导读:本文包含了水解酶家族论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:糖苷水解酶32家族,叁维结构,活性中心,催化机制
水解酶家族论文文献综述
陆璐,陶雅军,罗学娅,马君燕[1]（2019）在《糖苷水解酶32家族结构与功能的研究进展》一文中研究指出糖苷水解酶32(GH32)家族是一类广泛存在于植物、真菌和细菌中的水解酶,作用于果聚糖苷键的水解或合成,在果聚糖的生物合成、细胞壁代谢、植物防御、植物细胞分化和发育、果聚糖类物质动员、刺激肠道有益细菌生长等各种生物过程发挥重要的作用。GH32家族的叁维结构高度保守,由N-端催化结构域和C-端β-叁明治结构域组成。目前,GH32家族已有10 146个家庭成员,其中15种酶的晶体结构得到解析,明确了酶的叁维结构和催化机制。该文综述了GH32家族的成员及生物学功能、叁维结构、催化活性中心和催化机制,论述了芳香族区域在酶与底物识别中的重要作用,展望了GH32家族工业用酶的改造方向。(本文来源于《中国酿造》期刊2019年08期）
田震楠[2]（2019）在《糖苷水解酶GH5主要亚家族活性架构功能探究》一文中研究指出木质纤维素是地球上储量最丰富的可再生资源,其主要成分包括纤维素和各类半纤维素,如甘露聚糖和木聚糖等。通过糖苷水解酶,如纤维素酶,甘露聚糖酶和木聚糖酶催化降解,这些多糖成分可以被水解成可溶性糖,经过生物炼制可以转化为生物燃料和多种化工制品,这为解决当前世界所面临的环境污染和能源短缺提供了一个有效途径。显然,获得适用于特定工业环境的不同种类的糖苷水解酶是降低工业生产成本,加快木质纤维素转化的关键。虽然糖苷水解酶设计工作已经有很多成功的先例,但对它们的活性架构和催化过程分子机制的认识尚不深入。本文基于结构生物信息学方法,对GH5主要亚家族的纤维素酶和甘露聚糖酶进行了序列、结构和分子动态等方面的分析,定位了活性架构中与底物特异性相关的关键氨基酸残基,并对TfCe15A活性中心残基进行了丙氨酸筛选及功能分析,初步阐明GH5家族酶分子不同亚位点关键残基在酶催化中发挥的不同功能,为进一步的酶分子设计奠定了基础。本文的主要内容如下:1.通过对糖苷水解酶GH5家族中6个主要亚家族酶分子的结构生物信息学分析,阐明了不同亚家族酶分子间的主要异同点。对GH5家族主要亚家族序列、结构和分子动态分析显示,不同亚家族酶分子的主要差异存在于构成活性架构的8个loop 区域。比较不同亚家族活性中心序列谱发现,GH5家族酶分子负亚位点残基保守度最高,-1亚位点有3个残基在整个GH5家族内是完全保守的,一2亚位点也有一个色氨酸在GH5家族内完全保守,这些残基可能与催化断键密切相关;还有部分残基在单个亚家族内保守或相对保守,这些残基可能与不同亚家族之间的功能演化相关。2.通过对GH5_2亚家族纤维素酶和GH5_8甘露聚糖酶的结构分析和生化测定,发现了活性架构-1和-2亚位点关键残基在两个亚位点不同的底物识别机制。由于纤维素和甘露聚糖底物-1亚位点糖环不同程度的扭曲,在该亚位点两类底物O3空间位置存在差异,而在-2亚位点,纤维素和甘露聚糖差异在于O2的空间位置。相应地,结构比对结果显示,在-1亚位点,两个亚家族保守的组氨酸和天冬酰胺通过与-1O3的相互作用起到底物识别作用,而在-2亚位点,GH5 2亚家族相对保守的谷氨酸通过与-2O2的相互作用起到底物识别作用。3.通过对TfCe15A所有活性中心氨基酸残基的丙氨酸筛选及生化测定,揭示了活性中心残基在酶催化过程中发挥的不同作用。对TfCel5A活性中心共22个关键氨基酸进行了丙氨酸突变及结合常数Ka和酶活测定,并分析了关键残基在酶催化中发挥的功能。Ka测定结果显示,负亚位点残基在底物结合中至关重要,其中-2亚位点保守的色氨酸和-2/-3亚位点相对保守的带电残基对通过与底物-2/-3亚位点形成密集的氢键网络在底物初始结合中发挥了重要作用。酶活测定显示,-2到+1亚位点残基在催化断键中至关重要,其中与-1O2相互作用的保守组氨酸和酪氨酸通过稳定亲核试剂并维持其带电状态来协助催化断键;与-1O3相互作用的保守组氨酸和天冬酰胺通过与底物间的相互作用协助-1亚位点糖环的扭曲,该过程需要loop3较大幅度的运动;此外,-2和+1亚位点两个保守色氨酸也参与底物形变过程;根据相关残基在GH5家族中的高保守度可知,它们在催化断键中发挥的重要作用在整个GH5家族中是一致的。(本文来源于《山东大学》期刊2019-05-27）
