导读:本文包含了糖蛋白膜外区论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:新城疫病毒,血凝素神经氨酸酶,蛋白纯化
糖蛋白膜外区论文文献综述
商雨,李丽,樊叁铃,李林涛,唐国毅[1]（2019）在《新城疫病毒HN蛋白膜外区的纯化》一文中研究指出血凝素神经氨酸酶(HN)是新城疫病毒(NDV)囊膜表面的糖蛋白之一,其在病毒表面的含量非常丰富,影响NDV的很多生物学特性,如热稳定性等。利用TritonX-100破坏病毒囊膜结构,分离囊膜糖蛋白,最后通过蛋白酶酶切和高速离心的方法获得了较为纯净的HN蛋白胞外区的蛋白样品,建立了从NDV粒子上纯化HN蛋白胞外区的方法。利用该方法获得的HN蛋白样品可以保持天然蛋白的结构、化学修饰和功能,能够更好地用于研究HN蛋白结构功能和生物学特性的形成机制,为新城疫病毒的基础研究、新城疫病毒载体改良应用和新城疫疫苗的研发奠定了基础。(本文来源于《动物医学进展》期刊2019年09期）
黄俊华[2]（2017）在《狂犬病毒糖蛋白膜外区调控树突状细胞激活的研究》一文中研究指出狂犬病(rabies)是由狂犬病毒(Rabiesvirus,RABV)引起的损伤中枢神经系统的人兽共患传染病,一旦发病后死亡率几近100%。据统计,全世界每年有不少于59000人死于狂犬病,我国是狂犬病高发的国家之一。RABV为单股负链RNA病毒,基因组全长约12kb,其基因组共编码五个结构蛋白,按病毒RNA 3'→5'方向分别是N、P、M、G和L蛋白,其中G蛋白是唯一暴露在狂犬病毒表面的囊膜蛋白,是病毒进入机体后引起先天性免疫应答的最主要抗原。据报道,狂犬病毒激活DC是与其G蛋白特异相关的。狂犬病毒固定毒株能引起高水平的DC激活,从而激起机体免疫应答,产生大量的中和抗体;而街毒株狂犬病毒不能激活DC,不诱导机体产生中和抗体,从而逃逸机体先天性免疫应答。本实验室之前的研究表明,狂犬病毒街毒株G蛋白结合和进入DC的效率较低,不易引起DC激活,从而使病毒逃逸先天性免疫应答。因此,街毒株的免疫逃逸是由病毒的G蛋白决定的。但是G蛋白上调控这种逃逸机制的结构域或关键位点并不清楚。另外,大量研究表明狂犬病毒街毒株G蛋白的表达量比固定毒株G蛋白的表达量显着降低。然而狂犬病毒街毒株G蛋白介导的免疫逃逸是否与G蛋白的表达量有关尚未得到验证。本研究以固定毒株B2c和街毒株SHBRV-18为研究对象,在B2c反向遗传操作平台的基础上,将B2cG蛋白的各功能结构域(包括信号肽、膜外区、跨膜域和膜内区)分别替换为SHBRV的对应序列,拯救出嵌合各功能域的重组病毒。通过测定各病毒的生长动力学曲线和病毒感染细胞后的荧光斑大小,发现B2cG蛋白的信号肽、跨膜区、膜内区突变为SHBRV对应结构域的重组病毒感染细胞后在细胞间的扩增能力及最高滴度没有显着改变;而B2c G蛋白全长序列或者G蛋白膜外区突变为SHBRV对应结构域的重组病毒感染细胞后在细胞间的扩增能力及最高滴度均显着降低。因此,狂犬病毒感染细胞和在细胞上增殖能力是由G蛋白的膜外区决定。为了研究G蛋白表达水平调控区域,将各个重组的狂犬病毒感染细胞后,对重组病毒在细胞内或者细胞膜上的表达水平进行定量分析。western blot结果表明,将B2c G蛋白的膜内区突变为SHBRV的对应序列后,获得的重组病毒(rB2c/SHB-Gct)在细胞内G蛋白表达水平显着降低。同时,流式细胞术和激光共聚焦的结果也表明该重组病毒在细胞膜表面的量与SHBRV相似,均显着低于B2c。因此,狂犬病毒G蛋白的表达水平是由G蛋白自身的膜内区来调控的。同时利用流式细胞术对各重组病毒激活DC的水平进行统计分析,发现B2c G蛋白膜外区替换为SHBRV对应区域之后,得到的重组病毒(rB2c/SHB-Get)丧失了激活DC的能力。