常州市第一人民医院心内科江苏常州213003
摘要：目的探讨ghrelin对大鼠心肌梗死后心室重构的疗效及其作用机制。方法采用结扎左冠状动脉前降支制作大鼠心肌梗死模型，48只SD雄性大鼠随机分为假手术组（n=16）、心肌梗死组（n=16）及ghrelin给药组（n=16）。给予ghrelin干预4周后分别行血流动力学、超声心动图检测大鼠心脏功能，采用Luminol和Lucigenin化学发光实验检测活性氧族生成水平；使用RT-PCR和Westernblotting方法检测心肌核因子相关因子2其下游抗氧化因子醌氧化还原酶1、抗氧化酶血红素加氧酶1基因和蛋白表达水平。结果Ghrelin干预心肌梗死大鼠后4周，左心室收缩压、左心室压最大上升速率、左心室压最大下降速率、射血分数和左心室短轴缩短分数均显著改善，左心室收缩末期内径和收缩末期容量亦明显提高。Ghrelin组心肌核因子相关因子2及其下游靶基因抗氧化因子醌氧化还原酶1、抗氧化酶血红素加氧酶1转录及蛋白表达相较于对照组显著升高。结论Ghrelin能够改善心肌梗死大鼠心脏功能，其作用机制可能与调控Nrf2/ARE抗氧化信号通路有关。
关键词：心肌梗死；Ghrelin；核因子相关因子；氧化应激
心肌梗死发生后，由于血液动力学的介导及神经内分泌系统激活的作用，心室会发生重构，是发生慢性心功能不全的主要病理生理学基础，进而影响疾病转归。现有观点认为，心肌梗死后，活性氧族（ReactiveOxygenSpecies，ROS）是心室重构过程一系列级联反应的始动环节。前期研究表明，心肌梗死后OS水平明显升高，ROS生成增加，给予抗氧化剂干预后，可有效改善梗死后心室重构，抑制心衰进展[1]。Ghrelin是一种含有28个氨基酸残基的小分子内源性脑肠肽，其主要由胃底泌酸腺的X/A2细胞合成，但在心、肺、小肠、胰腺、肾脏、胎盘、脂肪组织等亦有分泌[2]。现有研究表明，ghrelin除已公认的促进生长激素释放、改善食欲、调节胃肠动力、抑制胰岛素抵抗等生物学效应外，还具有其他潜在效能，如心血管保护功能[3]，但对心梗后心室重构的影响及其作用机制尚不清楚。本研究采用ghrelin干预大鼠心肌梗死模型，通过超声心动图判定其疗效，并通过观察ROS生成水平及心肌核因子相关因子2（Nrf2）/抗氧化反应元件（antioxidantresponseelement，ARE）抗氧化通路表达变化研究其作用机制。
1.材料与方法
1.1主要材料和仪器
SD大鼠购自扬州大学实验动物中心；ghrelin购自美国Tocrisbioscience公司；PCR引物由上海生工生物公司合成；兔抗鼠Nrf2、NQO1及HO-1及内参兔抗鼠β-actin抗体分别购自美国SantaCruz及英国Abcam公司；Luminol和Lucigenin均购自美国Sigma-Aldrichi公司；多功能酶标仪购自美国Bio-Tek公司；高分辨率成像系统Vev02100购自加拿大VisualSonic公司；小动物呼吸机购自中国奥尔科特公司。
1.2大鼠心肌梗死模型的建立和分组
用10%水合氯醛（400mg/kg）腹腔注射麻醉后，气管插管连接小动物呼吸机，暴露心脏，5-0丝线结扎冠状动脉左前降支近端，结扎后心室前壁局部变白，以心电图肢体导联ST段背弓抬高0.2mV以上为造模成功标志。假手术组只穿线，不结扎。实验用SD大鼠共48只，分为假手术组（n=16）、心肌梗死组（n=16）和ghrelin组（n=16）。术后ghrelin组采用ghrelin（100μg/kg）腹腔注射，心肌梗死组和假手术组予等体积生理盐水腹腔注射，各组均予干预4周。
1.3血流动力学评估
