%的空气的潮湿环境中。
2.3cAMP测定
在6孔板培养12小时之后，为了荧光素酶活性检测，CHO-K1细胞被瞬时共转染野生型GPR40和pCRE-luc（cAMP反应元件）。24h后，细胞分到96孔板中。当细胞达到90～95%的细胞密度，细胞用50μM3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）刺激，在非选择性磷酸二酯酶（PDE）抑制剂和激动剂或单独激动剂GPR40的无血清的DMEM培养4h37℃。荧光素酶活性由荧光素酶检测试剂盒检测，根据试剂盒的方法。
2.4细胞内Ca2+的测量
flag-GPR40转染CHO细胞接种于6孔板再使用4μMFura-2乙酰氧基甲基酯衍生物37℃孵育30分钟。然后，细胞在Hank溶液洗涤两次，悬浮在HanksBuffer，在室温培养15min，在Hanks中溶液洗涤两次，并悬浮在Hanks溶液中，浓度为4×107细胞/毫升，其次是用不同浓度的黄连素刺激。使用Tecan多功能酶标仪在340nm和380nm的激发下测量瞬时钙通量。
2.5蛋白免疫印记分析
为了分析ERK1/2和AMPK的活化，CHO-K1细胞用FLAG-GPR40瞬时转染，在24孔板上成长至80%细胞密度，用无血清DMEM/F-12培养基洗涤并且饥饿12h在无血清培养基中，以减少ERK1/2或AMPK的活化背景。在不同时间和浓度黄连素刺激之后，细胞用RIPA缓冲剂裂解。等量的总细胞裂解液经10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳转移到PVDF膜。膜封闭在封闭液中（TBS含0.1%Tween20和5%的脱脂奶粉）室温培养1h，然后用单克隆抗pERK1/2抗体或pAMPK抗体培养1～2小时。印迹用羊抗兔二抗抗体孵育1小时：然后用HRP探测，化学发光用HRP底物检测。Total-ERK1/2，total-AMPK抗体被评定为对照组，用HRP底物并探测化学发光。
2.6腹腔葡萄糖耐量试验
六周龄的小鼠（n=5）禁食过夜。对照（0.9%生理盐水）或黄连素（2.5mg/kg）和亚油酸（240mg/kg）腹腔注射（I.P.），在腹腔注射葡萄糖液（15%）的30分钟前。不受激动剂GPR40的组给予15%葡萄糖，注射生理盐水代替激动剂。血液样本通过尾静脉获得。在规定的时间段用血糖计测定血糖。
2.7数据分析
所有的结果表示为N的数据平均±SE使用非线性曲线拟合分析（GraphPad5软件）得到pEC50值。统计意义采用学生t检验。小于或等于0.05的概率值被认为是有意义的。
3.结果
3.1黄连素刺激CHO-K1细胞中GPR40激活cAMP和Ca2+情况
众所周知，GPR40是G蛋白Gq蛋白类中的一类耦合蛋白。GPR40在细胞内的信号级联通路的传导是通过相关的IP3、甘油二酯（DAG）的改变以及胞内钙离子浓度的升高来实现的，而cAMP的水平并没有发生改变。然而，我们之前的研究显示用亚油酸在forskolin存在下，GPR40稳定表达的HEK293细胞中共转染的pCRE-luc质粒，刺激下荧光素酶活性急剧升高[6]，表明cAMP浓度的增加是通过亚油酸和forskolin共同激活GPR40下游信号而导致的结果。为了研究黄连素在CHO-K1细胞中是否激活了cAMP，我们采用一种非选择性的磷酸二酯酶（PDE）的抑制剂，3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX），它具有与forskolin相同的功能，可以增加基础cAMP水平。