导读:本文包含了报告基因体系论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:Bmal1,昼夜节律,血清刺激,叁氯乙醇
报告基因体系论文文献综述
高杰[1]（2015）在《时钟报告基因体系的研究》一文中研究指出目的时钟报告基因检测体系广泛应用于昼夜节律的研究，为了使用该体系分析血清中节律因子的差异，需要回答叁个问题。第一，据文献记载，时钟报告基因体系在检测荧光信号时，其培养基中不含血清成分。因此需要明确在培养基中添加血清是否影响细胞的状态，是否影响对于荧光信号的检测；第二，需要明确不同时间点采集的血样是否含有不同的节律信号分子。第叁，需要分析麻醉剂对于分子时钟的影响，以选择合适的麻醉方法。方法分别使用含胎牛血清和B27的培养基，培养表达报告基因Per2-dluc和Bmal1-dluc的U2OS细胞，通过形态学、台盘蓝计数和流式细胞分析方法比较不同培养条件下细胞生长、增殖和细胞周期水平的差异；使用Lumicycle系统检测细胞中Bmal1和Per2表达昼夜波动水平的差异。使用叁氯乙醇（TCOH，水合氯醛的主要药效成分）处理表达Bmal1-dluc或Per2-dluc的U2OS细胞，分析TCOH是否直接影响分子时钟。使用水合氯醛或二氧化碳麻醉大鼠的血清，培养表达Bmal1-dluc或Per2-dluc的U2OS细胞，分析基因昼夜表达波动水平的差异。结果含胎牛血清和B27的培养基两种培养条件下细胞生长、增殖、细胞周期以及Bmal1和Per2表达昼夜波动均无明显差异。采集于不同时间点的血清，其诱导细胞节律同步化的功能基本相似。在1.5mM的TCOH作用下，Bmal1的表达波动周期延长了3h，在3mM的TCOH作用下，Bmal1的表达波动周期延长5小时。但是，低浓度TCOH对于Bmal1的表达波动周期无明显影响。TCOH对于Per2的表达波动周期无明显影响。水合氯醛麻醉的大鼠的血清也具有调节Bmal1表达波动周期的效果，提示进行昼夜节律研究中需要选择合适的麻醉方法。结论U2OS细胞可以用于分析血清中节律因子的分析；不同时间采集血清样进行分析是一种可行的方式；TCOH能够直接调控分子时钟；不能使用水合氯醛麻醉动物以进行血清节律分子的研究。(本文来源于《首都医科大学》期刊2015-05-11）
刘旭娇[2]（2014）在《农杆菌介导大豆转化体系优化及报告基因DsRed2表达效率评估》一文中研究指出大豆作为重要的油料作物和经济作物，是食用油和蛋白质的主要作物来源，在食品工业和农业生产中占重要地位。随着基因工程技术的不断发展，利用转基因技术培育大豆新品种、新种质得到了广泛的应用。在我国，对转基因作物的研究还处于起步阶段，因此，加强我国转基因大豆的自主研发，提高大豆遗传转化效率是我国大豆遗传改良的重中之重。为了改良大豆植株再生体系，提高农杆菌介导大豆子叶节体系遗传转化效率，建立稳定高效的转化体系，本实验对不同基因型和萌发时间条件下的丛生芽诱导率、伸长率以及瞬时阳性率进行统计，筛选出最适基因型和萌发时间。本研究选用了Jack、Williams82、中黄13、自贡冬豆和吉林小粒1号5个品系，对其在不同萌发时间诱导下的再生能力进行分析。分析结果表明，Jack品系作为大豆子叶节体系外植体时，其再生效率较高，生长稳定，最适合用于转化实验。而后，分别以萌发3-8天的Jack品系大豆子叶作为外植体，进行植株再生实验和根癌农杆菌侵染实验，统计其再生过程中，丛生芽诱导率、伸长率及瞬时阳性率。实验结果表明，萌发3天的大豆子叶最适合作为再生体系和转化体系的外植体，其丛生芽诱导率、伸长率以及瞬时阳性率均高于其他天数，呈现显着差异。现今，植物转化体系最常用的报告基因为GUS基因和GFP基因。但GUS基因不可用于活体检测，GFP基因虽然可以进行活体、连续的检测，但其绿色荧光很大程度上受到植物自身色素的影响。在本研究中，GFP基因仅在发状根中可以检测，在子叶中难以观测。而新型报告基因DsRed2既继承了GFP基因可活体、连续检测等优点，而且与GFP基因相比，DsRed2基因激发光和发射光波长较长，在激发光照射下呈现红色，减小检测受体中所含有的叶绿素等色素的干扰，信噪比较高，在细胞内荧光效率更高，更易检测。本研究将GFP基因与DsRed2基因分别连接在植物表达载体pTF101.1上，并用分别含有上述两种载体以及pTF102载体的根癌农杆菌EHA101侵染萌发3天的Jack品系大豆，观测共培养后、诱导前子叶节部位瞬时阳性表达。实验结果表明，在大豆子叶节部位很难检测到GFP基因的表达，但转DsRed2基因的大豆子叶节部位可观测到清晰的阳性芽点，但其阳性表达率略低于GUS基因。而后分别用含有pgfpGUS载体和pDsRed2GUS载体的发根农杆菌K599侵染Jack品系大豆，观测发状根的阳性率。实验结果表明，GFP与DsRed2均可检测到阳性发状根，DsRed2基因表达效率略低于GUS基因，但与GFP基因相仿。(本文来源于《哈尔滨师范大学》期刊2014-06-01）
