刘永毅1范丽波2贺庆丰3
（12吉林省辽源市中心医院普外科36200；3吉林省辽源市东丰县二龙乡卫生院36200）
【中图分类号】R735.7【文献标识码】A【文章编号】1672-5085(2010)14-0126-02
【摘要】目的研究羟基喜树碱（HCPT）诱导人肝癌细胞凋亡的作用。方法用HCPT以不同终浓度诱导BEL-7402人肝癌细胞，用MTT法观察其细胞毒性。分别以倒置显微镜、电镜、荧光显微镜观察其改变。结果HCPT以剂量依赖的方式抑制BEL-7402细胞的生长。荧光显微镜和透射电镜观察到细胞皱缩、核质浓缩、核碎裂、细胞起泡以及凋亡小体形成等凋亡特征的形态学改变。结论羟基喜树碱既能抑制人肝癌BEL-7402细胞增殖，又能诱导其凋亡显示出较强的细胞毒性。
【关键词】羟基喜树碱肝癌凋亡
肿瘤在细胞过度增殖的同时，也存在细胞死亡减少。凋亡是细胞死亡方式的一种，诱导凋亡已成为肿瘤治疗的新策略[1]。羟基喜树碱是从我国南方特有植物喜树中提取的生物碱，化学结构与喜树碱相似，仅第10位碳原子上的氢为羟基取代，是目前唯一的拓扑异构酶I抑制剂，其主要作用机制是通过选择性地抑制DNA拓扑异构酶，干扰DNA的复制、转录，从而抑制肿瘤生长[2][3]。国内、外大量研究表明，喜树碱能够诱导白血病、膀胱癌，结肠癌等多种肿瘤细胞凋亡，而对国产HCPT诱导肿瘤细胞凋亡的研究较少[4][5]。本研究从HCPT抑制人肝癌细胞增殖和诱导癌细胞凋亡的角度探讨其细胞毒性，为HCPT用于临床提供理论和实验依据。
1材料和方法
1.1材料BEL-7402细胞株：吉林大学基础实验室提供。HCPT由湖北省黄石飞云制药有限公司提供，剂型为5mg/ml，用培养液稀释后以微孔滤膜过滤除菌；DMEM培养基、小牛血清、MTT购自美国Gibco公司。
1.2方法
按剂量分组：调HCPT终浓度为6.25、12.5、25.0、50.0、100.0μg/ml的含药培养基。用DMEM培养液常规培养BEL-7402细胞于37℃，5%CO2培养箱传代培养。细胞贴壁生长24小时后调细胞浓度为1×106/ml。更换含药培养基进行实验。用5Fu25.0μg/ml作为阳性对照。
MTT比色法：用酶标仪490nm处测吸光度（A）值。计算抑制率。公式：细胞抑制率%=（1-实验组A值/对照组A值）×100%。
用倒置显微镜观察处理前后细胞生长情况。透射电镜观察：分别收集悬浮及贴壁细胞，4%戊二醛固定，1%锇酸后固定，常规制片观察。荧光显微镜观察：收集细胞加等体积0.01%丫啶橙染色3min，滴于载玻片上，迅速于荧光显微镜下观察。随机取3个视野，分别计数100个细胞，其中染色质浓缩而亮染的计为凋亡细胞，淡染的细胞残骸不计。取3个视野均值为凋亡率。
统计学处理：差异显著性分析用t检验。
2结果
2.1倒置显微镜观察结果对照组细胞贴壁生长良好，加药组随剂量升高可见细胞分裂相明显减少，细胞收缩变圆浮起，折光加强，悬浮细胞逐渐增多。
2.2MTT法检测HCPT对细胞生长的影响不同浓度HCPT作用细胞后，细胞生长受到不同程度的抑制，并随HCPT浓度的升高而增强。呈现明显的剂量依赖效应。相关分析两者呈正相关。
2.3荧光显微镜观察结果对照组细胞核弥散着色，细胞间有粘附趋势。而加药组多数核亮染呈致密斑块状，少数是弱染的细胞残骸。细胞分散，无粘附趋势。随着药物浓度增加，凋亡率显著升高。
2.4电镜观察结果对照组细胞表面有丰富的微绒毛，胞质密度高，细胞器正常，核仁大而多，染色质分散，而加药组表面微绒毛消失，胞质密度增高，细胞器尚正常，核染色质固缩，沿核膜形成数个团块，可见有凋亡小体形成。当诱导剂量为50、100μg/ml时，发现有坏死细胞，表现为细胞膜破裂，内容物外溢，细胞器肿胀，核膜破裂，核溶解等。
3讨论
细胞死亡的方式有坏死和凋亡。凋亡是指细胞在一定内、外因作用下，启动内部遗传程序，通过一系列主动的生化过程，激活内源性DNA内切酶，引起DNA有控降解，而导致细胞死亡的方式[6]。凋亡的细胞有其独特的形态学及生物化学表现。本实验中用HCPT处理BEL-7402细胞后观察到典型的凋亡特征，证实HCPT能够诱导BEL-7402人肝癌细胞凋亡。MTT法显示HCPT对人肝癌BEL-7402细胞有较强的细胞毒性作用，能抑制癌细胞生长增殖，其抑制率与浓度呈明显的剂量依赖关系。荧光显微镜和透射电镜显示细胞凋亡形态学上的变化，可见细胞体积缩小，胞膜皱缩，核固缩，核质沿核膜浓缩边集，形成数个团块或境界分明的新月形小体，有的细胞核碎裂，形成由膜状物包裹内容物的凋亡小体。
本研究中，HCPT既能抑制人肝癌BEL-7402细胞生长，又能诱导其凋亡，显示较强的细胞毒性作用，诱导细胞凋亡可能是HCPT细胞毒性作用的主要机制。
参考文献
[1]刘宝瑞，刘文超.现代肿瘤化疗手册[M].西安：世界图书出版公司，2000.107.
[2]贾筱琴，王正兵.陈兵.等.重组TRAIL抑制7402肝癌细胞生长的实验研究[J].实用临床医药杂志，2004，8（6）：22.
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[5]李祥武，谷文韬，梁兆玉.羟基喜树碱经肝动脉介入治疗原发性肝癌的临床总结[J].中国肿瘤临床，2000，27（5）：396.
[6]郑筱萸.中药新药临床研究指导原则[S].北京：中国医药科技出版社，2002：211.