我们用IBMX共孵育或单独孵育GPR40内源性配体以及黄连素。如图1A所示，单独使用GPR40的激动剂或者IBMX在GPR40-CHO-K1细胞中并没有观察到cAMP活性的显著上升。然而，通过用IBMX共孵育刺激内源性配体，GPR40过表达的CHO-K1细胞可以观察到荧光素酶活性显著增加。相比之下，与细胞共同孵育的使用了黄连素和IBMX培养的GRP40-CHO-K1细胞并未发现CRE驱动的荧光素酶活性的增加。这表明，黄连素引发了不同的蛋白信号通路激活因子而不是激活GPR40的内源性激动剂。然后，我们使用钙离子探针Fura-2检测黄连素作用于GPR40表达的细胞的胞内Ca2+浓度变化。如图1B所示，黄连素在flag-gpr40表达CHO-K1细胞中的剂量依赖性Ca2+快速增长。
3.2黄连素刺激CHO-K1细胞中GPR40磷酸化ERK1/2和AMPK
众所周知，激活的G蛋白偶联受体信号可以激活ERK1/2信号通路，其功能在涉及增殖、分化、凋亡，也可用于评估GPCR功能的重要指标之一(Ahn,Kim,2009,Lorenz,Schmitt,2009)，我们接下来，采用10μM、1μM、0.1μM、0.01μM和0.001μM黄连素刺激GPR40稳转细胞株，收集细胞后，用Westernblot的方法标记ERK1/2，发现黄连素诱导的GPR40转染CHO-K1细胞的浓度依赖性激活ERK1/2和并测到其EC50为1.795μM（图2A和B）。G蛋白偶联受体通过影响第二信使的水平来调节多种信号转导机制，比如cAMP的改变可以影响细胞的活性[6]。然而令人惊讶的是，GPCR信号对细胞的代谢开关AMPK的影响还有待深入研究。为了深入检测是否是GPR40介导的黄连素诱导AMPK的磷酸化，细胞在被黄连素预处理后进行了饥饿处理然后通过Westernblot分析。如图2C和D所示，黄连素发起浓度依赖性激活AMPK在并测得其EC50为6.247nm。综上所述，这些结果表明，黄连素确实是通过GPR40来介导ERK1/2和AMPK信号通路的磷酸化。
3.3黄连素腹腔注射降糖作用
为了进一步评估黄连素用于治疗2型糖尿病的潜在影响，我们研究了黄连素对糖耐量的影响。六周龄的小鼠（n=5）禁食过夜。对照（0.9%生理盐水）或黄连素（2.5mg/kg）和亚油酸（240mg/kg）腹腔注射（I.P.），在腹腔注射葡萄糖液（15%）的30分钟前。不受激动剂GPR40的组给予15%葡萄糖，注射生理盐水代替激动剂。血液样本通过尾静脉获得。在规定的时间段用血糖计测定血糖。结果发现野生型小鼠腹腔注射黄连素（2.5mg/kg）降低血浆葡萄糖水平（图3B）的效果比使用亚油酸（240mg/kg）对葡萄糖耐量（图3A）的效果更好。表明，黄连素具有较好的降血糖功能，并且其能激活GPR40下游通路，因此，黄连素通过GPR40哪条信号通路发挥降血糖功能有待进一步证实。
4.讨论
长链脂肪酸治疗对胰腺细胞葡萄糖依赖性胰岛素分泌有放大作用，GPR40是由长链脂肪酸的受体并主要表达在胰腺β细胞[16]。有趣的是，GPR40促进葡萄糖介导的胰岛素释放只有在高浓度葡萄糖时，低血糖水平不会导致低血糖风险。因此，GPR40已成为一个潜在的治疗目标对于2型糖尿病患者的治疗。目前，GPR40激动剂已有在临床试验中测试，比如TAK-875，血糖控制显著，无低血糖风险。虽然TAK-875经历了I期和II期临床试验[17]，但临床开发的最终因肝损伤的终止。因此，这些化合物的长期安全性仍然存在问题，寻找安全有效的GPR40配体是一个迫切需要解决的问题。