张雅婧[3]（2014）在《构建Ⅰ型内含子核酶介导癌胚抗原双报告基因显像体系的实验研究》一文中研究指出目的癌胚抗原分子(CEA)在多种肿瘤细胞中过表达,作为肿瘤标志物被广泛用于评价结直肠癌、乳腺癌、肺癌等肿瘤的预后。报告基因显像技术的发展为评估肿瘤治疗疗效以及肿瘤癌基因的表达提供了优越的可行性。如何在活体水平对癌基因的表达进行有效、实时且无创性的监测是目前评估肿瘤治疗效果而亟需解决的难点。本实验目的拟构建含有靶向CEA序列的反式剪接型I型内含子核酶(Rib53)为载体核心介导的荧光素酶-核素(Fluc-HSVl-tk)双报告基因显像系统,实现在活体水平直接、靶向、实时监测靶基因表达,进而达到评价肿瘤疗效与预后的目的。方法利用基因工程技术构建靶向癌胚抗原(CEA)的反式剪接型I型内含子核酶及核酶-荧光素酶-胸苷激酶(Rib53-Fluc-tk)报告质粒；转染Rib53-Fluc-tk于MCF-7乳腺肿瘤细胞系及共转pCDNA3.1-CEA及Rib53-Fluc-tk质粒于293T细胞中,分别用双报告荧光素酶、逆转录PCR、Real-time PCR、免疫细胞荧光、细胞生物发光等技术检测核酶对靶基因的剪接产物以及报告基因的表达；Iodogen固相氧化法标记氟-阿糖呋喃基尿嘧啶(FAU)后进行细胞摄取动力学实验。共转染Rib53-Fluc-tk及CEA质粒于293T细胞中,24小时后将细胞接种于裸鼠皮下行活体小动物生物发光显像,验证该双报告基因显像体系的可行性及最佳显像条件。数据分析采用独立样本t检验、单因素方差分析,P<0.05具有统计学意义。结果1.以核酶为核心的双报告载体Rib53-Fluc-tk质粒的构建四膜虫基因组PCR获得Rib DNA,大小为516bp,产物大小与预期一致；将Rib及Fluc序列克隆至pcDNA3.1质粒形成Rib3-Fluc报告质粒,琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切条带大小正确,条带大小约为2200bp,送检测序结果正确。PCR获得Rib53-Fluc-tk条带,大小为3267bp,送检测序结果正确。2.核酶剪接产物的相关检测体外培养MCF-7、SK-OV-3以及Hela叁种细胞系,在MCF-7细胞中检测到CEA的表达,而在SK-OV-3及Hela细胞中均未检测到CEA的表达。Rib53-Fluc-tk质粒转染MCF-7细胞、SK-OV-3以及Hela细胞中,在MCF-7细胞系中检测到荧光素酶的表达,比值可达0.639±0.099,随着Rib53-Fluc-tk质量的增加而比值增加(P=0.006)。而另外两组细胞系中荧光素酶的表达较低,荧光素酶值分别为0.023±0.002(P=0.003),0.033±0.003(P=0.004)。共转染CEA及Rib53-Fluc-tk1μg于293T细胞中,当CEA质量分别为0μg、0.2μg、 lug时,荧光素酶比值分别为0.0794-0.010；0.145±0.033(P=0.192)；0.653+0.130(P=0.048)：3.237±0.09-(P=0.001)。将MCF-7及SK-OV-3细胞转染Rib53-Fluc-tk后提取RNA,逆转录PCR提取剪切产物,MCF-7泳道可见一条带,大小一致,SK-OV-3泳道未见条带。Real-time PCR检测到MCF-7细胞转染Rib53-Fluc-tk后CEA的相对含量表达减低,而仅转染空载pCDNA3.1的MCF-7细胞的CEA含量却无明显减少(P=0.019,P=0.003)。将Rib53-Fluc-Tk转染MCF-7细胞48小时后行细胞免疫荧光,可见细胞浆内荧光较均匀分布。3.131I-FIAU的合成采用Iodogen固相氧化法进行FAU的131I标记,标记产物经C-18小柱纯化。131I-FIAU的标记率为64.02±4.79%(n=3),放化纯为95.96±1.07%(n=3),标记产物在人血清24小时的稳定性为95.74±0.86%(n=3)。