G蛋白表达量显着降低的重组病毒rB2c/SHB-Gct激活DC的水平有一定程度的下调,但与rB2c相比,无显着差异。为进一步研究膜外区调控DC激活的机制,对重组病毒吸附和进入DC的能力进行研究发现,当B2c G蛋白的膜外区突变之后,病毒吸附和进入DC的能力显着降低。因此,狂犬病毒G蛋白膜外区决定了病毒感染DC的能力,从而调控DC的激活。综上所述,我们的研究结果阐明了狂犬病毒G蛋白的膜外区决定了病毒吸附和进入到DC内的能力和DC激活的水平。因此,狂犬病毒激活DC的水平主要依赖于G蛋白膜外区介导病毒感染DC的能力,而不是由G蛋白的表达量来决定。(本文来源于《华中农业大学》期刊2017-06-01）
张静远[3]（2017）在《基于RABV糖蛋白膜外区的阻断ELISA抗体检测方法建立及应用》一文中研究指出狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)引起的一种具有极高致死性的人兽共患传染病,能够感染人和温血动物。全球每年因该病死亡的人数在60000人左右。目前该病尚无有效的治疗方法,感染人一旦出现症状,病死率100%。但只要进行有效的暴露后处置,就可100%预防本病的发生。由于犬是本病的重要贮存和传播宿主,针对犬进行免疫可有效预防本病的发生,防止其向人群的传播。业已证明,70%的犬只免疫覆盖率即可有效阻止狂犬病的传播。评价免疫效果及免疫覆盖率的指标是机体内RABV中和抗体的水平。目前针对狂犬病中和抗体测定的方法有多种,国际上认可的金标准方法包括动物体内中和试验和细胞中和试验。由于动物中和试验常采用较多动物,花费周期较长,目前已不多用。细胞中和试验方法有荧光抗体病毒中和试验(Fluorescent antibody virus neutralization,FAVN)和快速荧光灶抑制试验(Rapid fluorescent focus inhibition test,RFFIT)两种。但这两种方法通常需要在2~3个工作日才能完成,并涉及活毒操作,需要专业培训的技术人员,比较适合专业化的实验室使用。由于条件限制,在我国省级以下的基层实验室尚未使用以上两种试验方法开展RABV中和抗体的检测,而是大多采用ELISA的方法,进行抗体检测和免疫覆盖率监测。目前国内外报道的ELISA方法包括间接ELISA、竞争ELISA和阻断ELISA等,这些方法大多采用纯化的或部分纯化的RABV作为包被抗原。由于犬血清成分复杂,假阳性或假阴性结果在这些方法中较为常见。降低假阳性和假阴性背景是目前RABV抗体检测ELISA方法中亟待克服的问题。糖蛋白(glycoprotein,GP)是狂犬病病毒的5种结构蛋白之一,是RABV的关键蛋白。其能够影响病毒的毒力,刺激机体产生保护性病毒中和抗体(viral neutralizing antibody,VN A),诱发机体产生免疫保护反应。因此糖蛋白是检测狂犬病抗体的理想抗原。但该蛋白是一种跨膜蛋白,较难从完整病毒中获得,在重组表达中对表达体系糖基化能力的要求较高。成熟的G蛋白由叁个结构域构成:膜外区(ectodomain,ED)、穿膜区(transmembrane,TM)和细胞质区(cytoplasmic domain,CD),其中膜外区是中和抗原表位所在部位。因此,本研究采用哺乳动物表达系统,分泌表达糖蛋白的膜外区部分,并基于此表达产物和本实验室具有的、针对该糖蛋白的中和性单克隆抗体,建立了不依赖于全病毒颗粒作为包被抗原的狂犬病阻断ELISA抗体检测方法,试图降低假阳性和假阴性背景,为狂犬病提供一种可靠的、可供大规模样品免疫监测的手段。现将方法和结果报告如下:1.稳定表达狂犬病病毒糖蛋白膜外区的细胞系的构建:首先获得BD06株RABV的G蛋白膜外区基因片段,与载体pCMV-Sec酶切连接,构建重组质粒;测定HEK293细胞对筛选药物博来霉素(zeocin)的敏感性;将重组质粒转染293细胞,利用筛选药物加压得到阳性克隆;分别利用ELISA和Western Blot方法对阳性克隆表达上清的反应原性进行鉴定;同时,对得到的细胞系连续传代并冻存复苏,检测细胞系的表达稳定性。