10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，游离结扎颈总动脉远端和近端，靠远心端结扎线处采用眼科剪剪一个“V”形小缺口，向心方向插入与压力换能器连接并充满肝素盐水的PE-50管约2.5cm，稳定15分钟后，采用多导生理记录仪测量左心室舒张期末压（leftventricularend-diastolicpressure，LVEDP）、左心室收缩压（leftventricularsystolicpressure，LVSP）、左心室压最大上升速率（+dp/dtmax）及左心室压最大下降速率（-dp/dtmax）。
1.4心脏超声心动图检测
造模4周后，10%水合氯醛麻醉大鼠，采用小动物高频超声探头（15MHz）行心脏形态和功能检测，取胸骨旁左室长轴和乳头水平短轴切面。在3个连续心动周期中测量取平均值，计算左心室舒张期末内径（leftventricularend-diastolicdiameter，LVEDD）、左心室收缩期末内径（leftventricularendsystolicdiameter，LVESD）、左心室后壁厚度、室间隔厚度（IVS）及左心室射血分数（LVEF）。
1.5心肌ROS水平检测
采用Luminol和Lucigenin化学发光法测定心梗后心肌ROS水平。称取约50mg的大鼠心肌组织样品，用眼科剪尽量将其剪碎。将样品浸润于预先配置好的PBS-HEPES反应液（pH7.2，20mMHEPESin0.5MPBS）里，随后加入适量的Luminol和Lucigenin，保证两者浓度至0.2mM。充分混匀后迅速将其放入分光光度计中，反应时间为5分钟。结果标准化到每1mg心肌组织的相对光单位。
1.6心肌Nrf2通路及下游抗氧化酶mRNA表达
使用实时荧光定量PCR方法测定心肌梗死后心肌Nrf2及其下游抗氧化应激酶NQO1、HO-1、TRX基因水平。于相应时间点安乐死大鼠，取梗死灶周心肌组织，采用Trizol法提取总RNA，用微量分光光度计（Nanodrop1000）测量总RNA纯度和浓度。逆转录为cDNA模板，ABI7500型荧光定量PCR仪测定待测基因及内参照β-actin扩增各循环荧光信号，计算其ΔCt值。各组均设副孔3个，重复实验3次。
1.7心肌Nrf2通路及下游抗氧化酶蛋白表达
提取梗死灶周心肌组织蛋白，12%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，转膜后分别加一抗Nrf2（1：1000）、HO-1（1：600）、TRX（1：1000）及β-actin（1：5000）4℃孵育过夜。加二抗室温下孵育2h，洗膜后用增强型ECL显色液在暗室中曝光显影。采用QuantityOne软件定量分析各组蛋白表达差异，分别计算Nrf2、HO-1、TRX与β-actin条带灰度值的百分比，作为蛋白表达量。
1.8统计方法
数据均以均值±标准差来表示。统计分析用SPSS16.0统计软件分析。不同组间的数据统计采用Student-Newman-Keuls单因素方差分析。P值小于0.05认为具有统计学显著性差异。
2.结果
2.1Ghrelin对血流动力学的影响
大鼠心肌梗死造模后4周内，造模组较假手术组大鼠均出现了精神萎靡、进食减少、毛发灰暗等表现。与假手术组相比较，心肌梗死组和ghrelin组大鼠LVSP、+dp/dtmax及-dp/dtmax均出现明显下降（P＜0.05），但ghrelin组明显高于心肌梗死组（P＜0.05）。心肌梗死组和ghrelin组LVEDP均明显高于假手术组（P＜0.05），但ghrelin组明显低于心肌梗死组（P＜0.05）。
2.2Ghrelin对超声心动图结果的影响