杨宇萌[3]（2019）在《GH12家族糖苷水解酶Cel12A的功能研究》一文中研究指出纤维素是地球上含量最多的可再生性资源,其天然结构稳定,在自然环境下降解缓慢。目前利用纤维素酶对纤维素资源进行酶法转化是人们研究的热点。本实验室前期从Bacillus licheniformis ATCC 14580菌株中克隆了GH12家族酶基因cel12A,并对其进行了初步的异源表达及酶学性质研究。本论文以此为基础,一方面对Cel12A的内切纤维素酶功能进行研究,通过序列比对和突变体构建确定了对酶活性具有重要作用的氨基酸位点,并对其可能的作用机制进行了深入研究。另一方面以Cel12A为对象,利用电子显微镜观察及协同作用实验等探讨了小分子量的GH12家族酶可能存在的非水解膨胀功能。本文的主要实验结果如下:(1)通过序列比对确定了GH12家族纤维素酶中可能与酶功能相关的15个保守氨基酸,对这些位点进行了丙氨酸筛选,突变体酶活性的测定结果显示这些氨基酸对Cel12A的活性具有不同程度的影响。亲核基团E155和酸碱催化基团E243突变后,重组酶活性完全丧失;D137突变后重组酶几乎丧失全部酶活性,暗示D137可能作为“催化叁联体”的第叁个成员发挥作用;此外N51A、W53A、Y89A及N133A突变体比酶活失活近80%,M157A与W159A突变体比酶活失活近70%,V86A与W139A突变体比酶活失活近60%,P167A与F245A突变体比酶活失活近30%,V199A和I189A突变体比酶活失活低于20%。(2)进一步对影响酶活性程度较大的N51、W53、Y89和N133四个位点的功能进行研究。对N51进行天冬氨酸D和丙氨酸A方向的突变,突变后酶的剩余活性均不足30%,显示出N51可能通过与底物结合形成氢键而发挥作用。对W53进行酪氨酸Y和组氨酸H方向的突变,突变后酶的剩余活性均不足30%,说明W53可能在GH12家族酶分子与底物识别与结合过程中发挥重要的作用。对Y89进行苯丙氨酸F方向突变,突变后酶基本维持原来的活性,推测在酶催化底物过程中Y89的作用是维持糖环正确的构象。对N133进行天冬氨酸D、苯丙氨酸F方向的突变,结果显示突变体后的酶活性呈梯度下降,表明N133与酸碱催化基团之间所形成的氢键是Cel12A识别与催化纤维素类底物的结构基础,同时,N133突变体最适pH向酸性方向偏转了近0.4个单位,暗示该位点能够影响催化残基的催化环境,进而对酶活性的维持及催化断键时的最适pH产生影响。(3)扫描电子显微镜观察到经Cel12A预处理的不溶性纤维素底物明显变得蓬松;同时也检测到Cel12A与商品化纤维素酶在与这些底物的作用过程中具有协同作用。这些实验结果表明Cel12A作为小分子量蛋白发挥了类似于植物ExPansin及Swollenin的膨胀功能。(4)为进一步探究Cel12A发挥膨胀功能的原因,以内切纤维素酶活性完全丧失的Cel12A失活突变体为材料进行了膨胀实验。结果显示,Cel12A失活突变体也能一定程度地发挥膨胀功能,但与野生型相比,膨胀功能有所下降,说明Cel12A具有膨胀功能的原因可能与其内切纤维素酶的活性及小分子蛋白的特性均具有相关性。本论文探讨了Cel12A的分子作用机制及非酶因子膨胀功能,为GH12家族纤维素酶的蛋白质工程改造及体外高效复合酶系的构建提供了理论和实验信息。(本文来源于《东北师范大学》期刊2019-05-01）
吴秀芸[4]（2018）在《糖苷水解酶GH11家族结构稳定性分析及活性架构功能设计》一文中研究指出工业生物技术已经成为现代生物技术领域发展的第叁次浪潮。目前酶制剂已经应用到多种工业生物技术领域,但是酶催化的高效性和稳定性仍是限制工业应用的主要瓶颈,所以设计筛选高效稳定的工业酶制剂一直是工业生物技术领域的研究热点。海量的生物信息促进了酶分子设计策略的不断进步和发展,已从高通量筛选、定向进化、半理性设计发展到通过理性设计策略来设计酶分子。特别是酶分子巨大的序列空间要求对酶分子的结构信息进行系统分析,促进了“基于结构的生物信息学”的产生和蛋白质功能区(sector)的新分类系统建立。蛋白质的功能和特性依赖于蛋白质功能区内相关氨基酸残基的协同作用,通过以蛋白质家族为单位基于结构生物信息学分析可以快速定位蛋白质功能区内的关键氨基酸残基或组合;基于家族系统发育树的构建分析可以根据氨基酸进化规律明确突变的方向,这可以大大降低序列的搜索空间与搜索强度。以糖苷水解酶为代表的水解酶类是工业中重要的生物催化剂。通过进化指导的结构生物信息学分析不同糖苷水解酶家族酶分子的序列、结构和功能之间的关系,针对序列相似性很高、功能却发生分歧的相关蛋白,准确快速的定位出“功能的可塑区(Functional plasticity islands)”,为蛋白质设计提供靶点(即影响功能的关键氨基酸残基、残基组合或局部结构)和设计方向,从而指导建立小而精(Small but Smart)的突变文库,提高设计的成功率。本论文从优化表征糖苷水解酶结合力的亲和电泳技术切入;利用进化指导的结构生物信息学平台技术,探究了影响GH11家族糖苷水解酶热稳定性的结构基础和酶分子催化功能快速演化的共性规律,并对GH11家族糖苷水解酶TlXynA的活性架构关键亚位点氨基酸进行了功能分析,初步阐明其结合底物的作用机理。