结果显示,该部分研究成功扩增得到G蛋白膜外区片段G-e1317,并将该片段成功插入表达载体pCMV-Sec,得到重组质粒pCMV-Ge;确定了700μg/ml的zeocin浓度为转染后的最佳药物筛选浓度;重组质粒转染细胞后,得到8个有zeocin抗性的细胞克隆,通过ELISA检测得到5株能够与RABV糖蛋白单抗6F12以及his标签单抗发生反应的细胞株;分别使用RABV糖蛋白单抗和his单抗进行WB,均在60kd左右得到与预期相符的目的条带;细胞系连续传至60代次后表达水平无明显变化,冻存和复苏对细胞系的表达水平也无明显影响,证实筛选得到的细胞系较为稳定。2.RABV阻断ELISA抗体检测体系的建立:利用细胞系表达的RABV G蛋白作为抗原,建立阻断ELISA抗体检测方法,并分别对ELISA体系的各步条件进行优化,包括:抗原包被液的选择、抗原包被时间和温度条件、封闭液的选择、抗原包被浓度与单抗稀释倍数的确定、酶标抗体的选择、血清反应条件的优化、洗液的选择、显色条件的优化以及抗原包被稳定剂的选用等。条件优化后,检测25份阴性血清,根据公式:检测临界PI值=阴性血清PI平均值+2×SD得到该方法的检测临界值;通过对多个血清的重复检测(批间和批内),对方法的重复性进行评价。最终,此部分研究成功确定优化后的ELISA反应体系:37℃表达上清原液包被1.5h,0.05%的PBST洗涤3次后,使用20%的阴性血清于37℃封闭2h;洗涤后,加入待检血清原液,于37℃反应45min;洗涤后,加入1:500倍稀释的6F12酶标抗体,37℃孵育1h;洗去抗体后,加入TMB显色液,于37℃条件下避光显色7min,终止显色,读取数值。加速试验的结果证明,经稳定剂处理的ELISA板在37℃保存14天后,对于不同效价血清的检测结果与当天包被板的检测结果无显着差异(P<0.05),证明稳定剂对包被抗原有较好的保护效果;同时,根据阴性血清的PI值检测结果及临界值计算公式,得到32.1%作为临界PI值;重复性评价结果显示,不同效价的血清样品在批间和批内检测中OD值的变异系数(CV)均在10%以下,证实该方法有较好的重复性。3.RABV阻断ELISA抗体检测方法的应用:分别利用FAVN和优化后的ELISA方法对364份犬血清临床样品进行检测,以FAVN为金标准,根据结果绘制ROC曲线,得到AUC值,计算在32.1%临界值下检测的敏感性和特异性,以及ELISA方法检测结果与金标方法的符合率。同时,利用Youden指数评价得到较优临界值。结果显示,对364份血清样品的检测中,以FAVN为金标准,ELISA方法的检测敏感性为88.9%,特异性为98.6%,与FAVN检测的符合率为92.6%。ROC分析得到的曲线下面积为0.964,证实该方法有很高的诊断价值。同时,根据Youden指数评价结果也显示,32.1%为较优临界值,为ELISA试剂盒产品的开发奠定基础。通过以上研究,得出以下结论:1.本研究成功构建了能够稳定表达狂犬病病毒糖蛋白膜外区的细胞系,并通过ELISA和WB证实蛋白的反应原性,为G蛋白膜外区的应用奠定了基础。2.利用细胞系表达产物和单抗建立了检测血清狂犬抗体的阻断ELISA方法,并实现了对该方法的优化,确立了阻断ELISA最佳反应条件:表达上清原液在37℃条件下包被1.5h;使用20%的阴性血清作为封闭液在37℃封闭2h;待检血清以原液加入,于37℃反应45min;之后加入1:500倍稀释的6F12酶标抗体,37℃孵育1h;以上各步之间均使用0.05%的PBST洗涤3次,最后洗去抗体后,加入TMB显色液,于37℃条件下避光显色7min;终止显色后,读取数值。3.