4.131I-FIAU的细胞摄取在293T细胞中单独转染Rib53-Fluc-tk质粒,至4.5h时细胞摄取率仅达到0.310±0.01%(n=4)；在293T细胞中共转染pCDNA3.1-CEA、Rib53-Fluc-tk质粒,随着时间的增加,293T细胞对131I-FIAU的摄取逐渐增加,至4.5h时摄取率达到1.40±0.06%(n=4),P<0.01；在MCF-7细胞中转染Rib53-Fluc-tk质粒,随着时间的增加细胞摄取率增加不明显,在2.5h达到最高,最高仅达0.64±0.04%(n=4)。5.细胞生物发光检测将如下质粒分别转染293T细胞：阳性参照组pDC316-Fluc-Egfp-Tk1μg;实验组CEA1μg+Rib53-Fluc-Tk1μg;阴性参照组：Rib53-Fluc-Tk1μg,转染48小时后加入荧光素酶底物荧光素-D行生物发光检测,阳性参照组可探测到较强生物发光信号,实验组可探测生物发光信号,阴性参照组未探测明显生物发光信号。6.裸鼠生物发光显像准备3-4周龄裸鼠9只,随机分成3组,每组3只。将如下质粒分别转染293T细胞：阳性参照组pDC316-Fluc-Egfp-Tk5μg;实验组CEA5μg+Rib53-Fluc-Tk5μg;阴性参照组：Rib53-Fluc-Tk5μg。转染24小时后收集细胞,将这叁组细胞分别皮下接种于以上3组裸鼠的右下肢,每组注射3只。行生物发光现象,阳性参照组裸鼠中细胞注射部位未探测明显生物发光信号；实验组未探及生物发光信号；阴性参照组未探及生物发光信号,与预期一致。结论本实验成功构建了以I型内含子核酶为核心介导的靶向CEA的双报告基因体系。核酶载体能选择性剪接CEA,形成了肿瘤靶向分子与报告基因的融合蛋白表达,从而在细胞水平上成功地对CEA mRNA进行了生物发光以及核素双报告基因的显像。我们的研究为核酶介导报告基因显像提供了体外实验的前期基础。正是因为核酶特异性的剪接作用,报告基因才能特异性地反映靶向分子的表达的部位及含量。通过形成CEA及报告基因的融合产物,解决了报告基因系统与靶基因结合率低、显像特异性不理想的缺点。如若能提高核酶的剪切效率实现小动物活体显像的灵敏度,便可以用于监测siRNA、放化疗的疗效,具有较广阔的临床价值。目的正电子发射断层扫描(PET)已被广泛应用于肿瘤的诊断、疗效评估、肿瘤复发及组织坏死的鉴别诊断。[11C]甲硫氨酸PET显像是目前最常用的氨基酸PET显像方法。药物动力学主要是利用动力学原理与数学模型来描述药物在体内的吸收、分布、代谢与排出情形,其研究方法是利用药物浓度与时间的关系,选择合适的药物动力学模型(pharmacokinetic model),计算出药物动力学参数来反映药物在体内的变化。新近发表的[11C]甲硫氨酸PET显像文献展示了[11C]甲硫氨酸在正常人体及胶质瘤患者的生物学分布,然而目前对于甲硫氨酸在胶质瘤与黑色素瘤相关模型动力学分析的研究比较有限。因此本次实验研究是拟在裸大鼠胶质瘤以及裸小鼠黑色素脑肿瘤活体对[11C]甲硫氨酸PET进行模型动力学分析,研究相关动力学参数以及寻找最佳的数学模型来定量分析[11C]甲硫氨酸在肿瘤的生物分布以及穿透血脑屏障的能力,以便将来耶鲁PET中心在受试人体应用[11C]甲硫氨酸PET显像进行模型动力学分析。方法分别在裸大鼠(nude rats,n=4)及裸小鼠(nude mice,n=2)脑部立体定位注射脑胶质瘤细胞U87MG以及人黑色素瘤细胞YUMAC,分别构建裸大鼠胶质瘤肿瘤模型以及裸小鼠黑色素瘤脑肿瘤模型。[11C]标记甲硫氨酸,并行高效液相层析仪(HPLC)检测[11C]甲硫氨酸放化纯。立体定位注射叁周后每只裸大鼠分别注射18.5～37MBq [11C]甲硫氨酸,裸小鼠分别注射1.85～3.7MBq[11C]|甲硫氨酸行动态PET显像。在PET图像上勾画左心室及脑肿瘤等感兴趣区获得输入功能曲线、时间活度曲线。通过软件计算获得脑肿瘤总分布体积(VD),分别用二腔室模型(one-tissue compartment model、叁腔室模型(two-tissue compartment model)、Patlak模型以及多线性(MA1model)模型来计算并获得相应的参数K1,k2,k3, k4和Ki,VD。结果裸大鼠脑肿瘤模型中二室模型更好地拟合[11C]甲硫氨酸在脑胶质瘤的生物分布,在裸大鼠脑肿瘤模型中VT为3.894±0.149ml/cc/min(n=4),K1为0.157±0.014ml/cc/min(n=4),k2为0.041±0.004/min(n=4);在裸小鼠黑色素脑肿瘤模型叁室模型较二室模型能更好地拟合,VT为1.536±0.030ml/cc/min(n=2),K1为0.175±0.046ml/cc/min (n=2),k2为0.115±0.032/min(n=2),k3为0.407±0.095/min(n=2),k4为0.567±0.139/min(n=2)。