导读:本文包含了视网膜神经前体细胞论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:人胚胎干细胞,氧,叁维培养,视网膜色素变性
视网膜神经前体细胞论文文献综述
高笠雄[1]（2017）在《氧浓度对hESCs叁维培养形成神经视网膜及前体细胞的影响及机制研究》一文中研究指出背景:视网膜色素变性(retinitis pigmentosa,RP)是一类以感光细胞凋亡为特征的遗传性致盲性眼病,目前尚无治愈方法,通过移植干细胞来源的感光细胞或视网膜色素上皮细胞成为RP治疗最有希望的新方法之一。视网膜是免疫豁免器官,加之玻璃体视网膜手术进行细胞移植是成熟技术,细胞移植后的视网膜功能和植入细胞的情况可以通过无创方法进行检测,使得眼睛成为细胞移植研究的理想器官。受制于伦理等因素,目前涉及从直接从人体组织获得干细胞进行临床研究的进展较缓慢。人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)具有向内中外叁胚层分化的潜能,是一类理想的种子细胞。体外叁维诱导hESCs形成类器官的方法较好地解决了种子细胞来源问题,同时,由于叁维诱导hESCs形成类器官的过程很好地重演了胚胎发育发育过程中器官发生的过程,已经使其成为发育学研究的良好模型。目前,利用叁维培养离体诱导hESCs已经可以形成包括视杯在内的多种器官组织,但叁维培养形成神经视网膜(neural retina,NR)仍存在有以下几点问题亟待解决:1、hESCs叁维诱导形成的NR与在体发育过程中形成的NR仍存在结构和功能的差异;2、影响叁维培养hESCs所形成的NR的因素不明,诱导效率偏低。此外,由于诱导形成的NR尚处发育阶段,其内细胞组分混杂,缺乏特异膜标记物直接定位和分选视网膜前体细胞(retinal progenitor cells,RPCs)。基于此,选择合适的手段改善叁维培养方法并选择恰当的膜标记物分离细胞是当下研究的关键点。氧对生命的维系至关重要,一方面,生命体通过氧化磷酸化的有氧呼吸方式大量产生ATP保障了生命活动的高效运转;另一方面,机体发育伴随了外环境氧浓度的变化,而干细胞的命运与氧浓度的高低密切相关。通常认为:低氧是决定干细胞调节自我更新以及维持干性的重要因素;高氧则会促进干细胞的分化。叁维诱导hESCs形成NR的过程通常都在常氧条件下进行,但胚胎发育过程中,中枢神经系统发育先于心血管系统,因此在血液循环建立前后,视网膜的发育会经历一个氧浓度由低升高的过程。目前,大多数叁维培养没有涉及氧浓度的转变过程。此外,理想的可移植细胞应具备以下条件:1、处于前体细胞阶段,便于移植前离体扩增以及移植后分化为目的细胞;2、无胚胎源性,不会在移植入器官后无限增殖形成畸胎瘤。研究发现,器官来源的络氨酸蛋白激酶受体(tyrosine-protein kinase Kit,C-Kit)阳性细胞是一类具有自我更新和分化潜能的干细胞,将其移植入对应的器官可发挥组织修复功能。而阶段特异的胚胎抗原4 (stage-specific embryonic antigen 4, SSEA4)为人器官组织在胚胎阶段表达的表面标记物,SSEA4将有利于鉴别胚胎源性的细胞。目的:hESCs叁维培养以探究其形成的NR的细胞和组织构筑特点;研究氧浓度升高对叁维诱导hESCs形成NR效率的影响,从而通过调控氧浓度改良叁维诱导方法;研究从叁维诱导hESCs形成NR中分离的C-Kit+/SSEA4-细胞的生物学特点以及低氧对其干性维持的影响,进而获取状态良好和足够数量的RPCs;利用全基因谱扫描分析从叁维诱导hESCs形成NR分离的C-Kit+/SSEA4-细胞的基因表达谱,全面深入了解该细胞的特点。方法与结果:本研究分为叁个部分:第一部分:hESCs的叁维培养及神经视网膜的自发形成1、利用细胞免疫荧光、流式细胞分析研究hESCs细胞系H1的细胞特性。