黄连素已被确定为一个新的脂肪酸受体GPR40激动剂，主要功能是胰腺中的胰岛素增敏剂和胰岛素促分泌剂[7]，而其与GPR40有密切关系。因此，在我们的初步实验中，以CHO-K1细胞系作为一种表征GPR40受体信号通路的细胞模型系统，我们用GPR40转染的CHO-K1细胞系的鉴定黄连素的功能。首先，在黄连素、IBMX刺激诱导的Cre重组酶驱动的荧光素酶活性，GPR40在亚油酸和IBMX存在未检测到。此外，我们发现转染GPR40的CHO细胞具有浓度依赖性的细胞内钙动员来响应黄连素。这些检测表明黄连素确实是GPR40的配体。
有越来越多的证据表明，黄连素介导的ERK1/2的激活在各种生理功能起着至关重要的作用，是公认的对1型糖尿病治疗的一个潜在靶点[18]。因此，在了解ERK1/2信号方面有极大的兴趣。此外，越来越多的证据表明，黄连素对代谢紊乱包括减肥、抗脂肪的有益作用、抗炎、降血糖的作用都与AMP激活的蛋白激酶（AMPK）磷酸化相关[14,19-21]。然而，GPR40的具体机制介导的AMPK的活化反应，黄连素还不清楚。接下来，我们需要确认是否黄连素介导的ERK1/2和AMPK磷酸化通过GPR40激动。我们的研究结果表明，黄连素发起浓度依赖性激活ERK1/2，其EC50值为1.795μM，也磷酸化AMPK，其EC50为6.247nM。为了更好地理解黄连素在2型糖尿病的潜在影响，我们检测了黄连素在腹腔葡萄糖耐量试验（静脉葡萄糖耐量试验）糖耐量的影响。结果表明，野生型小鼠血浆葡萄糖水平在高峰时显著降低。
综上所述，本研究通过GPR40转染CHO-K1细胞系统，检测黄连素通过GPR40介导的各种信号通路激活。根据我们的数据，我们发现，黄连素引发的各种第二信使和蛋白激酶，包括细胞内Ca2+，ERK1/2和AMPK，但不包括cAMP。这些研究结果给GPR40信号机制研究带来新的思路，将有助于进一步阐明ERK1/2和AMPK信号通路介导的黄连素抗糖尿病的作用提供的实验依据。
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基金项目：浙江新苗人才计划，项目名称：黄连素通过GPR40治疗糖尿病信号转导分子机制的研究，项目编号：2016R427018
黄连素介导GPR40激活cAMP和Ca2+流。A，CHO-K1细胞瞬时转染FLAG-GPR40和萤火虫荧光素酶报告基因系统CRE-Luc。转染24h后，细胞分别用PDEs的抑制剂IBMX（50μM），GPR40内源性激动剂100μM的亚油酸，100μM亚麻酸和10μM的丙酸，10μM黄连素，以及IBMX与GPR40的内源性激动剂亚油酸或丙酸或黄连素共同刺激。通过使用萤火虫荧光素酶检测试剂盒检测报告基因活性。B.CHO-K1细胞用FLAG-GPR40瞬时转染，24h后，用10μM、1μM和10nM黄连素刺激细胞，并使用多功能酶标仪测定F340/F380比值计算钙流。
图2：黄连素介导GPR40激活ERK1/2和AMPK信号。表达GPR40的CHO-K1细胞使用DMEM/F12的培养基进行饥饿处理18-24h，随后用不同浓度的黄连素处理10分钟。A，采用10μM、1μM、0.1μM、0.01μM和0.001μM浓度黄连素处理细胞，以PBS作为对照，用Western印迹检测p-ERK1/2和total-ERK，相应的免疫印迹由Bio-RadQuantityOne成像系统量化，并测算EC50（B）。C，采用10μM、1μM、0.1μM、0.01μM和0.001μM浓度黄连素处理细胞，以PBS作为对照，用Western印迹检测p-AMPK和total-AMPK，相应的免疫印迹由Bio-RadQuantityOne成像系统量化，并测算EC50（D）。