Patlak模型在裸大鼠及裸小鼠均能较好地拟合,ki值分别为0.043±0.002ml/cc(n=4),0.019±0.0001ml/cc(n=2)。结论裸大鼠中二室模型能较好地拟合显像剂在脑组织的生物分布,VT及K1能较好地反映显像剂在脑组织的分布提及以及穿透血脑屏障的能力,并且K1能够反映[11C].甲硫氨酸随脑血流进入血脑屏障的速率,k2则反映了[11C]甲硫氨酸随之被动扩散排出大脑的速率。裸小鼠中叁室模型能更好地描述显像剂在脑黑色素瘤的分布。ki反映脑组织对显像剂由血浆至肿瘤组织不可逆的摄取。药物动力学参数较标准化摄取(SUV)等能更灵敏、准确地反映[11C]甲硫氨酸在体内的生物分布,同时在将来肿瘤放化疗疗效评估时,可通过计算以上药物动力学参数来反应肿瘤组织[11C]甲硫氨酸分布的变化,从而更敏感地评价药物疗效。(本文来源于《华中科技大学》期刊2014-05-01）
胡春霞,叶梦情,岑益超,易明花[4]（2013）在《以绿色荧光蛋白为报告基因的环境砷离子生物检测体系的构建》一文中研究指出目的建立环境中砷的生物检测方法。方法根据GenBank中已发表的革兰阳性菌中参与砷抗性机制的操纵子序列R46 ars,人工合成arsR全部序列(含小部分arsD基因序列)及其上游的启动子序列,以绿色荧光蛋白基因为报告基因,构建含砷离子特异性诱导启动子表达载体pET28a(+)-ars-gfp,并采用感受态转化法将该重组表达载体转化入大肠埃希菌表达宿主菌Escherichia coli BL21(DE3)中,构建砷离子检测菌株,并进行PCR和酶切鉴定。结果通过PCR和酶切鉴定,表明重组表达载体成功构建并转化入大肠杆菌E.coli BL21(DE3),绿色荧光蛋白报告基因在有砷离子(0.2~1.0μmol/L)存在的环境中得到表达。结论该菌株适用于环境中砷的生物检测。(本文来源于《环境与健康杂志》期刊2013年07期）
徐志超,徐江,季爱加,汪波,孙伟[5]（2012）在《基于gus报告基因的灵芝转化体系建立》一文中研究指出灵芝(Ganodermalucidum)是我国传统药物中有多种治疗和保健作用的药用真菌。本课题组于2012年6月发表了灵芝基因组的研究结果,推动灵芝成为中药学研究中的首个模式药用物种。遗传转化体系平台是模式药用物种研究的基础,高效稳定的遗传转化体系将极大的推动模式物种的研究。之前本课题组已经建立基于绿色荧光蛋白(GFP)报告基因的遗传转化系统。由于灵芝存在微弱本底荧光,为了进一步确认已有转化体系的有效性,本课题组利用植物表达载体pCAMBIA1305.1的gus plus基因为报告基因,以潮霉素抗性基因(hygromycinphosphotransferase)为筛选基因,将原有CaMV35S启动子替换为真菌强启动子香菇(Lentinusedodes)叁磷酸甘油醛脱氢酶(GPD)启动子,构建好的载体命名为p1305.1-GPD。通过冻融法将重组质粒转入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)GV3101,携带重组质粒的农杆菌经乙酰丁香酮(AS)2小时诱导后侵染灵芝菌丝,经共培养2天,筛选培养基培养10天后,得到具有潮霉素抗性的转基因灵芝株系。转化子在GUS组织染色后呈现明显的蓝色,对照无颜色变化,表明GPD驱动的gus基因在灵芝中得到较高表达。本工作表明gus系统可以有效的作为灵芝转化体系报告系统,也为下一步完善高效稳定的灵芝遗传转化体系奠定基础。(本文来源于《中药与天然药高峰论坛暨第十二届全国中药和天然药物学术研讨会论文集》期刊2012-11-02）
信丽丽[6]（2012）在《HSPA1A启动子荧光素酶报告基因HepG2细胞体系的建立和在环境污染物毒性评估中的应用》一文中研究指出近年来,随着社会经济的飞速发展,环境污染问题也日益突出。环境污染严重威胁着人类的身体健康,而且已成为21世纪社会发展所面临的重大公共卫生问题之一。环境污染主要包括大气污染、水体污染和土壤污染,其中对人类健康影响最直接和最严重的是空气污染。空气污染物主要包括以单一化学物质形式存在的烃类和甲醛等气态污染物和以复合物形式存在的总悬浮颗粒物等大气颗粒污染物。空气污染物主要通过呼吸道等途径进入机体,与人类的呼吸和心血管等系统疾病的发生密切相关。在环境污染物对人类健康效应的研究中,毒性评估是最常用和最有效的手段之一。目前常用的测定细胞存活率、氧化损伤和遗传损伤等细胞损伤水平的毒性评估实验耗时长、操作复杂,且仅能分析环境污染物对细胞或生物体的某一类毒性效应。因此,亟须建立一种操作简便、成本较低的毒性评估方法来综合评价空气中的单一和复合化学污染物的各种毒性。