发现H1-hESCs成克隆聚集样生长,核分裂相明显。高达95%以上的细胞表达胚胎干细胞标志物 OCT4, SOX2 和 SSEA4。2、通过免疫荧光染色鉴定叁维诱导hESCs形成的视泡、视杯样结构。可见拟胚体(embryonic bodies, EBs)在8天左右即可形成视泡样结构,继续培养24天后,视泡的形态更加清晰,并可观察到双层凹陷的视杯样结构,叁维诱导38D的hESCs来源NR可表达增殖标记物Ki67; RPCs标记物:RAX、PAX6、CHX10;神经前体细胞标记物:SOX2、NESTIN;神经节细胞(retinal ganglion cells, RGCs)标记物 Tuj1及感光前体细胞标记物Crx,其中RAX在全神经视网膜均有表达。第二部分:氧浓度对叁维诱导hESCs形成神经视网膜发育的影响1、利用免疫荧光染色分析高氧对叁维诱导hESCs自发形成NR的影响,发现40%O2的高氧可以明显促进神经视网膜内细胞的增殖,且40%O2组中NR内增殖细胞在尖-底(apical-basal)端两侧间迁移增加,高氧可促进细胞核动态迁移(Interkinetic nuclear migration)的发生。2、利用免疫荧光染色研究高氧对叁维诱导hESCs自发形成NR中神经玫瑰花节(neural rossetes)尖-底端极性的影响,发现在20%O2组中,神经玫瑰花结内侧尖端面会翻转至外侧,而40%O2组中神经玫瑰花节可按照正常生理的尖-底端极性发育。3、利用免疫荧光染色研究高氧对叁维诱导hESCs自发形成NR中RPCs的影响,发现氧浓度变化并不会改变神经视网膜标记物的表达模式,但40%O2下PAX6阳性视网膜祖细胞数量较20%O2显着增加,RPCs向神经内层迁移更为明显,且40%O2显着促进RGCs的形成。相比20%O2的常氧处理,高氧下叁维诱导hESCs形成的RGCs的突起更长,向基底侧迁移增加。第叁部分:氧浓度对hESCs叁维诱导NR来源C-Kit+/SSEA4- (hESC-NR-C-Kit+/SSEA4-)细胞的增殖的影响及其生物学特性分析1、利用改进的叁维诱导方法诱导hESCs形成NR,研究氧浓度的影响对NR标记物表达的影响,发现改进的叁维诱导方法所得EBs形成相对较慢,其形成的NR细胞与组织构筑特点没有显着变化,高氧对EBs生长仍有促进作用。2、利用免疫荧光染色研究改进的叁维诱导hESCs形成NR中C-Kit的表达的时空分布特点,发现C-Kit阳性细胞主要分布于神经视网膜的内层,C-Kit阳性细胞同时表达干细胞标记Nestin、PAX6、RAX,但不表达CHX10。随着诱导时间的进展,NR内C-Kit的表达水平不断下降。3、利用细胞生存实验分析hESC-NR-C-Kit+/SSEA4-细胞增殖特性,发现hESC-NR-C-Kit+/SSEA4-细胞在3%O2的低氧下细胞增殖明显增加,在诱导30D、45D及60D分选细胞,以30D分选的细胞增殖活性最好。4、利用细胞免疫荧光染色,研究hESC-NR-C-Kit+/SSEA4的-细胞的特性,发现hESC-NR-C-Kit+/SSEA4-细胞可以表达包括 Nestin、PAX6、RAX 等多种 RPCs 的标记物和增殖标记物Ki67,且可以诱导分化形成RGCs、双极细胞、感光细胞及Muller细胞。5、利用全基因组转录谱表达分析,研究hESC-NR-C-Kit+/SSEA4-细胞的基因表达谱特点,发现30D、45D及60D分选的hESC-NR-C-Kit+/SSEA4-视网膜前体细胞与人胚眼分离的RPCs之间的Pearson相关系数均在0.88以上,且以30D最高(0.908),hESC-NR-C-Kit+/SSEA4-细胞较RPCs增殖和迁移相关基因表达增加,p53信号通路激活增加,但细胞粘附分子通路激活降低。