通过对226份阳性犬临床血清样品和138份阴性临床样品的检测,证实该方法与FAVN金标准有较高的符合率(92.6%),为试剂盒产品的开发提供重要数据。通过以上研究可以看出本研究的创新点包括:1.首次利用哺乳动物细胞表达系统实现对RABV糖蛋白膜外区的分泌表达,并通过培养条件摸索,采用其无血清细胞培养基中的表达产物直接应用于阻断ELISA方法中的抗原包被,节省了抗原纯化成本。由于采用了RABV单一成分G蛋白作为包被抗原,减少了病毒颗粒中其他成分的反应背景。2.在国内首次采用糖蛋白的膜外区作为抗原建立了RABV阻断ELISA抗体检测方法,并验证了其与金标方法的一致性,已在实验室组装成试剂盒,为我国狂犬病免疫监测提供了又一种有效的工具和方法,对我国狂犬病大量样本的抗体监测具有实际意义。(本文来源于《中国人民解放军军事医学科学院》期刊2017-05-23）
李春明,朱晓文,赫宝双,朱琳,于铁男[4]（2016）在《水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E胞外区的真核表达及鉴定》一文中研究指出目的真核表达水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)糖蛋白E胞外区(gE_(537)),并进行鉴定。方法用Oka株VZV(VZV-Oka)感染人二倍体细胞(2BS株),提取基因组DNA,以其为模板,PCR扩增gE_(537)目的片段,克隆至载体pCI-neo,构建重组真核表达质粒p CI-neo-g E_(537)-His。大量扩增后提取质粒,转染293FT细胞,瞬时表达,经镍柱纯化,获得目的蛋白gE_(537)-His,Western blot和ELISA法进行鉴定。结果经双酶切及测序鉴定,重组真核表达质粒pCIneo-g E_(537)-His构建成功。200 mmol/L咪唑洗脱液为洗脱目的蛋白的最佳咪唑浓度。纯化产物可与鼠抗gE糖蛋白单抗于相对分子质量约90 000处发生特异性结合,且可与mAb-10、mAb-12抗gE单抗发生反应。结论利用293FT细胞成功表达了gE_(537),为其免疫原性等相关研究奠定了基础。(本文来源于《中国生物制品学杂志》期刊2016年11期）
霍耐凡,康晓平,户义,李裕昌,李靖[5]（2016）在《蜱传脑炎病毒包膜糖蛋白胞外区的真核表达优化及其在血清学检测中的效果评价》一文中研究指出目的:优化蜱传脑炎病毒包膜糖蛋白胞外区的密码子,提高其在真核系统中的表达量,为蜱传脑炎病毒感染血清的检测提供更为有效的检测抗原。方法:对蜱传脑炎病毒MDJ01株E蛋白胞外区进行真核密码子优化,获得优化的胞外区蛋白基因序列OPT-EC;将抗原基因与海肾萤光素酶基因Rluc融合构建重组质粒pc DNA3.1-Rluc-OPT-EC、pc DNA3.1-Rluc-EC,用重组质粒转染COS7细胞获得融合抗原Rluc-OPT-EC和Rluc-EC,并将融合抗原用于临床感染血清样本的免疫共沉淀检测以评价抗原的灵敏性和特异性。结果:真核密码子优化显着提高了Rluc-OPT-EC的表达量;OPT-EC的检测灵敏度可达86%以上,其对乙型脑炎病毒(JEV)感染血清、黄热病度(YFV)感染血清、禽流感病毒(AIV)感染血清和正常人血清的检测特异度高于90%,但是在西尼罗病毒(WNV)感染血清和登革病毒(DV)感染血清的检测中发生了交叉反应。结论:优化后的E蛋白胞外区蛋白作为TBEV感染的检测抗原,能够有效地区分JEV、YFV感染,但不能区分WNV和DV感染。(本文来源于《生物技术通讯》期刊2016年03期）