本文取得的创新性研究成果如下:1.建立了快速展示糖苷水解酶活性架构单点突变导致结合力变化的亲和电泳技术,可以作为常规生化实验室的普筛工具。利用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,在分离胶中加入不同浓度梯度的多糖底物,具有结合特性的酶组分将会与系列浓度的底物在凝胶中结合,产生凝胶阻滞反应。从而可利用亲和电泳技术快速展示内切纤维素酶TrCe112A和木聚糖酶TlXynA不同突变体在不同底物浓度凝胶中蛋白质相对迁移率变化,而该变化可以定量表征酶分子突变前后结合底物能力的变化。亲合电泳测定的有效阻滞常数Kb值与等温滴定量热法、荧光光谱法测定的相关参数比较具有较好的一致性。本文建立的亲和电泳技术具有简便、快速的特点,可以进行多个样品的同时测定,因而可作为常规生化实验室测定结合力变化的普筛技术,具有重要的应用价值。2.通过N-末端替换增强了中温酶的热稳定性,证实N-末端结构是糖苷水解酶GH11家族酶分子的热稳定性结构基础。嗜热木聚糖酶在许多生物工业领域有更为广泛的应用,如纸浆和造纸业、烘焙业和饲料业等,所以设计嗜热酶分子具有较高的工业价值。根据GH11家族系统发育树分析酶分子的进化关系时,发现四种亲缘关系相近但是酶分子热稳定性差异较大的酶分子。通过序列比对和氨基酸保守性分析,发现由不保守氨基酸组成的N-末端区域和关键的Thumb-loop区域;根据氨基酸的组成发现,嗜热酶极性带电氨基酸(特别是Arg)的含量较高。在木聚糖酶中引入嗜热酶分子的局部结构(N-末端区域和Thumb-loop区域)或相关极性氨基酸残基,可能会提高酶分子的热稳定性。分别以Aspergillus niger ATCC1015的GH11家族木聚糖酶XynB和Thermomyces lanuginosus的GH11家族木聚糖酶XynA为研究对象,进行了突变实验及功能分析。酶分子AnXynB中引入嗜热酶的N-末端,可使相关酶分子的Tm值提高4℃,增强了结构的稳定性,证实N-末端结构是糖苷水解酶GH11家族酶分子的热稳定性结构基础。3.基于进化指导的结构生物信息学分析,探究了 GH11家族糖苷水解酶催化功能快速演化的结构基础和共性规律,并对AnXynB的活性架构-3亚位点进行氨基酸精准嫁接,提高了酶活性与其热稳定性。自然界中多样的酶分子能够通过调整它们的序列、局部结构甚至是蛋白质的动态来适应它们特异性的功能。所以,在分子进化的基础上定位功能特异性的氨基酸残基是可行的。整个GH11家族的系统进化分析发现亲缘关系近的酶分子功能差异较大,那么有限的序列结构差异决定着其功能演化。活性中心序列谱分析表明远端亚位点不保守氨基酸可能决定着催化功能的演化。比较分析近源的中温酶AnXynB和嗜热酶77XynA的序列、结构与功能,发现嗜热酶分子在活性架构-3亚位点存在极性氨基酸残基以及对底物更强的结合能力。通过分子动力学模拟和实验相结合的方法,对中温酶AnXynB活性架构-3亚位点的两个氨基酸残基进行了有目的的替换,提高了AnXynB与底物的结合能力,从而获得了高酶活的两种突变体,其中酶分子T43E的酶活性提高了 20%,酶分子S41N/T43E的酶活性提高了 72%。同时,由于突变体S41N/T43E在N-末端结构中新引入两个氢键作用力,从而使酶分子的整体热稳定性也明显提升。4.对GH11家族糖苷水解酶TlXynA活性架构所有关键氨基酸进行定点突变及功能分析,进一步阐明酶分子与底物多糖分子的相互作用机理。GH11家族酶分子具有非常保守的整体结构,活性中心为裂隙状。通过分析活性中心氨基酸的保守性,发现氨基酸聚簇保守性在-2、-1和+1亚位点较高,并且-2—+1亚位点是相互作用形成最集中的区域。大部分的极性氨基酸与底物糖单元的02和03形成氢键作用,芳香族氨基酸与底物糖单元特别是-2、+2和+3位糖环形成CH-π相互作用。为了探究各个亚位点氨基酸对酶分子催化功能的贡献大小,对其进行丙氨酸筛选,共获得了 23个突变体蛋白。结合力测定发现氨基酸侧链基团的去除都降低了酶分子对底物的结合能力,其中-3、-2和+1亚位点氨基酸对结合力的贡献较大。酶活测定显示,大部分突变体的活性都在野生型酶活的30%以下,其中-2亚位点和+1亚位点关键氨基酸的突变使酶活几乎丧失,说明相关亚位点氨基酸与催化残基同等重要,不是蛋白质改造的重点。虽然突变后酶分子依然可以与底物分子结合,但是不能精准对位完成催化。酶分子与底物糖环的精准对位是其完成催化所必须的。+2和+3亚位点氨基酸的突变实验显示,主要提供CH-π相互作用力,π电子的大小对于酶活的影响差异明显。在低温下增加酶分子与底物的结合能力,提高了酶分子在低温下的酶活。分析活性架构各个氨基酸对底物的结合能力,可以有效的对其进行功能分类,阐明不同亚位点在催化过程中的角色与功能,为之后特定位点的理性设计提供理论基础。5.