结论:1、叁维诱导hESCs形成的NR可以表达各类视网膜干细胞标记物,其发育类似在体视网膜发育过程。选用改进的(BMP4介导)叁维诱导方法,其诱导过程操作简单,NR形成更稳定,表明改进的叁维诱导方法更利于后期临床运用。2、氧浓度升高对于叁维诱导hESCs形成NR的主要影响有包括促进NR的增殖、促进神经玫瑰花结按照正常生理的尖-底端极性发育、促进PAX6阳性RPCs的形成和迁移以及促进RGCs的形成、成熟和迁移。表明高氧处理有利于获得更多、更接近在体发育的NR。3、低氧培养下,诱导30D分选的hESC-NR-C-Kit+/SSEA4-细胞的状态和增殖活性较常氧培养有明显改善,表明低氧培养有利于细胞的稳定扩增。4、叁维诱导hESCs形成的NR中C-Kit阳性细胞可以同时表达Nestin、PAX6、RAX等视网膜干细胞标记,但不表达胚胎抗原,可分化为感光细胞,双极细胞,Muller 细胞及 RGCs,表明 hESC-NR-C-Kit+/SSEA4-细胞为一类 RPCs。5、基因组表达谱扫描结果显示hESC-NR-C-Kit+/SSEA4-细胞与从人胚眼中分离的RPCs非常类似(>90%),但其增殖和迁移相关基因表达高于RPCs,提示hESC-NR-C-Kit+/SSEA4-细胞是接近于在体发育的一类RPCs。为干细胞移植治疗视网膜变性疾病提供了成瘤风险低、分化潜能好、有标准化产业化条件新的种子细胞。(本文来源于《第叁军医大学》期刊2017-05-01）
巢凌彦[2]（2009）在《全反式视黄酸诱导新生大鼠视网膜神经前体细胞向光感受器细胞分化的研究》一文中研究指出目的探讨全反式视黄酸(all-trans retinoic acid,ATRA)诱导新生大鼠视网膜神经前体细胞(neural retinal progenitor cell,NRPC)向光感受器细胞分化的作用。方法从新生Sprague-Dawley大鼠(出生后第一天,day 1 postnatal,P1)视网膜分离并扩增视网膜神经前体细胞(retinal progenitor cells,RPC),在含968μl/mlN2、10μl/mlB27、20ng/ml表皮生长因子(epidermalgrowth factor,EGF)、20ng/ml碱性成纤维生长因子(basic fibroblastgrowth factor,bFGF)、2μg/ml肝素及1%青链霉素的无血清DMEM/F12完全培养基中培养和传代。取第3代视网膜神经前体细胞作为研究对象,随机分为叁组:①RPC对照组:继续原完全培养基培养;②胎牛血清诱导组:在原完全培养基中去除EGF、bFGF和肝素并加入10%胎牛血清;③全反式视黄酸(ATRA)诱导组:在原完全培养基中去除EGF、bFGF和肝素并加入1%胎牛血清及0.5μmol/L全反式视黄酸诱导分化。孵育七天后观察细胞形态变化,采用免疫细胞化学法检测神经干/前体细胞的标记物巢蛋白Nestin、神经胶质细胞的标记物胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)、神经元标记物β-微管蛋白(β-Tubulin)、光感受器细胞不同发育阶段的标记物视锥-视杆细胞同源异型基因(cone-rod homeobox gene,CRX)、恢复蛋白Recoverin及视紫红质Rhodopsin的表达,分别比较叁组间各种标记物表达的阳性率。采用逆转录聚合酶链式反应(reverse-transcriptionpolymerase chain reaction,RT-PCR)检测叁组细胞中成对同源异形盒转录因子6(paired box 6,Pax6)mRNA的表达含量,分析全反式视黄酸对视网膜神经前体细胞向光感受器细胞分化的诱导效应。结果1.