近年来,基于细胞应激基因启动子调控的荧光素酶报告基因实验已成为最具有潜力的毒性评估方法之一。热休克反应(Heat Shock Response, HSR)是以热休克蛋白(Heat Shock Proteins, HSPs)的诱导合成为主要特征的细胞应激反应。在众多的HSPs家族中,最为重要的是由HSPA1A基因编码HSPA1A(Hsp70-1)蛋白。HSPA1A通常参与蛋白质的合成和折迭,错误折迭蛋白质的正确折迭和降解。当细胞受到各种应激因素,如高温、重金属和化学毒物等作用后,胞质中的热休克因子Heat Shock Factor, HSF)被激活并进入细胞核与位于HSPA1A启动子区域的热休克元件(heat shock element, HSE)结合,激活HSPA1A基因的转录,启动HSPA1A蛋白的表达。由于该基因对各种环境应激因素十分敏感,HSPA1A基因的表达逐渐成为环境污染物对细胞或生物体早期毒性效应的一种敏感的标志物。目前,基于HSPA1A基因启动子调控的荧光素酶报告基因实验已成为常用的环境污染物毒性评估方法之一。尽管有研究者选用了HSPA1A启动子调控的荧光素酶报告基因细胞体系来评估重金属、有机氯化合物、城市废水等水体和土壤污染物的毒性,但是,利用HSPA1A启动子荧光素酶报告基因技术来评估多环芳烃、甲醛、汽车尾气和焦炉逸散物等单一和复合空气污染物的毒性的研究鲜有报道。基于上述研究,本研究拟构建稳定转染HSPA1A启动子调控的荧光素酶报告基因质粒的HepG2细胞体系(HepG2/HSAPA1A细胞),并用该细胞来综合评价空气中常见的单一和复合化学污染物的毒性。芘、苯并[a]芘、甲醛、汽车尾气和焦炉逸散物等环境污染物作用HepG2/HSAPA1A细胞后,分别测定细胞的荧光素酶活性、存活率、细胞培养上清液中的丙二醛(MDA)浓度、细胞的DNA损伤水平和微核率,并将HepG2HSPA1A细胞体系与细胞存活率实验、MDA实验、单细胞凝胶电泳和微核实验分别进行比较来评价HepG2/HSPA1A细胞体系在化学污染物的综合毒性评估中的应用和该细胞体系的敏感性。本研究的假设是HepG2/HSPA1A细胞体系的荧光素酶活性可以敏感地反映环境污染物对细胞的综合毒性效应。本研究共分为叁部分：第一部分HSPA1A启动子荧光素酶报告基因HepG2细胞体系(HepG1/HSPA1A细胞)的建立本研究运用脂质体转染技术来构建HSPA1A启动子荧光素酶报告基因HepG2细胞体系(HepG2/HSAPA1A细胞)。首先,我们构建了pGL4.17/HSPA1A重组质粒,然后将经酶切和测序鉴定的重组质粒转染入HepG2细胞中,并用G418筛选稳定转染的HepG2/HSPA1A细胞。最后,我们对HepG2/HSAPA1A细胞体系进行鉴定。分别用Western blotting实验和Luciferase assay system试剂盒测定42℃热休克1h后37℃恢复不同时间的HepG2/HSAPA1A细胞的HSPA1A的表达水平和荧光素酶活性。Western blotting结果显示,与未热休克对照组相比,热休克后HepG2/HSPA1A细胞的HSPA1A的表达水平升高,且在恢复培养4h后达到峰值,随后下降。3次独立实验分析结果显示,恢复培养4h后HSPA1A的表达水平是对照组的3倍。与对照组相比,热休克后细胞的相对荧光素酶活性均显着增加(P<0.01),且与HSPA1A的表达水平呈相似的变化趋势。热休克恢复培养4h后细胞的相对荧光素酶活性达到峰值,为对照组的9倍。Spearman相关性分析结果显示HSPA1A的表达水平与细胞的相对荧光素酶活性呈显着正相关。热休克是经典的引起热休克反应的应激条件。热休克后,HepG2/HSPA1A细胞体系的HSPA1A的表达水平明显升高,HSPA1A基因的启动子也增强了转录,这些研究结果表明HepG2/HSPA1A细胞体系已构建成功,且该细胞体系可以用于敏感地评估环境应激因素对细胞的早期毒性效应。第二部分HepG2/HSPA1A细胞体系在评价空气中单一化学污染物毒性中的应用为了研究HepG2/HSPA1A细胞体系在空气中单一化学污染物毒性评估中的应用,我们用空气中常见的叁种单一化学污染物(非致癌性多环芳烃芘、致癌性多环芳烃苯并[a]芘和致突变剂甲醛)作用HepG2/HSPA1A细胞24h后,分别测定细胞的相对荧光素酶活性、细胞存活率、氧化损伤水平(MDA浓度)和遗传损伤水平(Olive TM值和微核率)。研究结果显示,芘染毒后,HepG2/HSPA1A细胞的相对荧光素酶活性随着染毒剂量的增加而逐渐增加,与对照相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。