路静,付玉荣,伊正君[6]（2015）在《狂犬病病毒糖蛋白膜外区重组基因的表达与鉴定》一文中研究指出目的构建狂犬病病毒糖蛋白外膜区基因质粒并在大肠埃希菌中表达,为研制狂犬病病毒抗原诊断试剂盒奠定基础。方法采用RT-PCR方法扩增狂犬病病毒CTN株糖蛋白膜外区基因,目的片段与表达载体PET32a(+)分别经双酶切、胶回收后连接并转化至E.coli BL21(DE3)菌株。阳性重组菌经IPTG诱导表达,表达产物用SDS-PAGE分析后进行纯化,利用Western blot鉴定其反应原性。结果以狂犬病病毒CTN株为模板扩增的糖蛋白膜外区基因片段经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定大小为1 323bp,与理论值相符;重组质粒经酶切鉴定后转化入E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达的融合蛋白分子质量单位大小约为66.6ku,与理论值相符;重组菌在IPTG终浓度为1mmol/L,诱导时间为4h,温度为37℃时蛋白表达产量最高。该融合蛋白主要以包涵体形式存在,可被His标签抗体识别。结论成功表达了狂犬病病毒糖蛋白膜外区蛋白,该蛋白反应原性良好,为研制狂犬病病毒抗原诊断试剂盒奠定了基础。(本文来源于《中国病原生物学杂志》期刊2015年08期）
刘宗梁,付钰广,吉艳红,李郁,魏建忠[7]（2013）在《鸭坦布苏病毒E蛋白膜外区的原核表达与鉴定》一文中研究指出为获得鸭坦布苏病毒(duck Tembusu virus,DTMUV)E蛋白膜外区的表达产物,以DTMUV安徽分离株(AH10)E基因序列设计特异性引物,扩增E基因,将其克隆至原核表达载体pET-SUMO中,构建重组表达质粒pET-SUMO-E,然后将其转化至感受态细胞E.coli Rosetta(DE3)中,并以IPTG诱导表达。经SDS-PAGE检测,获得了70ku的表达产物,与预期结果相符。Western-blot分析表明,目的蛋白能与兔抗DTMUV E蛋白多克隆血清及DTMUV鸭阳性血清发生特异性反应,显示出良好的反应活性。结果表明,成功表达了E蛋白膜外区,这一成果为DTMUV疫苗制备和诊断试剂盒的研发奠定了基础。(本文来源于《中国兽医科学》期刊2013年08期）
鞠美芳,殷相平,柳纪省[8]（2012）在《狂犬病病毒aG株糖蛋白膜外区的原核表达及纯化》一文中研究指出旨在有效检测狂犬病毒抗原及抗体。以狂犬病病毒aG株为模板,反转录扩增糖蛋白膜外区基因,并进行序列测定。将目的片段与表达载体pET-32a(+)分别双酶切、胶回收后相连并转化至Rosseta(DE3)菌株。选取阳性克隆经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE和Western blotting及质谱鉴定。结果显示,在大肠杆菌中成功表达了糖蛋白膜外区。本研究为建立检测狂犬病毒抗原及抗体的ELISA诊断方法奠定了基础。(本文来源于《生物技术通报》期刊2012年09期）
鞠美芳,殷相平,柳纪省[9]（2012）在《狂犬病病毒糖蛋白膜外区密码子优化、原核表达及纯化》一文中研究指出目的有效检测狂犬病毒抗原。方法本研究利用生物信息学软件对狂犬病病毒aG株糖蛋白膜外区进行分析,采用密码子优化策略将该序列的大肠杆菌稀有密码子优化成大肠杆菌常用密码子。将优化的序列合成与表达载体pET-28a(+)分别双酶切、胶回收后连接并转化至Rosetta(DE3)菌株。挑选阳性重组表达菌经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE和Western blotting鉴定。同时对最佳表达条件进行了研究,重组菌在30℃、IPTG终浓度为0.6mmol/L、诱导表达6h时重组蛋白的表达量达到最大值。结果狂犬病病毒aG株糖蛋白膜外区通过密码子优化后能够在大肠杆菌中成功表达,表达产物具有良好的反应原性。结论该项研究为后续检测狂犬病毒抗原的ELISA试剂盒的研发建立基础。(本文来源于《中国人兽共患病学报》期刊2012年09期）