视网膜神经前体细胞诱导分化后的免疫荧光鉴定结果:①对照组:在未经诱导的对照组,细胞多呈集落生长,少部分单个贴壁,形态以椭圆形或叁角形为主,有两到叁个短的突起,胞核较大,呈圆形,胞质较少,79.5%细胞为Nestin阳性表达细胞,即神经前体细胞;GFAP、β-Tubulin、CRX、Recoverin及Rhodopsin阳性表达细胞百分比分别为15.8%、13.4%、10.9%、10.1%和8.9%。②胎牛血清诱导组:视网膜神经前体细胞经10%FBS诱导7天后,光镜下见细胞呈单个贴壁生长,部分细胞胞体扁平,形态不规则,似胶质细胞。部分细胞伸出一个或多个突起,突起与突起相接触。Nestin阳性表达细胞数目明显减少,而GFAP阳性表达细胞数目显着增加,β-Tubulin、CRX、Recoverin及Rhodopsin阳性表达的细胞数量明显增加,有显着差异(P＜0.05)。其中Nestin、GFAP、β-Tubulin、CRX、Recoverin及Rhodopsin阳性表达细胞百分比分别为16.0%、70.9%、21.2%、18.8%、18.7%和17.9%。③ATRA诱导组:视网膜神经前体细胞经0.5μM全反式视黄酸诱导7天后,细胞呈单个贴壁生长,部分细胞伸出一个或两个较长突起,突起间互相接触。β-Tubulin、CRX、Recoverin及Rhodopsin阳性表达的细胞数量明显增加,有显着性差异(P＜0.05)。Nestin、GFAP、β-Tubulin、CRX、Recoverin及Rhodopsin阳性表达细胞百分比分别为14.1%、23.2%、64.7%、61.2%、59.2%和55.%。对照组大部分细胞仍然表达nestin,而胎牛血清组和ATRA组nestin阳性表达细胞数量显着减少(P＜0.05);胎牛血清组GFAP阳性表达细胞数量显着增多(P＜0.05),是对照组的4.49倍;ATRA组早期神经元β-Tubulin阳性细胞明显增多(P＜0.05),是对照组的4.83倍。ATRA组的光感受器标记CRX、Recoverin及Rhodopsin阳性表达细胞分别为对照组的5.61、5.86和6.22倍。2.PAX6 mRNA的表达:视网膜神经前体细胞诱导分化后,凝胶电泳图分析检测发现:ATRA诱导组PAX6表达量最少,胎牛血清组其次,对照组Pax6表达量最多。结论0.5μM全反式视黄酸在体外能有效诱导新生SD大鼠视网膜神经前体细胞向神经元细胞包括光感受器细胞方向分化。(本文来源于《中南大学》期刊2009-05-01）
柳夏林,李拥军,刘奕志,葛坚[3]（2006）在《低氧培养的人视网膜神经胶质细胞对血管内皮前体细胞的作用》一文中研究指出目的探讨低氧环境下视网膜神经胶质细胞介导的低氧反应分子通路对血管内皮前体细胞(EPCs)的作用及其机制。方法人外周血循环EPCs(CD34+、CD33+双标阳性细胞)经荧光免疫激活流式细胞仪分选收集后培养;分别使用低氧(5%O2,实验组)和正常氧(20%O2,对照组)的人视网膜神经胶质细胞生长培养液作为条件培养液,多次处理EPCs,检测和分析EPCs的增殖活性(WST-1比色法)和分化能力(免疫荧光染色法);采用酶联免疫吸附试验检测实验组和对照组视网膜神经胶质细胞血管内皮生长因子(VEGF)的释放量,采用免疫印迹法检测细胞核内低氧反应因子(HIF)-1α的表达。结果实验组EPCs的增殖活性(吸光度值为1·53±0·10)和分化能力[细胞数目为(29±5)个]均较对照组增殖活性(吸光度值为0·88±0·25)和分化能力[细胞数目为(18±8)个]明显增强(P<0·05)。实验组培养6、24h后神经胶质细胞核内均可检测到HIF-1α表达,而对照组表达缺失。实验组视网膜神经胶质细胞VEGF的释放量较对照组明显增加,且具有时相性,培养24h实验组VEGF的释放量[(319·16±34·12)pg/ml]较对照组[(220·28±24·33)pg/ml]增加44·88%(P<0·01)。结论视网膜神经胶质细胞在低氧培养状态下可通过细胞因子的分泌作用直接促进培养的EPCs增殖和分化,这可能在EPCs参与的新生血管形成中发挥重要的介导作用,该作用与神经胶质细胞HIF-1α和VEGF的信号通道激活有关。本研究对神经胶质细胞介入血管前体细胞的病理生理作用进行了初步探讨。(本文来源于《中华眼科杂志》期刊2006年12期）