探究了TlXynA酶分子活性架构关键loop动态变化对催化功能的影响。蛋白质的动态与其催化功能息息相关,参与酶反应构象的形成、有效的底物结合和产物释放。有文献表明,活性中心区域的动态稳定性是嗜热酶维持催化功能不可或缺的因素,通过对糖苷水解酶GH11家族的结构进行分析,发现在活性中心周围存在叁个loop结构且受温度影响较大。在嗜热酶77XynA中,Loop2与Loop3在外侧都存在一个极性氨基酸Arg与之相互作用分别是R116-D97(Loop2)和R81-D129(Loop3)。与中温木聚糖酶AnXynB的3个Loop区域进行氨基酸比对,发现中温木聚糖酶AnXynB的Loop结构中存在较多的Gly,尤其是在Loop1和Loop2中。由此,将嗜热酶TlXynA作为为研究对象进行突变研究和功能分析。分子动力学模拟的结果发现突变降低了酶分子局部结构的柔性,特别是A23G和R81Q两个突变体。酶活测定结果显示Loop3动态的变化导致酶分子的催化能力降低,主要影响了酶与底物的结合力(Km值增大)。Loop2的动态变化使酶分子释放产物的效率增大,从而提高了酶分子的催化活性。这说明这些Loop结构的分子动态行为对于酶分子结合底物和产物释放是非常重要的。(本文来源于《山东大学》期刊2018-05-28）
杨志芹[5]（2018）在《嗜热真菌糖苷水解酶第七家族基因的克隆、表达及分子改造》一文中研究指出纤维素作为一种含糖量最为丰富的可再生能源,在解决能源短缺方面具有重要的意义。研究发现纤维素酶降解纤维素是一种既环保又高效的方法。在纤维素降解过程中,酶活力高、热稳定性强的纤维素酶是提高酶解效率、减少成本的关键。嗜热真菌产生的纤维素酶具有较高的酶活性及热稳定性。本研究分别将嗜热毁丝菌糖苷水解酶第七家族外切葡聚糖酶cbh1基因和嗜热毛壳菌糖苷水解酶第七家族内切葡聚糖酶eg2基因进行克隆、表达,获得外切葡聚糖酶CBH1和内切葡聚糖酶EG2。将纯化的蛋白CBH1和EG2进行SDS-PAGE电泳检测,CBH1的理论大小为54 kDa,而电泳结果显示蛋白的大小为72 kDa,推测蛋白可能存在糖基化修饰;EG2的电泳结果显示蛋白的大小为45 kDa,与理论值大小(45 kDa)相符。为了获得具有更高活性的纤维素酶,提高纤维素酶对纤维素的降解效率,本研究分别对CBH1和EG2进行分子改造,期望可以获得具有更高酶活性及热稳定性的纤维素酶。根据同源建模的方法,分别对外切葡聚糖酶CBH1和内切葡聚糖酶EG2进行叁维结构的预测。糖苷水解酶第七家族(GH7)外切葡聚糖酶(CBHs)在催化中心活性通道的顶端有一个环状结构,嗜热毁丝菌糖苷水解酶第七家族外切葡聚糖酶CBH1的环状结构由9个氨基酸组成,即G245-Y253,将该结构进行敲除,获得缺失突变体CBH1-DM;根据叁维结构,选取CBH1底物结合平面内四个保守的芳香族氨基酸W38、W40、W372和W381以及EG2活性通道内,位于活性位点6?范围内的五个非保守氨基酸A141、L145、M195、I207和M342进行定点突变,获得CBH1的八个突变酶W38Y、W38F、W40Y、W40F、W372Y、W372F、W381Y和W381F以及EG2的四个突变酶A141S、L145T、M195L、I207V和M342F。将原酶和突变酶进行酶学性质的测定。实验结果表明,本研究已经成功获得两个酶活力提高的突变体,分别为CBH1-DM和W38Y。CBH1-DM的比活力为2.42 U/mg,是野生酶CBH1(1.17 U/mg)的2.1倍,突变酶W38Y的比活力为1.3 U/mg,是CBH1(1.17U/mg)的1.1倍,剩余突变酶的酶活均有不同程度的降低;CBH1、CBH1-DM的最适温度均为50℃,剩余突变酶的最适温度为60℃;CBH1及突变酶的最适pH均为5.0;在70℃处理1小时后,CBH1仅剩余35%的酶活力,而CBH1-DM剩余65%的酶活力,CBH1-DM的热稳定性显着提高,而其他突变酶的热稳定性均有不同程度的降低。突变酶与野生酶EG2相比,酶活性均有不同程度的降低;EG2与突变酶最适温度均为50℃,最适pH均为5.0;与EG2相比,在80℃处理1小时后,EG2具有50%的酶活,而M195L具有65%的酶活,M195L的热稳定性提高,而其他突变酶的热稳定性均有不同程度的降低。(本文来源于《山东农业大学》期刊2018-04-01）