与假手术组相比较，心肌梗死组和ghrelin组大鼠IVS、LVEDD和LVESD均明显升高（P＜0.05），而LVEF明显下降（P＜0.05）；而ghrelin组IVS和LVEDD相较于较心肌梗死组均出现明显下降（P＜0.05），而LVEF相较于心肌梗死组明显升高（P＜0.05）。
2.3Ghrelin对ROS的影响
心肌梗死组和ghrelin组大鼠心肌组织内luminol及lucigenin相对光单位均高于假手术组（P＜0.05）。当结扎造模后给予ghrelin干预后，luminol及lucigenin相对光单位均明显下降（P<0.01）。
2.4Ghrelin对Nrf2通路及下游抗氧化酶mRNA表达的影响
与假手术组相比较，心肌梗死组和ghrelin组大鼠Nrf2及其下游NQO1、HO-1、TRXmRNA表达水平相较于对照组显著升高（P＜0.05）；ghrelin组Nrf2及其下游NQO1、HO-1、TRXmRNA表达水平相较于较心肌梗死组均出现明显增高（P＜0.05）。
2.5Ghrelin对Nrf2通路及下游抗氧化酶蛋白表达的影响
心肌梗死组和ghrelin组大鼠心肌组织内Nrf2及其下游NQO1、HO-1、TRX蛋白表达水平均高于假手术组（P＜0.05）；ghrelin组Nrf2及其下游NQO1、HO-1、TRX蛋白表达水平相较于较心肌梗死组明显增高（P＜0.05）。
3.讨论
心脏重塑是心肌梗死后的主要生理病理过程，其最直接的结果是导致心脏泵血功能的不断降低，进而发展为慢性心力衰竭导致死亡[4]。新近研究表明，心肌梗死后ROS大量生成，诱发氧化应激，造成脂质、蛋白质及DNA的氧化损伤，影响心肌细胞正常结构和功能，导致梗死后心室发生重构，而抑制ROS生成可有效扭转心梗后心室重构，改善预后。
近年来，多种疾病模型实验发现ghrelin具有清除ROS和抑制氧化应激的能力，如肿瘤[5]、肥胖[6]及慢性肾损伤[7]等。Luminol和Lucigenin发光实验能够检测一系列的ROS产物，如Luminol可以检测组织内H2O2、HOCl、?OH等自由基水平，而Lucigenin能够检测氧自由基水平。本研究在大鼠心肌梗死模型中，给予100μg/kgghrelin治疗剂量4周，血流动力学和超声心动图证实可明显改善心梗后心室重构严重程度，Luminol和Lucigenin发光实验证明ghrelin可有效减少心梗后ROS生成，抑制氧化应激，从动物模型水平证明了ghrelin可通过减少ROS生成进而减轻心肌梗死后心室重构。
新近研究表明，Nrf2/ARE信号通路是机体内源性调控氧化应激的核心通路[8]。生理情况下，Nrf2与Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1（kelch-likeECH-associatedprotein-1，Keap1）结合稳定，其抗氧化能力被抑制。但当机体处于病理氧化应激状态下，Nrf2与Keap1解离，进入细胞核与核上ARE相结合，进而启动下游一系列抗氧化酶的转录，包括NQO1、HO-1、TRX等。本研究采用ghrelin干预大鼠心肌梗死模型，发现ghrelin可明显上调Nrf2及其下游抗氧化应激关键酶HO-1、NQO1及TRX、的基因及蛋白表达，表明Nrf2/ARE信号通路在心梗后对心室重构的逆转作用。然而，由于动物来源限制，本研究未在Nrf2基因敲除大鼠心肌梗死模型中验证ghrelin对梗死后心室重构的影响，此为本研究不足之处。
综上所述，本研究说明ghrelin可显著扭转大鼠心肌梗死后心室重构，其作用机制可能通过激活内源性Nrf2/ARE抗氧化信号通路，上调Nrf2下游靶向抗氧化关键酶清除ROS生成有关。
参考文献：
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