姚静,孙兴怀[4]（2006）在《Muller细胞诱导视网膜前体细胞向视网膜神经节细胞分化》一文中研究指出目的研究Muller细胞在视网膜前体细胞向视网膜神经节细胞分化中的作用。方法分离培养Muller细胞和不同时期的胚胎视网膜前体细胞,将其与Muller细胞共同培养,并进一步用Muller细胞条件培养液来诱导视网膜前体细胞的分化。倒置相差显微镜每天观察细胞的生长和分化情况,Thy1.1标记视网膜神经节细胞并计数。结果视网膜前体细胞能分化为多种视网膜细胞类型,包括视网膜神经节细胞。不同时期、不同培养条件下的视网膜前体细胞向视网膜神经节细胞分化的百分比不同。单独培养组、共同培养组和Muller细胞条件培养液组视网膜神经节细胞的百分比,E14分别为(16.91±4.05)%,(47.25±9.67)%和(42.36±10.52)%,E18则分别为(4.65±1.88)%,(9.90±3.19)%和(8.69±3.01)%。相同时期的视网膜前体细胞,共同培养组和Muller细胞条件培养液组视网膜神经节细胞的百分比较单独培养组高,差异有统计学意义。相同培养条件下,E14视网膜前体细胞向视网膜神经节细胞分化的百分比较E18高,差异有统计学意义。结论Muller细胞能诱导视网膜前体细胞向视网膜神经节细胞分化,可能通过Muller细胞释放某些可溶性因子发挥作用。(本文来源于《复旦学报(医学版)》期刊2006年05期）
姚静,孙兴怀,汪洋,徐格致,钱江[5]（2006）在《过量表达Math5诱导视网膜前体细胞向视网膜神经节细胞分化》一文中研究指出目的:研究Math5对视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)分化的调控。方法:分离培养E14 SD大鼠视网膜前体细胞(retinal progenitor cells,RPCs),构建 pIRES2—EGFP—Math5,以pIRES2—EGFP作为对照,转染RPCs,倒置相差显微镜每天观察RPCs的生长和分化情况,重点观察其向RGCs的分化,Thy1．1标记RGCs并进(本文来源于《第叁届全球华人眼科学术大会暨中华医学会第十一届全国眼科学术大会论文汇编》期刊2006-08-01）
赖平红,唐仕波,林少芬,朱晓波,高艺[6]（2006）在《全神经球贴壁培养法体外长期扩增视网膜前体细胞》一文中研究指出目的:探寻一种既高效又能连续体外扩增视网膜前体细胞(RetinalProgenitorCell,RPC)的培养方法。方法:小鼠胚胎视网膜细胞采取神经球贴壁培养或直接贴壁培养法。神经球贴壁培养时,先经悬浮培养生成富含前体细胞的神经球,然后将低速离心分离出的神经球接种到Poly-D-Lysine包被的培养瓶,在前体细胞培养液中(含FGF-2、EGF和LIF)贴壁培养,头24h在培养液中添加10%的胎牛血清。直接贴壁培养法是将细胞悬液直接接种到预先包被Poly-D-Lysine的培养瓶。免疫组化和FACS分析神经球贴壁培养细胞的干细胞特性和分化能力,并与直接贴壁培养法得到的细胞进行比较。结果:神经球接种到预先包被Poly-D-Lysine的培养瓶后贴附到培养瓶底,逐渐形成贴壁生长的单层细胞。该法能够在体外长期扩增视网膜前体细胞,3个月内细胞能够传代10次以上。在RA诱导分化时,能够生成成熟视网膜细胞,表达视网膜细胞特异性标记。FACS分析和免疫组化染色显示神经球贴壁培养所得细胞在未分化时Nestin阳性率(92%)细胞率以及分化为成熟视网膜细胞的比率(53.7%),均高于直接贴壁培养法获得的细胞。结论:神经球贴壁培养法能够在体外长期大量扩增视网膜前体细胞,能较好地保持干细胞特性,并容易分化为成熟的视网膜细胞,较直接贴壁培养具有较大的优越性。(本文来源于《眼科学报》期刊2006年02期）