在最高染毒剂量下(100μM),细胞的相对荧光素酶活性为对照组的2.4倍。不同浓度的苯并[a]芘染毒HepG2/HSPA1A细胞后,细胞的相对荧光素酶活性均显着增加。在染毒20μM时,细胞的相对荧光素酶活性是对照组的2.7倍。较低剂量的甲醛(1μM)也能显着增加细胞的相对荧光素酶活性,且在最高染毒剂量(40μM)下,细胞的相对荧光素酶活性为对照组的1.6倍。芘染毒后,细胞的相对荧光素酶活性仅与MDA浓度呈显着正相关(P<0.01)。苯并[a]芘和甲醛染毒后,细胞的相对荧光素酶活性与Olive TM值及细胞微核率均呈显着正相关(P<0.01)。引起细胞的相对荧光素酶活性显着增加所需的芘、苯并[a]芘和甲醛的剂量是等于或低于细胞存活率显着降低、MDA浓度显着增加、细胞Olive TM值和微核率显着增加所需的最低剂量。这些研究结果表明Hep2/HSPA1A细胞的荧光素酶活性不仅可以作为单一化学污染物所诱导的细胞早期损伤的一个敏感的指标,而且可以综合反映单一化学污染物所诱导的细胞氧化损伤和遗传损伤等毒性效应。HepG2/HSPA1A细胞体系可以用于评估空气中单一化学污染物的综合毒性。第叁部分HepG2/HSPA1A细胞体系在评价空气中复合化学污染物毒性中的应用在研究了HepG2/HSPA1A细胞体系在单一化学污染物毒性评估中的应用之后,本部分将进一步探讨该细胞体系是否可以用于评估空气中的复合化学污染物的毒性。汽车尾气是人类生活环境中的污染物的一个重要来源,大多数个体每天都会暴露于一定量的汽车尾气。焦炉逸散物是燃煤型污染物的代表,其中含有大量的致癌性有毒物质,严重威胁着作业工人的身体健康。故本部分我们选择在交通拥挤的街道及焦化厂工人不同作业区分别采集空气样本,并研究这些空气样本对HepG2/HSPA1A细胞的各种毒性效应。结果显示,不同浓度的汽车尾气作用细胞后,细胞的相对荧光素酶活性均显着增加。且在0.6ng/l的剂量作用下,细胞的相对荧光素酶活性是对照组的1.4倍。在最低染毒剂量(6pg/l)作用下,细胞的相对荧光素酶活性与对照组相比,差异仍有统计学意义(P<0.01)。炉底焦炉逸散物染毒细胞组的相对荧光素酶活性显着增加,与对照组相比,差异均有统计学意义(P<0.01)。且在0.15μg/l的剂量作用下,细胞的相对荧光素酶活性最高,为对照组的1.4倍。细胞的相对荧光素酶活性随着炉侧和炉顶焦炉逸散物浓度的增加而逐渐增加,差异均有统计学意义(P<0.01)。在炉侧和炉顶焦炉逸散物染毒最高浓度时(65.4μg/l,202μg/l),细胞的相对荧光素酶活性分别为对照组的2.1和5.3倍。汽车尾气样本作用后,细胞的相对荧光素酶活性与Olive TM值及细胞微核率均呈显着正相关(P<0.01)。炉底焦炉逸散物作用后细胞的相对荧光素酶活性与MDA浓度呈显着正相关,差异有统计学意义(r=0.404,P<0.05)。炉底、炉侧和炉顶焦炉逸散物染毒后,HepG2/HSPA1A细胞的相对荧光素酶活性均与Olive TM值、细胞微核率呈显着正相关(P<0.05)。在低剂量的汽车尾气(0.006ng/l)和焦炉逸散物(0.006μg/l)作用下,细胞的相对荧光素酶活性已显着增加,该剂量是等于或低于细胞存活率显着降低、MDA浓度显着增加、细胞Olive TM值和微核率显着增加所需的最低剂量。这些研究结果表明,HepG2/HSPA1A细胞的荧光素酶活性可以敏感地反映汽车尾气和焦炉逸散物对细胞的毒性效应。热休克反应是非特异性的细胞应激反应,RepG2/HSPA1A细胞的荧光素酶活性能够综合反映复合化学污染物对细胞的早期损伤。故HepG2/HSPA1A细胞体系可以用于评估环境复合污染物的综合毒性。综上所述,本课题的主要研究结果如下：(1)叁种单一化学污染物(芘、苯并[a]芘和甲醛)和两种复合化学污染物(汽车尾气和焦炉逸散物)作用后,HepG2/HSPA1A细胞的相对荧光素酶活性均显着增加,非致癌的芘和较低浓度的汽车尾气(pg/l)也能显着增加细胞的荧光素酶活性；(2)在很低的剂量作用下(pg/l)我们即可观察到细胞的相对荧光素酶活性显着增加,这些剂量是等于或小于细胞存活率显着降低,细胞氧化损伤和遗传损伤水平显着增加所需的最低剂量,HepG2/HSPA1A细胞的荧光素酶活性可以作为环境污染物对细胞早期损伤的一个敏感指标；(3)所有的待测定的环境污染物作用后,HepG2/HSPA1A细胞的相对荧光素酶活性与细胞的氧化损伤和遗传损伤水平(MAD浓度、Olive TM值和微核率)之间呈显着正相关,HepG2/HSPA1A细胞的荧光素酶活性可以综合反映环境化学污染物所诱导的细胞氧化损伤和遗传损伤等毒性效应；(4)与检测细胞存活率、氧化损伤和遗传损伤水平的毒理学实验相比,用HepG2/HSPA1A细胞体系来检测环境污染物的毒性更加敏感；(5)热休克反应是非特异性的细胞应激反应,与评价细胞的某些特定毒性终点效应的毒理学实验相比,HepG2/HSPA1A细胞体系可以用于评估单一和复合化学污染物的综合毒性。