鞠美芳[10]（2012）在《狂犬病毒aG株糖蛋白膜外区原核表达及单克隆抗体的制备》一文中研究指出狂犬病又称恐水病，是急性、烈性、自然疫源性人兽共患传染病，其病原体是狂犬病病毒(Rabies virus, RABV)。目前狂犬病仍然在世界多个国家和地区广泛流行，主要发生在亚洲和非洲的一些发展中国家，我国也是狂犬病的高发区，连续8年狂犬病人报告病死数一直居我国37种法定报告传染病之首。单克隆抗体的诊断方法灵敏性高、特异性强、操作简单、价格低廉，所以在临床上很多疾病的检测和治疗中得到广泛应用。本研究利用单克隆抗体制备技术，以狂犬病毒aG株为研究材料，通过基因克隆、序列分析、密码子优化、原核表达、蛋白纯化以及单克隆抗体的制备，为建立检测狂犬病毒抗原和抗体的ELISA检测试剂盒奠定基础。本文首先从狂犬病毒aG株组织毒中成功克隆出糖蛋白膜外区片段，测序结果显示糖蛋白膜外区长1317bp，编码440个氨基酸。测序结果用NCBI中的blast软件比对分析，与GenBank中4aG株、PG株、中国疫苗株、334株的核苷酸序列相似性在99%以上，与国际标准攻毒株（CVS）的核苷酸序列相似性为93%，与日本犬用疫苗株Nishigahara株的核苷酸序列相似性为97%。由于外源基因在大肠杆菌中表达时，可能含有大肠杆菌的转录终止信号，所以本研究用稀有密码子计算器（RACC）分析目的片段，将序列中39组大肠杆菌稀有密码子优化成大肠杆菌常用密码子，然后合成基因并与原核表达载体pET-28a(+)连接，转化到表达菌Rosseta（DE3）后进行IPTG诱导表达。研究表明，重组菌在30℃IPTG终浓度为0.6mM，诱导6h后，重组蛋白表达量最多。Western boltting检测证明表达产物具有较好的反应原性。用默克公司的His·Tag蛋白亲和层析纯化重组蛋白。间接ELISA法确定了检测犬RV抗体的抗原最佳包被量是1.725μg/mL，血清的最佳稀释度为1:200，HRP标记的二抗的稀释度为1:50000。将纯化的重组蛋白与弗氏佐剂乳化，免疫Balb/c小鼠3次，然后用重组蛋白加强免疫1次，取免疫小白鼠的脾细胞与sp2/0细胞融合后经过叁次亚克隆和间接ELISA实验进行筛选，最终获得两株稳定分泌阳性单抗的杂交瘤细胞株(4B7和1F10）。ELISA实验证明，2株杂交瘤细胞所分泌的抗体亚型分别为lgG2b和IgM；杂交瘤细胞的染色体数目分别约为95和103条；纯化后腹水效价均为1：25600；McAb特异性良好，有较高的稳定性；为后续RV抗原检测试剂盒的研发做好铺垫。(本文来源于《中国农业科学院》期刊2012-05-01）
糖蛋白膜外区论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
狂犬病(rabies)是由狂犬病毒(Rabiesvirus,RABV)引起的损伤中枢神经系统的人兽共患传染病,一旦发病后死亡率几近100%。据统计,全世界每年有不少于59000人死于狂犬病,我国是狂犬病高发的国家之一。RABV为单股负链RNA病毒,基因组全长约12kb,其基因组共编码五个结构蛋白,按病毒RNA 3'→5'方向分别是N、P、M、G和L蛋白,其中G蛋白是唯一暴露在狂犬病毒表面的囊膜蛋白,是病毒进入机体后引起先天性免疫应答的最主要抗原。据报道,狂犬病毒激活DC是与其G蛋白特异相关的。狂犬病毒固定毒株能引起高水平的DC激活,从而激起机体免疫应答,产生大量的中和抗体;而街毒株狂犬病毒不能激活DC,不诱导机体产生中和抗体,从而逃逸机体先天性免疫应答。本实验室之前的研究表明,狂犬病毒街毒株G蛋白结合和进入DC的效率较低,不易引起DC激活,从而使病毒逃逸先天性免疫应答。因此,街毒株的免疫逃逸是由病毒的G蛋白决定的。但是G蛋白上调控这种逃逸机制的结构域或关键位点并不清楚。