姚静[7]（2006）在《视网膜前体细胞向视网膜神经节细胞分化的实验研究》一文中研究指出第一部分视网膜前体细胞的培养和鉴定目的：分离和培养不同时期的RPCs并鉴定。方法：分离E14和E18 SD大鼠的RPCs，用改进DMEM/F12无血清培养基悬浮培养并在体外诱导分化，倒置相差显微镜每天观察细胞的生长和分化情况，免疫细胞化学、扫描电镜和透射电镜对RPCs进行鉴定。结果：RPCs在DMEM/F12无血清培养基中悬浮成球，贴壁后，细胞逐渐从细胞球向周围迁移分化。扫描电镜可见细胞球和分化细胞的形态，透射电镜可见细胞球内存在RPCs样细胞，贴壁后形成神经元样和神经胶质样细胞。免疫细胞化学显示悬浮培养的细胞球中大部分细胞表达神经外胚层源性干细胞标志Nestin和细胞分裂增殖标志BrdU，贴壁后，RPCs能分化为多种视网膜细胞类型，包括Thy1.1阳性的RGCs。E14和E18 RGCs％分别为16.91％±4.05％和4.65％±1.88％，两组比较，差异有统计学意义(t=15.04，P＜0.001)。结论：改进DMEM/F12无血清培养基可成功培养RPCs，培养的RPCs具有无限增殖和多向分化潜能。早期RPCs向RGCs分化的百分比较高第二部分眼内微环境对视网膜前体细胞向视网膜神经节细胞分化的影响目的：研究视神经钳夹伤模型对RPCs向RGCs分化的影响。方法：成年雄性SD大鼠，随机选取左右眼进入试验，试验组为视神经钳夹伤模型，对照组暴露视神经，但不钳夹。分离培养E14 SD大鼠的RPCs，用BrdU标记后分别移植到试验组和对照组的玻璃体腔，于移植后1w，2w，4w取眼球，免疫细胞化学检测移植细胞的迁移、整合和分化情况。结果：对照组移植的RPCs主要位于宿主玻璃体腔，随着时间的推移，未见明显的迁移和分化。试验组移植的RPCs逐渐向宿主视网膜各层迁移，其中位于内层视网膜的细胞数量明显多于外层视网膜，以GCL为最多，随着时间的推移，外层视网膜的细胞数量逐渐增多，但仍明显少于内层视网膜。免疫细胞化学显示试验组位于宿主视网膜不同层的移植细胞表达不同的视网膜细胞特异性标志，Thy1.1阳性的细胞主要位于GCL，其次是INL。结论：视神经钳夹伤模型能诱导RPCs迁移到GCL并向RGCs分化。第叁部分Muller细胞对视网膜前体细胞向视网膜神经节细胞分化的作用目的：研究Muller细胞和MCM在RPCs向RGCs分化中的作用。方法：分离培养P7 SD大鼠的Muller细胞，E14和E18 SD大鼠的RPCs，分别将不同时期的RPCs单独培养(Muller(-)组)，与Muller细胞共同培养(Muller(+)组)，用MCM诱导分化(MCM组)。倒置相差显微镜每天观察细胞的生长和分化情况，Thy1.1标记RGCs并计数。结果：不同时期，不同培养条件下的RPCs都能分化为多种视网膜细胞类型，包括Thy1.1阳性的RGCs，但RPCs向RGCs分化的百分比不同。E14，Muller(-)组，Muller(+)组和MCM组RGCs％分别为16.91％±4.05％，47.25％±9.67％和42.36％±10.52％，E18则分别为4.65％±1.88％，9.90％±3.19％和8.69％±3.01％。Muller(+)组、MCM组与Muller(-)组比较，差异有统计学意义(P＜0.001)。Muller(+)组与MCM组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。