导读:本文包含了扁桃酸消旋酶论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:扁桃酸消旋酶,扁桃酸,邻氯扁桃酸,基因挖掘
扁桃酸消旋酶论文文献综述
周茂志,唐存多,许建和,郁惠蕾[1]（2018）在《新型扁桃酸消旋酶的基因挖掘和性能表征》一文中研究指出消旋酶是实现手性化合物去消旋化制备光学纯化学品的重要工具,来源于恶臭假单胞菌的扁桃酸消旋酶(MR),是目前唯一可以催化两种构型扁桃酸互相转换的消旋酶。通过基因组数据挖掘获得了9个新的扁桃酸消旋酶基因及活性蛋白,其中来源于放射性土壤杆菌Agrobacterium radiobacter的Ar MR酶对扁桃酸和邻氯扁桃酸具有较高的催化活力,而且该酶的异源表达水平也较理想。ArMR催化扁桃酸消旋反应的最适温度为50℃,最适pH为7.8。该酶在30℃、40℃和50℃下的半衰期分别为70.7、7.2、0.17 h。ArMR对(R)-和(S)-扁桃酸的K_M值分别为1.44 mmol/L和0.81 mmol/L,k_(cat)值分别为410 s~(–1)和218 s~(–1);对(R)-和(S)-邻氯扁桃酸的KM值分别为6.48 mmol/L和6.37 mmol/L,而k_(cat)值为0.22 s~(–1)和0.23 s~(–1)。Mg~(2+)和Mn~(2+)对该酶的活力有促进作用,而Zn~(2+)使其完全失活。新型扁桃酸消旋酶的发现和表征为今后此类酶的深入研究和开发提供了更多资源和数据参考。(本文来源于《生物工程学报》期刊2018年06期）
杨程程[2]（2017）在《扁桃酸消旋酶高通量筛选方法的构建及其在定向进化中的应用》一文中研究指出光学纯(R)-邻氯扁桃酸甲酯和(R)-乙酰基邻氯扁桃酸是心血管药物(S)-氯吡格雷工业化生产过程中两种重要的手性中间体。利用酯酶和扁桃酸消旋酶进行动态动力学拆分制备这两种化合物的理论收率可达100%,能够有效解决传统化学拆分过程中反应条件苛刻、对环境造成污染等问题,契合绿色化学的理念。然而,天然扁桃酸消旋酶对拆分过程中的副产物(S)-邻氯扁桃酸的催化活性非常低,在很大程度上限制了该动态动力学拆分过程的进行。为此,本课题构建了一种适用于扁桃酸消旋酶突变体库筛选的高通量筛选方法,并在此基础上利用定向进化的方法提高了扁桃酸消旋酶对(S)-邻氯扁桃酸的催化活力。为了辅助扁桃酸消旋酶的定向进化,本研究构建了一种选择性氧化系统用于扁桃酸消旋酶突变体库的筛选。该方法利用一种具有绝对及构型对映体选择性的D-扁桃酸脱氢酶将外消旋反应中产生的(R)-对映体转化成酮酸类化合物,进而用于后续的显色反应。最终成功为扁桃酸消旋酶构建了双酶联动的高通量筛选方法,并且通过手性高效液相色谱验证了该方法的有效性。基于这种高通量筛选方法,对恶臭假单胞菌来源的扁桃酸消旋酶进行了定向进化,最终获得了一株叁点突变体V22I/V29I/Y54F(MRDE1),其酶活比天然酶提高了3倍左右。同时,为了在反应动力学的角度解释酶活提高的可能来源,考察了扁桃酸消旋酶及其突变体对两种构型底物的酶促反应动力学,结果发现突变位点之间存在着一定的协同效应,并且突变体催化效率的改善主要来源于其kcat值的提高。最后,通过分子对接和分子动力学模拟对突变体酶活提高的来源进一步进行了解释。结果表明,酶与底物分子间质子传递作用的增强和π-π相互作用的引入在突变体酶活提高中起着关键作用。另外,通过分子力学泊松-玻尔兹曼表面积对酶-底物结合自由能进行了分析,发现静电作用是造成突变体结合自由能降低的主要原因,说明静电力在活性中心相互作用网中起着重要作用。研究结果表明,利用定向进化对酶进行改造以提高其催化性能是一种可行、有效的手段,但前提是需要一个合适的、有效的高通量筛选方法。此外,本研究中构建的高通量筛选方法与扁桃酸消旋酶的成功改造对其他消旋酶的分子改造具有一定的参考价值,同时为通过定向进化提高消旋酶对非天然底物的催化性能提供了借鉴。(本文来源于《浙江大学》期刊2017-03-09）