另外,大量研究表明狂犬病毒街毒株G蛋白的表达量比固定毒株G蛋白的表达量显着降低。然而狂犬病毒街毒株G蛋白介导的免疫逃逸是否与G蛋白的表达量有关尚未得到验证。本研究以固定毒株B2c和街毒株SHBRV-18为研究对象,在B2c反向遗传操作平台的基础上,将B2cG蛋白的各功能结构域(包括信号肽、膜外区、跨膜域和膜内区)分别替换为SHBRV的对应序列,拯救出嵌合各功能域的重组病毒。通过测定各病毒的生长动力学曲线和病毒感染细胞后的荧光斑大小,发现B2cG蛋白的信号肽、跨膜区、膜内区突变为SHBRV对应结构域的重组病毒感染细胞后在细胞间的扩增能力及最高滴度没有显着改变;而B2c G蛋白全长序列或者G蛋白膜外区突变为SHBRV对应结构域的重组病毒感染细胞后在细胞间的扩增能力及最高滴度均显着降低。因此,狂犬病毒感染细胞和在细胞上增殖能力是由G蛋白的膜外区决定。为了研究G蛋白表达水平调控区域,将各个重组的狂犬病毒感染细胞后,对重组病毒在细胞内或者细胞膜上的表达水平进行定量分析。western blot结果表明,将B2c G蛋白的膜内区突变为SHBRV的对应序列后,获得的重组病毒(rB2c/SHB-Gct)在细胞内G蛋白表达水平显着降低。同时,流式细胞术和激光共聚焦的结果也表明该重组病毒在细胞膜表面的量与SHBRV相似,均显着低于B2c。因此,狂犬病毒G蛋白的表达水平是由G蛋白自身的膜内区来调控的。同时利用流式细胞术对各重组病毒激活DC的水平进行统计分析,发现B2c G蛋白膜外区替换为SHBRV对应区域之后,得到的重组病毒(rB2c/SHB-Get)丧失了激活DC的能力。G蛋白表达量显着降低的重组病毒rB2c/SHB-Gct激活DC的水平有一定程度的下调,但与rB2c相比,无显着差异。为进一步研究膜外区调控DC激活的机制,对重组病毒吸附和进入DC的能力进行研究发现,当B2c G蛋白的膜外区突变之后,病毒吸附和进入DC的能力显着降低。因此,狂犬病毒G蛋白膜外区决定了病毒感染DC的能力,从而调控DC的激活。综上所述,我们的研究结果阐明了狂犬病毒G蛋白的膜外区决定了病毒吸附和进入到DC内的能力和DC激活的水平。因此,狂犬病毒激活DC的水平主要依赖于G蛋白膜外区介导病毒感染DC的能力,而不是由G蛋白的表达量来决定。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
糖蛋白膜外区论文参考文献
[1].商雨,李丽,樊叁铃,李林涛,唐国毅.新城疫病毒HN蛋白膜外区的纯化[J].动物医学进展.2019
[2].黄俊华.狂犬病毒糖蛋白膜外区调控树突状细胞激活的研究[D].华中农业大学.2017
[3].张静远.基于RABV糖蛋白膜外区的阻断ELISA抗体检测方法建立及应用[D].中国人民解放军军事医学科学院.2017
[4].李春明,朱晓文,赫宝双,朱琳,于铁男.水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E胞外区的真核表达及鉴定[J].中国生物制品学杂志.2016
[5].霍耐凡,康晓平,户义,李裕昌,李靖.蜱传脑炎病毒包膜糖蛋白胞外区的真核表达优化及其在血清学检测中的效果评价[J].生物技术通讯.2016
[6].路静,付玉荣,伊正君.狂犬病病毒糖蛋白膜外区重组基因的表达与鉴定[J].中国病原生物学杂志.2015
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[8].鞠美芳,殷相平,柳纪省.狂犬病病毒aG株糖蛋白膜外区的原核表达及纯化[J].生物技术通报.2012
[9].鞠美芳,殷相平,柳纪省.狂犬病病毒糖蛋白膜外区密码子优化、原核表达及纯化[J].中国人兽共患病学报.2012
[10].鞠美芳.狂犬病毒aG株糖蛋白膜外区原核表达及单克隆抗体的制备[D].中国农业科学院.2012