E14，Muller(-)组和MCM组RPCs增生细胞％分别为32.13％±6.11％和57.07％±9.31％，E18则分别为31.51％±6.32％和56.18％±8.79％，MCM组与Muller(-)组比较，差异有统计学意义(t_(E14)=12.28，P＜0.001；t_(E18)=12.49，P＜0.001)。结论：Muller细胞能促进RPCs的增殖和RPCs向RGCs的分化，可能通过Muller细胞释放某些可溶性因子发挥作用。第四部分Notch-1调控视网膜前体细胞向视网膜神经节细胞分化目的：研究Notch-1对RPCs向RGCs分化的调控作用。方法：分离培养E14 SD大鼠的RPCs，试验组和对照组分别用含有Notch-1反义寡核苷酸链和无关序列寡核苷酸链的分化培养液进行诱导分化，倒置相差显微镜每天观察细胞的生长和分化情况，Thy1.1标记RGCs并进行计数。结果：试验组和对照组的RPCs都能分化为多种视网膜细胞类型，包括Thy1.1阳性的RGCs，但两组RPCs向RGCs分化的百分比不同。试验组和对照组RGCs％分别为16.57％±4.31％和31.19％±6.90％，两组比较，差异有统计学意义(t=9.84，P＜0.001)。结论：Notch-1对RGCs的分化具有负向调控作用，阻断Notch-1能促进RPCs向RGCs分化。第五部分Math5调控视网膜前体细胞向视网膜神经节细胞分化目的：研究Math5对RPCs向RGCs分化的调控作用。方法：分离培养E14 SD大鼠的RPCs，构建Math5-EGFP质粒，以EGFP质粒作为对照，转染RPCs，倒置相差显微镜每天观察转染后RPCs的生长和分化情况，重点观察其向RGCs的分化，Thy1.1标记RGCs并进行计数，同时用荧光定量RT-PCR的方法检测RPCs分化不同时间点Math5相关基因的表达情况。结果：Math5-EGFP／EGFP质粒能成功转染RPCs，转染效率为24.68％。转染后的RPCs仍能分化为多种视网膜细胞类型，包括Thy1.1阳性的RGCs。A组(Math5质粒转染组)，B组(空质粒转染组)和C组(未转染质粒组)RGCs％分别为30.85％±6.28％，15.84％±3.55％和16.22％±3.60％，A组与B组、C组比较，差异有统计学意义(P＜0.001)。Math5相关基因Delta-1、Hes1和Brn-3b在RPCs分化的不同时间点表达不同，Math5-EGFP质粒转染RPCs不仅改变Delta-1、Hes1和Brn-3b基因的表达量，而且改变其表达曲线。结论：Math5对RGCs的分化具有正向调控作用，过量表达Math5能促进RPCs向RGCs分化，并伴随相关基因的变化。(本文来源于《复旦大学》期刊2006-04-01）
视网膜神经前体细胞论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
目的探讨全反式视黄酸(all-trans retinoic acid,ATRA)诱导新生大鼠视网膜神经前体细胞(neural retinal progenitor cell,NRPC)向光感受器细胞分化的作用。方法从新生Sprague-Dawley大鼠(出生后第一天,day 1 postnatal,P1)视网膜分离并扩增视网膜神经前体细胞(retinal progenitor cells,RPC),在含968μl/mlN2、10μl/mlB27、20ng/ml表皮生长因子(epidermalgrowth factor,EGF)、20ng/ml碱性成纤维生长因子(basic fibroblastgrowth factor,bFGF)、2μg/ml肝素及1%青链霉素的无血清DMEM/F12完全培养基中培养和传代。取第3代视网膜神经前体细胞作为研究对象,随机分为叁组:①RPC对照组:继续原完全培养基培养;②胎牛血清诱导组:在原完全培养基中去除EGF、bFGF和肝素并加入10%胎牛血清;③全反式视黄酸(ATRA)诱导组:在原完全培养基中去除EGF、bFGF和肝素并加入1%胎牛血清及0.5μmol/L全反式视黄酸诱导分化。