刘娇娇[6]（2018）在《嗜热革节孢第十二家族糖苷水解酶基因的克隆、表达及分子改造》一文中研究指出纤维素是植物细胞壁的主要组成部分,是地球上最丰富的可再生资源,在当前世界面临着能源危机和环境压力的情况下,如何更加有效地发挥微生物纤维素酶的作用来分解和转化自然界中储存巨大的纤维素成为能源物质,对解决资源、环境问题以及人类社会的可持续发展具有重大的现实意义,其中定点突变技术已成为人们改善纤维素酶活性的重要技术。嗜热革节孢是一种嗜热真菌,能够产生较强热稳定性和较高活力的酶,是纤维素的分解者之一。本研究意在寻找影响嗜热革节孢第十二家族糖苷水解酶活性的氨基酸位点,通过定点突变技术研究第十二家族糖苷水解酶催化作用机理,同时为寻找使酶活性得到提高和酶学性质得到改善的其余氨基酸位点打下基础。本研究对来自嗜热革节孢第十二家族糖苷水解酶基因steg1进行克隆,得到的cDNA全长为711bp,编码了237个氨基酸。将目的基因转化毕赤酵母中诱导表达并纯化蛋白,经SDS-PAGE分析,结果显示STEG1蛋白分子量大小为26kDa,与理论值27kDa大小基本一致。研究发现嗜热革节孢第十二家族糖苷水解酶STEG1叁维结构的催化结构域是由18种氨基酸组成的一个凹槽形状的活性通道,这十八种氨基酸包括F220、P146、Y145、I144、D72、W137、W37、I147、N35、M135、V74、E133、D116、M171、N168、F118、Y77、W128。通过对STEG1结构的分析,发现纤维素酶在降解纤维素过程中会形成不同的结构,其中在与多种糖类物质反应过程中,位于活性通道上的部分氨基酸位点和葡糖基之间更易形成氢键,这些氨基酸位点更易与底物结合反应,Y145的-COOH及氨基酸主链上的N与葡糖基的-OH之间形成的氢键距离都很近。所以本研究合理选择了位于催化活性通道上的六个氨基酸位点(N35、W37、Y77、W128、Y145、N168)进行定点突变,得到了八种突变酶(N35Q、W37H、Y77F、W128S、Y145F、Y145A、Y145W、N168Q),经测定这八种突变酶的酶学性质各发生了不同的变化。研究结果显示,与原酶WT相比,所有突变酶的活性降低,突变酶Y77F和N35Q的热稳定性得到提高。其中突变酶Y77F、W128S、Y145A的K_m值和k_(cat)值都降低;N35Q的K_m和k_(cat)值都升高;突变酶W37H、Y145F、Y145W、N168Q的K_m值升高,k_(cat)值降低。原酶与突变酶的最适pH为5.0,均保持不变。突变酶Y77F、N35Q的最适温度降低到50℃,WT和突变酶W37H、W128S、Y145A、Y145F、Y145W、N168Q的最适温度为55℃。研究结果表明这六种氨基酸在第十二家族糖苷水解酶降解纤维素过程中发挥着重要的作用。(本文来源于《山东农业大学》期刊2018-04-01）
郑芳芳,梁蒙,林宇,郭双双,王子龙[7]（2017）在《链霉菌GXT6中糖基水解酶1家族β-葡萄糖苷酶的性质研究》一文中研究指出从实验室自行筛选到的链霉菌GXT6的基因组测序结果中找到一个编码β-葡萄糖苷酶的基因bgl2,对其编码的蛋白质序列进行生物信息学分析后发现是属于糖基水解酶1家族,不含有信号肽并具有较为明显的亲水性。利用PCR方法获得该基因,以p SE380为表达载体,成功构建重组质粒p SE-bgl2,转化至大肠杆菌XL1-blue中进行诱导表达,成功获得重组酶BGL2。利用镍亲和层析技术纯化重组酶,进一步进行酶学性质的研究。结果表明,重组酶BGL2的最适p H和最适温度为7.0和45℃,Km值为0.2871±0.01586 mmol·L~(-1),Vmax值为10.24±0.1577μmol·min~(-1)·mg~(-1)),葡萄糖抑制常数Ki值为75.63±5.499 mmol·L~(-1)。(本文来源于《广州城市职业学院学报》期刊2017年04期）
刘玉姣[8]（2017）在《嗜热革节孢第一家族和第六家族糖苷水解酶的分子改造》一文中研究指出纤维素在自然界中广泛存在,而且含量丰富,是一种可再生资源,对解决能源短缺和资源枯竭具有重要意义。但是,我国的纤维素利用率很低,造成大量的浪费。在纤维素的分解过程中,纤维素酶发挥非常大的作用,将纤维素最终分解为葡萄糖,使得纤维素能够得到充分的利用。嗜热革节孢是一种嗜热真菌,能够产生热稳定性酶,是纤维素的分解者之一。本研究对来自嗜热革节孢的外切葡聚糖酶基因cbhk和β-葡萄糖苷酶基因bgk进行克隆,并在毕赤酵母中进行表达,得到CBHK和BGK重组酶。对重组酶进行分离纯化,SDS-PAGE电泳检测蛋白分子量,外切葡聚糖酶CBHK的表观分子量为72kDa,大于理论分子量50kDa,可能是糖基化造成的;β-葡萄糖苷酶BGK的分子量大小为55kDa与理论的分子量大小基本一致。改善酶活性对提高纤维素的降解具有十分重要的作用。基于嗜热革节孢β-葡萄糖苷酶Hi BG的结构,本研究对嗜热革节孢β-葡萄糖苷酶活性位点进口端的12个氨基酸残基进行定点突变。通过同源建模,对来源于嗜热革节孢的外切葡聚糖酶基因进行四个位点的定点突变。并将它们在毕赤酵母中进行了突变基因的高效表达。与野生型外切葡聚糖酶相比,突变体的酶活性都有所降低,其中W163H酶活性降低最多,降低了50%;E429D和Q459T分别降低了40%和35%;突变后W397H活性完全丧失。