本课题的创新之处在于：(1)选用了具有Ⅰ相和Ⅱ相反应所需的各种代谢酶活性的HepG2细胞来构建毒性评估体系；(2)选用空气中很常见的叁种单一化学污染物(芘、苯并[a]芘和甲醛)和两种复合污染物(汽车尾气和焦炉逸散物)来证实HepG2/HSPA1A细胞体系在环境污染物毒性评估中的应用；(3)将HepG2/HSPA1A细胞体系与其他的测定细胞存活率、氧化损伤和遗传损伤水平的毒理学实验进行比较,并对结果进行相关性分析以证实HepG2/HSPA1A细胞体系在环境污染物对细胞的综合毒性评估中的应用和该细胞体系的敏感性。本研究有待进一步研究之处有：(1)有待进一步研究HepG2/HSPAlA细胞体系在空气中其他的单一和复合化学污染物的毒性评估中的应用；(2)有待进一步将HSPA1A启动子荧光素酶报告基因技术与其他的细胞毒理学实验进行比较以充分证实HepG2/HSPA1A细胞体系是否可以用于评估环境污染物的综合毒性；(3)有待进一步构建活体毒性评估体系(如转基因鼠)来更真实的反映环境污染物的毒性。(本文来源于《华中科技大学》期刊2012-05-01）
王磊,胡昌华,廖国建[7]（2011）在《基于报告基因和核糖体工程的达托霉素高产菌株筛选体系的建立和应用》一文中研究指出达托霉素(daptomycin)是由玫瑰孢链霉菌产生的一种新型环脂肽抗生素,临床上用于治疗革兰氏阳性菌包括耐药菌导致的感染。选育达托霉素的高产菌株对降低该抗生素的生产成本,实现大规模生产有重要的意义。我们综合采用了能方便地表征达托霉素生物合成簇转录水平的报告基因和快速获得大量突变株的核糖体工程技术来获得达托霉素高产菌株。首先利用链霉素抗性筛选获得玫瑰孢链霉菌核糖体突变库,随机挑选50株突变株,然后用卡那霉素抗性基因作为报告基因进行筛选,获得10株阳性菌株,产量检测发现其中2株达托霉素产量显着提高,为对照株的2倍。该方法整合了核糖体工程和代谢工程的优点,提高了筛选效率(从2.5%提高至20%),也为其它代谢产物高产突变株的筛选工作提供了借鉴。(本文来源于《中国的遗传学研究——遗传学进步推动中国西部经济与社会发展——2011年中国遗传学会大会论文摘要汇编》期刊2011-08-09）
李杨阳,曲延英,杨婷,刘艳,冯方剑[8]（2011）在《以GFP为报告基因优化农杆菌介导海岛棉转基因体系的研究》一文中研究指出为了进一步建立优化的根癌农杆菌介导海岛棉外源基因转化体系,提高海岛棉外源基因转化率。以生理状态基本一致的海岛棉新海30号的胚性愈伤组织为受体材料,以绿色荧光蛋白基因(GFP)为报告基因,将浸染时间和共培养时间作为试验要素,筛选适宜的浸染时间和共培养时间。结果表明,根癌农杆菌介导的海岛棉外源基因转化体系的最佳浸泡时间为15 min,共培养时间为24 h。(本文来源于《新疆农业大学学报》期刊2011年04期）
连红可[9]（2011）在《‘突尼斯软籽’石榴再生体系和GFP报告基因的瞬时表达研究初报》一文中研究指出以‘突尼斯软籽’石榴叶片和茎段为外植体,探讨了‘突尼斯软籽’石榴叶片和茎段的再生体系、不同浓度抗生素对外植体的影响以及GFP报告基因的瞬时表达体系。研究结果如下:1.建立了‘突尼斯软籽’石榴叶片再生体系。研究结果表明:从人工气候室采摘的离体叶片用0.1% HgCl2灭菌4min效果最好;叶片分化愈伤组织的最佳培养基为MS+BA1.0mg/L+ NAA0.3mg/L;诱导不定芽的最佳的培养基为MS+NAA0.3mg/L+TDZ1.5mg/L+KT1.0mg/L;不定芽抽生成茎段,效果最好的培养基为MS+NAA1.0mg/L+BA0.2mg/L+KT1.0mg/L;生根培养基为MS+1/2NAA0.5mg/L,其根系较粗壮,生根移栽后的成活率可达85%。2.建立了‘突尼斯软籽’石榴茎段再生体系。研究结果表明:从人工气候室采摘的离体茎段用0.1% HgCl2灭菌3min效果最好;茎段分化愈伤组织的最佳培养基为MS+ NAA 0.1 mg/L + TDZ 1.0mg/L ;愈伤组织分化不定芽的最佳培养基为MS+NAA0.2mg/L+TDZ1.0mg/L+KT1.0mg/L ;不定芽抽生茎段,效果最优的培养基为MS+NAA0.2mg/L+KT1.0mg/L;之后将这些茎段放入生根培养基MS+1/2NAA0.5mg/L后,产生比较粗壮的根系,生根之后移栽即可成活,成活率可达85%以上。