孵育七天后观察细胞形态变化,采用免疫细胞化学法检测神经干/前体细胞的标记物巢蛋白Nestin、神经胶质细胞的标记物胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)、神经元标记物β-微管蛋白(β-Tubulin)、光感受器细胞不同发育阶段的标记物视锥-视杆细胞同源异型基因(cone-rod homeobox gene,CRX)、恢复蛋白Recoverin及视紫红质Rhodopsin的表达,分别比较叁组间各种标记物表达的阳性率。采用逆转录聚合酶链式反应(reverse-transcriptionpolymerase chain reaction,RT-PCR)检测叁组细胞中成对同源异形盒转录因子6(paired box 6,Pax6)mRNA的表达含量,分析全反式视黄酸对视网膜神经前体细胞向光感受器细胞分化的诱导效应。结果1.视网膜神经前体细胞诱导分化后的免疫荧光鉴定结果:①对照组:在未经诱导的对照组,细胞多呈集落生长,少部分单个贴壁,形态以椭圆形或叁角形为主,有两到叁个短的突起,胞核较大,呈圆形,胞质较少,79.5%细胞为Nestin阳性表达细胞,即神经前体细胞;GFAP、β-Tubulin、CRX、Recoverin及Rhodopsin阳性表达细胞百分比分别为15.8%、13.4%、10.9%、10.1%和8.9%。②胎牛血清诱导组:视网膜神经前体细胞经10%FBS诱导7天后,光镜下见细胞呈单个贴壁生长,部分细胞胞体扁平,形态不规则,似胶质细胞。部分细胞伸出一个或多个突起,突起与突起相接触。Nestin阳性表达细胞数目明显减少,而GFAP阳性表达细胞数目显着增加,β-Tubulin、CRX、Recoverin及Rhodopsin阳性表达的细胞数量明显增加,有显着差异(P＜0.05)。其中Nestin、GFAP、β-Tubulin、CRX、Recoverin及Rhodopsin阳性表达细胞百分比分别为16.0%、70.9%、21.2%、18.8%、18.7%和17.9%。③ATRA诱导组:视网膜神经前体细胞经0.5μM全反式视黄酸诱导7天后,细胞呈单个贴壁生长,部分细胞伸出一个或两个较长突起,突起间互相接触。β-Tubulin、CRX、Recoverin及Rhodopsin阳性表达的细胞数量明显增加,有显着性差异(P＜0.05)。Nestin、GFAP、β-Tubulin、CRX、Recoverin及Rhodopsin阳性表达细胞百分比分别为14.1%、23.2%、64.7%、61.2%、59.2%和55.%。对照组大部分细胞仍然表达nestin,而胎牛血清组和ATRA组nestin阳性表达细胞数量显着减少(P＜0.05);胎牛血清组GFAP阳性表达细胞数量显着增多(P＜0.05),是对照组的4.49倍;ATRA组早期神经元β-Tubulin阳性细胞明显增多(P＜0.05),是对照组的4.83倍。ATRA组的光感受器标记CRX、Recoverin及Rhodopsin阳性表达细胞分别为对照组的5.61、5.86和6.22倍。2.PAX6 mRNA的表达:视网膜神经前体细胞诱导分化后,凝胶电泳图分析检测发现:ATRA诱导组PAX6表达量最少,胎牛血清组其次,对照组Pax6表达量最多。结论0.5μM全反式视黄酸在体外能有效诱导新生SD大鼠视网膜神经前体细胞向神经元细胞包括光感受器细胞方向分化。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
视网膜神经前体细胞论文参考文献
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