与野生型β-葡萄糖苷酶相比,所有突变体的酶活力都降低了,其中A260N、F348G、Y179F和F180H酶活性降低较少,分别降低了20%、20%、30%和30%;D237S、L173Q酶活性分别降低了55%和60%;而突变W168H、N335F和W349G的酶活性完全丧失。在纤维素的分解过程中,β-葡萄糖苷酶起着关键作用,酶的催化存在产物抑制现象,大多数酶都存在产物抑制现象,但是一些酶对葡萄糖具有耐受性。嗜热革节孢糖苷水解酶第一家族β-葡萄糖苷酶对葡萄糖具有耐受性,但是具体的作用机制尚不清楚。本研究,通过对嗜热革节孢糖苷水解酶第一家族β-葡萄糖苷酶的12个进口端位点进行定点突变,研究这些位点对于嗜热革节孢第一家族β-葡萄糖苷酶酶活性及葡萄糖耐受性的影响。突变L173Q丧失葡萄糖耐受性,突变Y179F在高浓度葡萄糖时丧失葡萄糖耐受性。初步证明进口端位点对于酶活性及葡萄糖耐受性都具有一定的影响,催化活性通道的结构特异性可能是葡萄糖耐受机制。(本文来源于《山东农业大学》期刊2017-05-01）
崔针针[9]（2017）在《立枯丝核菌第45家族糖苷水解酶PAMP活性区段及位点的研究》一文中研究指出玉米在我国国民经济和农业生产中发挥着重要的作用,在我国粮食和饲料作物及工业原料方面占有举足轻重的地位。玉米纹枯病已成为生产中的主要病害,随着高密度栽培和高氮的推广应用,该病害快速蔓延,在全国各地不同玉米产区产生不同程度的减产,严重影响我国农业生产的产量和质量。植物细胞壁是抵抗外界病原物入侵的天然屏障。植物病原真菌和细菌都能产生细胞壁降解酶,成为在植物细胞内和细胞之间蔓延的主要致病因子,如纤维素酶和果胶酶等。近年来,人们越来越注意到在真菌与植物互作机制方面起作用的细胞壁降解酶。PAMP分子是病原微生物表面存在的一些保守分子,广泛存在于微生物中。植物模式识别受体通过识别病原物模式分子来激活体内信号途径,诱导防卫反应从而限制病原物的入侵。前期研究发现,R.solani AG-1-IA融合群中具有PAMP活性的酶中有β-1,4-内切纤维素酶EG1,EG1是一个PAMP分子,并且有研究证明了PAMP活性与催化活性相互独立。为了进一步确定其发挥作用的区段及具体位点,我们通过一系列实验来探究。我们将EG1的野生型命名为WT,通过基因定点突变将EG1氨基酸序列第32位的天冬氨酸(Aspartic acid,Asp)突变为丙氨酸(Alanine,Ala),导致其催化活性的丧失并命名为D32A。为了确定EG1发挥PAMP活性的区段,我们对EG1的六个相对保守的区段进行了突变,结果发现野生型WT突变区段C6后仍然具有较高的催化活力,能够引起玉米、烟草等植物的叶片坏死,但是不能诱导PAL、POD等防卫反应基因的过量表达;D32A突变区段C6后几乎没有催化活性,既不能引起玉米、烟草等植物的叶片坏死,也不能诱导PAL、POD等防卫反应基因的过量表达。然后利用PVX表达系统进行实验。首先利用PCR扩增法将信号肽序列插入基因5’末端,然后将片段插入pGR106空载体构建PVX表达载体,而后经过冻融法转化农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)GV3101感受态细胞。将携带重组质粒的农杆菌接种烟草叶片,以转化空pGR106载体的农杆菌作为对照(CK),结果发现WT-C6可以使烟草叶片产生病斑,而D32A-C6则不可以。对于WT-C6和D32A-C6的不同表现,我们认为是其对细胞壁纤维素的降解所产生的效果。这些结果证明,C6保守区(序列为GCNWRFDWF)是EG1发挥PAMP活性的关键区段。接着,为了进一步探究EG1的具体活性位点,我们将C6区段内的所有氨基酸进行定点突变,并获得相应的突变工程菌和蛋白,将调整好浓度的纯酶接种玉米后发现,其中一个蛋白RA不能引起玉米叶片的坏死。然后,用调整好浓度的RA的纯酶接种玉米和烟草叶片,同时测定RA接种对玉米和烟草叶片活性氧产生的影响,以及对防卫反应基因表达的影响。结果发现,RA不能使玉米和烟草叶片坏死,也不能使活性氧大量产生,同时不能引起防卫反应基因的过量表达。同时利用PVX表达载体对d32a-ra进行表达,发现携带pGR106/pd32a-ra的重组质粒不能引起烟草叶片的坏死。这些实验结果初步确定了EG1的具体活性位点。本研究证实了R.solani第45家族糖苷水解酶β-1,4-内切纤维素酶EG1发挥PAMP活性的关键区段,同时对其具体位点进行了初步探究。(本文来源于《山东农业大学》期刊2017-05-01）