顾佳黎[3]（2014）在《扁桃酸消旋酶和酯酶BioH的理性设计及其应用研究》一文中研究指出随着进入市场的手性药物种类的急剧增长,手性药物及其中间体的制备备受关注。药物氯吡格雷是一种血小板凝集抑制剂,用于治疗心血管疾病,2009年其销售额全球排名第二。R-邻氯扁桃酸甲酯是氯吡格雷制备中的重要中间体,目前已有多种合成途径。但这些方法存在使用剧毒HCN或昂贵NADP+,产率低等缺点。本研究以外消旋邻氯扁桃酸甲酯为底物,以扁桃酸消旋酶和酯酶BioH分别作为外消旋反应和水解反应的催化剂,构建双酶偶联动态动力学拆分法制备R-邻氯扁桃酸甲酯,开发了一种环境友好、低成本、高产率的合成策略。首先,为了深入了解影响酶对映体选择性的因素,以脂肪酶CALB为对象,采用QSAR分析建立了对映体选择性(E值)定量预测模型。结果表明CALB对映体选择性受多种分子作用(立体作用、疏水作用、静电作用、氢键作用)的影响。基于以上4种相关分子场建立的模型的预测精度Rpred为0.92。此外,对分子场等势图的分析表明影响CALB选择性的氨基酸除了活性中心的催化氨基酸,还广泛分布在酰基、醇基结合口袋和底物进出通道。接着,采用基于结构信息的理性设计,定制了对S-邻氯扁桃酸甲酯具有高对映体选择性的酯酶BioH。借助于分子动力学模拟技术,基于对映体在酶活性中心的结合构象差异,微调酶-底物过渡态之间的空间位阻及电子作用,成功将酯酶BioH的选择性(E值)从3.3(野生型)提高至73.4(L123V/L181A/L207F),为后续的动态动力学拆分奠定了基础。随后,将重心转至扁桃酸消旋酶的改造。通过分子模拟和MM-PBSA结合能分析发现残基S139通过氢键稳定酶-底物复合物,且S139和E317对底物稳定具有协同作用。将S139突变成Ala不仅会破坏S139与底物之间的氢键,还会影响活性中心其他氨基酸与底物的相互作用,导致消旋酶对R-扁桃酸和S-扁桃酸的催化速率的下降(分别下降了45倍和60倍)。该研究加深了对消旋酶催化机制的理解,对消旋酶的改造具有指导意义。进而,以酶-底物过渡态结合能为标准,采用酶计算设计策略对消旋酶进行改造,提高了其对非天然底物的催化活性。突变体对R-间氯扁桃酸、R-2-萘乙醇酸、R-扁桃酰胺和R-邻氯扁桃酸的催化效率(Kcat/Km)分别为1.3×106、1.7×104、8.5×104、2.1×103M-1s-1,与野生型相比提高了2-5倍,证明该设计策略是一种有效的酶改造手段。最后,将改造后的扁桃酸消旋酶和酯酶BioH用于动态动力学拆分制备R-邻氯扁桃酸甲酯。研究表明水解体系中消旋酶的加入不仅加快了S-邻氯扁桃酸甲酯的水解速率,还提高了酯酶BioH对S-领氯扁桃酸甲酯的表观E值。在pH7.7,25℃,酯酶/消旋酶的摩尔比为1：21,底物初始浓度25mM(500μl体系)的拆分条件下,经4次循环拆分后,产物R-邻氯扁桃酸甲酯的收率为80%,ee值大于97%。(本文来源于《浙江大学》期刊2014-04-28）
梅卓航,刘击,于洪巍[4]（2011）在《Val22对恶臭假单胞菌扁桃酸消旋酶催化活性的影响》一文中研究指出恶臭假单胞菌扁桃酸消旋酶的Val22位于20s环状结构上,是与底物结合相关的氨基酸之一。其中Val被替换为Arg后酶活性下降了75.9%。除了酶与底物疏水作用减弱以外,静电排斥作用增强也可能引起活性的下降。利用分子动力学模拟对酶与底物的米氏复合物进行分析,结果表明:突变后第22位氨基酸侧链与底物的静电势从0.036 kJ/mol升高至0.124 kJ/mol。这说明氨基酸侧链极性的改变增加了侧链与底物分子之间的静电排斥作用,因而静电排斥作用也是导致突变体活性下降的原因之一。同时,突变后系统势能增加了283 kJ/mol,进一步证实了第22位氨基酸侧链极性和带电性质的改变导致酶与底物结合状态的势能增大,从而引起活性大幅下降。因此,将来对酶的结合口袋区域进行理性设计时,除了考虑空间位阻效应外,还需考虑疏水作用和静电作用。(本文来源于《微生物学通报》期刊2011年07期）