3.比较了两种‘突尼斯软籽’石榴再生体系的优越性。研究结果表明:综合各种因素,叶片再生效果比茎段效果更佳。4.筛选了‘突尼斯软籽’石榴外植体对聚乙烯吡咯烷酮的浓度。研究结果表明:聚乙烯吡咯烷酮(PVP)浓度为1.0g/L时效果最佳。5.筛选了‘突尼斯软籽’石榴抗生素的浓度。研究结果表明:卡那霉素(Kan)的浓度为50mg/L时,愈伤组织受到明显抑制,可以用来筛选转基因材料;头孢霉素(Cef)的浓度为500mg/L时,可以有效抑制菌株的生长。6.初步研究了GFP报告基因的瞬时表达情况。但结果表明:转化材料与对照均发出绿色荧光,两者差异不明显。(本文来源于《河南农业大学》期刊2011-05-12）
唐小峦,李焕德,袁娟[10]（2010）在《基于报告基因的PPAR-α激动剂筛选体系的建立》一文中研究指出目的基于PPAR-α受体的信号传递通路和利用双萤光素酶报告基因分析方法,建立稳定的PPAR-α激动剂体外筛选体系。方法 pcDNA3.1-PPAR-α、pGL3-PPRE-luc及pRL-CMV共转染293T细胞后,设0,0.1,1,10,50μmol·L-1非诺贝特不同浓度点进行干预后,测定每浓度点重复5个样本。对转染优化试验数据,比较均值大小选取最佳结果;对不同转染组之间的差异性比较,采用t检验和方差分析。结果浓度为0.1,1,10,50μmol·L-1非诺贝特干预组相对诱导率分别为:0.82,1.29,1.72,1.94,表现有统计学差异(P<0.05)。结论成功建立基于PPAR-信号通路及双萤光素酶报告基因分析方法的PPAR-α激动剂筛药系统。(本文来源于《中国现代应用药学》期刊2010年08期）
报告基因体系论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
大豆作为重要的油料作物和经济作物，是食用油和蛋白质的主要作物来源，在食品工业和农业生产中占重要地位。随着基因工程技术的不断发展，利用转基因技术培育大豆新品种、新种质得到了广泛的应用。在我国，对转基因作物的研究还处于起步阶段，因此，加强我国转基因大豆的自主研发，提高大豆遗传转化效率是我国大豆遗传改良的重中之重。为了改良大豆植株再生体系，提高农杆菌介导大豆子叶节体系遗传转化效率，建立稳定高效的转化体系，本实验对不同基因型和萌发时间条件下的丛生芽诱导率、伸长率以及瞬时阳性率进行统计，筛选出最适基因型和萌发时间。本研究选用了Jack、Williams82、中黄13、自贡冬豆和吉林小粒1号5个品系，对其在不同萌发时间诱导下的再生能力进行分析。分析结果表明，Jack品系作为大豆子叶节体系外植体时，其再生效率较高，生长稳定，最适合用于转化实验。而后，分别以萌发3-8天的Jack品系大豆子叶作为外植体，进行植株再生实验和根癌农杆菌侵染实验，统计其再生过程中，丛生芽诱导率、伸长率及瞬时阳性率。实验结果表明，萌发3天的大豆子叶最适合作为再生体系和转化体系的外植体，其丛生芽诱导率、伸长率以及瞬时阳性率均高于其他天数，呈现显着差异。现今，植物转化体系最常用的报告基因为GUS基因和GFP基因。但GUS基因不可用于活体检测，GFP基因虽然可以进行活体、连续的检测，但其绿色荧光很大程度上受到植物自身色素的影响。在本研究中，GFP基因仅在发状根中可以检测，在子叶中难以观测。而新型报告基因DsRed2既继承了GFP基因可活体、连续检测等优点，而且与GFP基因相比，DsRed2基因激发光和发射光波长较长，在激发光照射下呈现红色，减小检测受体中所含有的叶绿素等色素的干扰，信噪比较高，在细胞内荧光效率更高，更易检测。本研究将GFP基因与DsRed2基因分别连接在植物表达载体pTF101.1上，并用分别含有上述两种载体以及pTF102载体的根癌农杆菌EHA101侵染萌发3天的Jack品系大豆，观测共培养后、诱导前子叶节部位瞬时阳性表达。实验结果表明，在大豆子叶节部位很难检测到GFP基因的表达，但转DsRed2基因的大豆子叶节部位可观测到清晰的阳性芽点，但其阳性表达率略低于GUS基因。而后分别用含有pgfpGUS载体和pDsRed2GUS载体的发根农杆菌K599侵染Jack品系大豆，观测发状根的阳性率。实验结果表明，GFP与DsRed2均可检测到阳性发状根，DsRed2基因表达效率略低于GUS基因，但与GFP基因相仿。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
报告基因体系论文参考文献
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