巴德仁贵[10]（2016）在《甜瓜伐昔洛韦水解酶和持绿蛋白基因家族的全基因组鉴定及分析》一文中研究指出甜瓜(Cucumis melo L.)是世界十大水果之一,具有重要的经济价值,也是研究葫芦科植物果实发育成熟的模式植物。2012年6月甜瓜全基因组测序已完成并公布,为利用生物信息学方法研究新基因及其功能奠定了基础。本研究利用生物信息学方法从甜瓜基因组中鉴定了伐昔洛韦水解酶(valacyclovir hydrolase,VACVase)、持绿蛋白(staygreen protein,SGR)和非黄化蛋白(non-yellow coloring,NYC)基因家族,并进行了生物信息学、表达特性、亚细胞定位和功能分析。主要结果如下：1)本文从甜瓜基因组中鉴定得到两个VACVase,命名为CmVACVase1和CmVACVase2,通过生物信息学分析表明,该蛋白家族高度保守,两个蛋白均无信号肽结构,属于非分泌性蛋白,CmVACVase1和CmVACVase2分别含有4个和3个跨膜结构,属于跨膜蛋白,且分别含有24和15个磷酸化位点。通过启动子分析发现,除了核心元件(CAAT-box、TATA-box、5'UTR Py-rich等)外,含有多种激素应答元件、组织特异表达以及时空特异表达的调控元件。蛋白互作网络分析中分别获得了一个高度同源的映射蛋白,且分别与10个和8个蛋白进行互作。每个基因均搜索得到了2个miRNA,一个是通过互补形式降解靶mRNA,另一个是通过阻遏靶mRNA的翻译来抑制目的基因的表达。从甜瓜基因组中鉴定得到一个NYC蛋白和4个与NYC同源的SGR蛋白,分别命名为CmNYC、CmSGR1～CmSGR4。生物信息学分析显示,CmNYC蛋白含有酯酶/脂肪酶亚家族保守基序(G-X-S-X-G/A),是一个偏弱酸性的不稳定蛋白,其N末端无叶绿体转运肽结构,含有两个跨膜结构,属于跨膜蛋白,且含有27个磷酸化位点。SGR基因家族是NYC蛋白的同源基因,具有相似的功能,该家族蛋白C末端含有一个高度保守的基序(C-X3-C-X-C2-F-P-X5-P),但是在进化过程中,CmSGR3、CmSGR4则缺失了该基序,其家族蛋白的N末端均无叶绿体定位信号肽结构,也没有跨膜结构,不属于跨膜蛋白。2)从甜瓜中分别克隆得到了CmVACVase1、CmVACVase2、CmNYC、CmSGR1、 CmSGR2五个基因的cDNA,分别编码458、398、499、216和257个氨基酸,分子量在24.8-55.4 kDa之间。3)实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR, qPCR)结果显示,CmVACVase1、CmVACVase2在45 DAP的果实中表达量最高,分别是叶片中表达量的355倍和2.6倍,果实发育初期表达量最低,属于果实成熟过程中高表达基因。CmNYC在叶片和子叶中的表达量较高,而果实中表达量较低,但随着果实发育其表达量开始缓慢上升。CmSGR1、CmSGR2的表达量在45 DAP的果实中最高,并且随着果实发育成熟其表达量缓慢上升。而CmSGR3、CmSGR4在叶片、茎和子叶中表达较高,在果实授粉后其表达量开始缓慢降低,到30DAP后表达量有所增加,但幅度不大。4)构建CmVACVase1和CmVACVase2的亚细胞定位载体pUC18-CmVACVase1-GFP和pUC18-CmVACVase2-GFP,转化洋葱表皮细胞,CmVACVase1和CmVACVase2均定位于细胞膜上,属于一类膜蛋白,与预测结果一致。5)瞬时表达结果显示,CmVACVase1和CmVACVase2基因的过表达和RNAi果实注射部位均呈现绿色表型。注射p35S-VACVase1和p35S-VACVase2的果实中表达量分别为对照组的2.21和2.25倍,在CmVACVase1过表达果实中,木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶(Xyloglucan Endotransglucosylase/hydrolase, XTH)基因表达量是对照组的8.1倍,在CmVACVase2过表达果实中,扩张蛋白(expansion protein, EXP)和八氢番茄红素合成酶(1phytoene synthase, PSY)基因表达量分别为对照组的1.7倍和1.5倍。在CmVACVasel的RNAi果实中,ACC氧化酶(ACC oxidase, ACO)和ACC合成酶(ACC synthetase, ACS)基因表达量分别为对照组的3.2倍和2.2倍,其它果实发育相关基因的表达量受到明显的抑制。在CmVACVase2的RNAi果实中,p-半乳糖苷酶(β-galactosidase,β-gal)和EXP基因表达量分别为对照组的51倍和23倍。注射p35S-NYC、p35S-SGR1、 p35S-SGR2果实部位均呈现黄色表型,叶绿素降解明显,而注射ART27-NYC、 pART27-SGR1、pART27-SGR2部位呈现出持绿特征。应用生物信息学方法首次从甜瓜全基因中鉴定得到CmVACVase1、 CmVACVase2、 CmNYC、 CmSGRl、CmSGR2基因并克隆了其cDNA,明确其家族基因结构、系统进化关系、编码蛋白质的基序特点和分布,通过瞬时表达的方法来研究该基因家族的功能,为深入研究其作用机理奠定了基础。对CmVACVasel、CmVACVase2在植物体内的催化功能提供新的认识,为进一步探究CmVACVase家族基因在植物体内的功能提供基础研究资料。为进一步明确CmNYC/CmSGR对甜瓜叶绿素降解、衰老、果实成熟的调控分子机理打下了良好的基础。(本文来源于《内蒙古大学》期刊2016-11-23）