曾侦[5]（2009）在《扁桃酸消旋酶和扁桃酸脱氢酶基因的克隆及表达》一文中研究指出苯乙酮酸(PGA),又称苯甲酰甲酸(BFA),是应用广泛的有机合成中间体。可以用来合成多种医药和农药。通过与金属元素络合,又发现它可作为荧光材料的敏化剂和有机氧化反应的催化剂,更加引起人们的重视。扁桃酸消旋酶(MR)和扁桃酸脱氢酶(MDH)是微生物体内代谢扁桃酸生成苯乙酮酸的两个关键酶。根据研究结果,以扁桃酸为唯一碳源筛选得到具有高效转化扁桃酸活性的菌株,对其中活性较高的62号菌进行了菌种生理生化及16S rDNA的鉴定工作,证明是铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。实验表明62号菌能同时转化R-及S-扁桃酸,是一株可作为克隆扁桃酸消旋酶基因(mdlA)和扁桃酸脱氢酶基因(mdlB)的理想菌株。以62号菌染色体DNA为模板,PCR扩增获得mdlA+mdlB基因全长;PCR产物经纯化后与T载体相连,构建克隆载体pT-mdlA+mdlB;pT-mdlA+mdlB经NdeI/NotI双酶切后将目的基因插入pET30a(+)载体的多克隆位点(Mcs),构建了表达重组质粒pET30a-mdlA+mdlB;SDS-PAGE结果表明,重组菌在0.2mM IPTG的诱导下成功表达了43KDa的MDH及38KDa的MR。利用重组菌全细胞转化扁桃酸生产苯乙酮酸的初步研究表明,在0.2mM IPTG(或0.5%乳糖)作诱导物,1.0%的底物浓度下,48h内重组菌能达到97.40%的转化率;并且采用游离细胞转化时,效率更高;转化效率受底物浓度的影响较大。(本文来源于《南京理工大学》期刊2009-05-01）
扁桃酸消旋酶论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
光学纯(R)-邻氯扁桃酸甲酯和(R)-乙酰基邻氯扁桃酸是心血管药物(S)-氯吡格雷工业化生产过程中两种重要的手性中间体。利用酯酶和扁桃酸消旋酶进行动态动力学拆分制备这两种化合物的理论收率可达100%,能够有效解决传统化学拆分过程中反应条件苛刻、对环境造成污染等问题,契合绿色化学的理念。然而,天然扁桃酸消旋酶对拆分过程中的副产物(S)-邻氯扁桃酸的催化活性非常低,在很大程度上限制了该动态动力学拆分过程的进行。为此,本课题构建了一种适用于扁桃酸消旋酶突变体库筛选的高通量筛选方法,并在此基础上利用定向进化的方法提高了扁桃酸消旋酶对(S)-邻氯扁桃酸的催化活力。为了辅助扁桃酸消旋酶的定向进化,本研究构建了一种选择性氧化系统用于扁桃酸消旋酶突变体库的筛选。该方法利用一种具有绝对及构型对映体选择性的D-扁桃酸脱氢酶将外消旋反应中产生的(R)-对映体转化成酮酸类化合物,进而用于后续的显色反应。最终成功为扁桃酸消旋酶构建了双酶联动的高通量筛选方法,并且通过手性高效液相色谱验证了该方法的有效性。基于这种高通量筛选方法,对恶臭假单胞菌来源的扁桃酸消旋酶进行了定向进化,最终获得了一株叁点突变体V22I/V29I/Y54F(MRDE1),其酶活比天然酶提高了3倍左右。同时,为了在反应动力学的角度解释酶活提高的可能来源,考察了扁桃酸消旋酶及其突变体对两种构型底物的酶促反应动力学,结果发现突变位点之间存在着一定的协同效应,并且突变体催化效率的改善主要来源于其kcat值的提高。最后,通过分子对接和分子动力学模拟对突变体酶活提高的来源进一步进行了解释。结果表明,酶与底物分子间质子传递作用的增强和π-π相互作用的引入在突变体酶活提高中起着关键作用。另外,通过分子力学泊松-玻尔兹曼表面积对酶-底物结合自由能进行了分析,发现静电作用是造成突变体结合自由能降低的主要原因,说明静电力在活性中心相互作用网中起着重要作用。研究结果表明,利用定向进化对酶进行改造以提高其催化性能是一种可行、有效的手段,但前提是需要一个合适的、有效的高通量筛选方法。此外,本研究中构建的高通量筛选方法与扁桃酸消旋酶的成功改造对其他消旋酶的分子改造具有一定的参考价值,同时为通过定向进化提高消旋酶对非天然底物的催化性能提供了借鉴。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
扁桃酸消旋酶论文参考文献
[1].周茂志,唐存多,许建和,郁惠蕾.新型扁桃酸消旋酶的基因挖掘和性能表征[J].生物工程学报.2018
[2].杨程程.扁桃酸消旋酶高通量筛选方法的构建及其在定向进化中的应用[D].浙江大学.2017
[3].顾佳黎.扁桃酸消旋酶和酯酶BioH的理性设计及其应用研究[D].浙江大学.2014
[4].梅卓航,刘击,于洪巍.Val22对恶臭假单胞菌扁桃酸消旋酶催化活性的影响[J].微生物学通报.2011
[5].曾侦.扁桃酸消旋酶和扁桃酸脱氢酶基因的克隆及表达[D].南京理工大学.2009