水解酶家族论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
木质纤维素是地球上储量最丰富的可再生资源,其主要成分包括纤维素和各类半纤维素,如甘露聚糖和木聚糖等。通过糖苷水解酶,如纤维素酶,甘露聚糖酶和木聚糖酶催化降解,这些多糖成分可以被水解成可溶性糖,经过生物炼制可以转化为生物燃料和多种化工制品,这为解决当前世界所面临的环境污染和能源短缺提供了一个有效途径。显然,获得适用于特定工业环境的不同种类的糖苷水解酶是降低工业生产成本,加快木质纤维素转化的关键。虽然糖苷水解酶设计工作已经有很多成功的先例,但对它们的活性架构和催化过程分子机制的认识尚不深入。本文基于结构生物信息学方法,对GH5主要亚家族的纤维素酶和甘露聚糖酶进行了序列、结构和分子动态等方面的分析,定位了活性架构中与底物特异性相关的关键氨基酸残基,并对TfCe15A活性中心残基进行了丙氨酸筛选及功能分析,初步阐明GH5家族酶分子不同亚位点关键残基在酶催化中发挥的不同功能,为进一步的酶分子设计奠定了基础。本文的主要内容如下:1.通过对糖苷水解酶GH5家族中6个主要亚家族酶分子的结构生物信息学分析,阐明了不同亚家族酶分子间的主要异同点。对GH5家族主要亚家族序列、结构和分子动态分析显示,不同亚家族酶分子的主要差异存在于构成活性架构的8个loop 区域。比较不同亚家族活性中心序列谱发现,GH5家族酶分子负亚位点残基保守度最高,-1亚位点有3个残基在整个GH5家族内是完全保守的,一2亚位点也有一个色氨酸在GH5家族内完全保守,这些残基可能与催化断键密切相关;还有部分残基在单个亚家族内保守或相对保守,这些残基可能与不同亚家族之间的功能演化相关。2.通过对GH5_2亚家族纤维素酶和GH5_8甘露聚糖酶的结构分析和生化测定,发现了活性架构-1和-2亚位点关键残基在两个亚位点不同的底物识别机制。由于纤维素和甘露聚糖底物-1亚位点糖环不同程度的扭曲,在该亚位点两类底物O3空间位置存在差异,而在-2亚位点,纤维素和甘露聚糖差异在于O2的空间位置。相应地,结构比对结果显示,在-1亚位点,两个亚家族保守的组氨酸和天冬酰胺通过与-1O3的相互作用起到底物识别作用,而在-2亚位点,GH5 2亚家族相对保守的谷氨酸通过与-2O2的相互作用起到底物识别作用。3.通过对TfCe15A所有活性中心氨基酸残基的丙氨酸筛选及生化测定,揭示了活性中心残基在酶催化过程中发挥的不同作用。对TfCel5A活性中心共22个关键氨基酸进行了丙氨酸突变及结合常数Ka和酶活测定,并分析了关键残基在酶催化中发挥的功能。Ka测定结果显示,负亚位点残基在底物结合中至关重要,其中-2亚位点保守的色氨酸和-2/-3亚位点相对保守的带电残基对通过与底物-2/-3亚位点形成密集的氢键网络在底物初始结合中发挥了重要作用。酶活测定显示,-2到+1亚位点残基在催化断键中至关重要,其中与-1O2相互作用的保守组氨酸和酪氨酸通过稳定亲核试剂并维持其带电状态来协助催化断键;与-1O3相互作用的保守组氨酸和天冬酰胺通过与底物间的相互作用协助-1亚位点糖环的扭曲,该过程需要loop3较大幅度的运动;此外,-2和+1亚位点两个保守色氨酸也参与底物形变过程;根据相关残基在GH5家族中的高保守度可知,它们在催化断键中发挥的重要作用在整个GH5家族中是一致的。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
水解酶家族论文参考文献
[1].陆璐,陶雅军,罗学娅,马君燕.糖苷水解酶32家族结构与功能的研究进展[J].中国酿造.2019
[2].田震楠.糖苷水解酶GH5主要亚家族活性架构功能探究[D].山东大学.2019
[3].杨宇萌.GH12家族糖苷水解酶Cel12A的功能研究[D].东北师范大学.2019
[4].吴秀芸.糖苷水解酶GH11家族结构稳定性分析及活性架构功能设计[D].山东大学.2018
[5].杨志芹.嗜热真菌糖苷水解酶第七家族基因的克隆、表达及分子改造[D].山东农业大学.2018
[6].刘娇娇.嗜热革节孢第十二家族糖苷水解酶基因的克隆、表达及分子改造[D].山东农业大学.2018
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