一、细胞色素P450酶在化学物质诱导肝脏癌变作用及研究现状（论文文献综述）
陆雨晨[1]（2021）在《含氮消毒副产物的P450酶代谢与细胞毒性研究》文中研究指明在饮用水的消毒过程中,消毒剂可能和水中的溶解性有机物反应,产生消毒副产物（Disinfection byproducts,DBPs）,对人体产生不良影响。含氮消毒副产物（Nitrogenous disinfection byproducts,N-DBPs）是一类新型的DBPs,常见的种类有卤代乙酰胺（Haloacetamides,HAc Ams）、卤代乙腈（Haloacetonitriles,HANs）和卤代硝基甲烷（Halonitromethanes,HNMs）。许多体外细胞实验表明,N-DBPs的细胞毒性比受控的三卤甲烷（THMs）、卤乙酸（HAAs）更大,得到了全球范围的广泛关注。目前有实验发现HNMs可被生物体内的细胞色素P450酶氧化代谢或还原代谢,但代谢机理以及氧化代谢与还原代谢的相互竞争尚不明确。因此本研究使用量子化学计算方法,从分子水平模拟了细胞色素P450酶代谢HNMs的过程,提出了可能的代谢机理和产物。由于外源性化学物质与生物分子的相互作用是引发毒性的可能的分子起始反应,本研究通过化学实验测定了三类N-DBPs与生物细胞内典型的抗氧化物质谷胱甘肽（GSH）的反应速率常数,分析了化学反应性与细胞毒性的相关关系。在此基础上,进一步使用量子化学参数构建了预测N-DBPs的细胞毒性的定量结构-效应关系（QSAR）模型。具体研究内容和结果如下:1.使用量子化学密度泛函理论（DFT）计算,模拟HNMs被细胞色素P450酶代谢的过程,提出了氧化代谢和还原代谢两种机理。HNMs的氧化代谢包括两种反应路径,一种是卤素原子被P450酶的活性位点Cpd I上的氧原子提取,氧原子—卤素原子基团发生回弹,最终形成卤素氧基的产物;另一种是HNMs中的氢原子被氧化,发生羟基化反应,生成羟基化产物。还原机理涉及单个电子的转移,HNMs得到一个电子被还原脱去卤素离子或亚硝酸根离子,并使用Marcus外氛电子转移理论和Savéant电子转移动力学模型计算得到P450酶还原HNMs的反应能垒;其中HNMs中的硝基被P450酶还原成亚硝酸根离子的反应途径为首次提出,为研究HNMs在生物体内的代谢提供了新的思路。2.基于计算得到的各个反应路径的决速步骤的能垒,分析了氧化和还原反应的优势路径。氧化代谢中,对于未被卤素完全取代的HNMs,羟基化反应的活化能垒显着低于卤素氧化反应,是主要代谢路径;对于卤素完全取代的HNMs,溴原子氧化比氯原子氧化的活化能垒低,更易于发生,并且卤素氧化反应的活化能垒随卤素原子数目的增加而降低。还原代谢中,对于被卤素完全取代的HNMs,还原脱卤素和脱硝基两种代谢路径可同时发生,具有竞争性;二卤取代的HNMs的优势代谢路径是脱卤素反应;单卤取代的HNMs两种还原反应的能垒均较高,反应速度慢。最后对氧化反应和还原反应的总体能垒进行了比较,发现对于卤素完全取代的HNMs,氧化反应是优势代谢路径;卤素未完全取代的HNMs,还原反应是优势路径。3.开展化学实验,测定了29个N-DBPs（9个HNMs、7个HANs和13个HAc Ams）与GSH的反应速率常数k GSH。HNMs的k GSH值在4 M-1 min-1和1604 M-1 min-1之间,HAc Ams的k GSH值在0.6 M-1 min-1和200 M-1 min-1之间,HANs的k GSH值在2 M-1 min-1和62 M-1 min-1之间。HNMs的k GSH值的中位数为52 M-1 min-1,明显高于HAc Ams（28 M-1 min-1）和HANs（8 M-1 min-1）,说明在这三类物质中,HNMs和GSH的反应速度最快。进一步发现log k GSH与N-DBPs对人胚胎肾上皮细胞（HEK 293T）的细胞毒性log IC50值显着相关,R2=0.758（HANs与HAc Ams）和0.738（HNMs）。说明N-DBPs与GSH的亲电亲核反应可能是触发细胞毒性的分子起始事件,可以通过该方法初步预测同类消毒副产物的细胞毒性大小。相比于HNMs,HANs和HAc Ams造成的细胞毒性log IC50对log k GSH的变化更敏感。这种不一致性可能是由于N-DBPs不同的反应位点参与了和GSH的反应:HANs和HAc Ams中连接卤素原子的碳原子被GSH中的巯基攻击,而HNMs中的卤素原子也可能是被攻击的位点。4.基于化学反应相关性仅能对毒性进行初步筛选,为进一步精确预测该类污染物的细胞毒性,使用量子化学描述符,分别构建了HNMs类N-DBPs以及HANs与HAc Ams类N-DBPs对HEK 293T细胞的log IC50值的QSAR模型。模型有良好的拟合性能,R2=0.815（HANs和HAc Ams）和0.827（HNMs）,RMSE=0.518（HANs和HAc Ams）和0.240（HNMs）。影响HANs和HAc Ams的细胞毒性的主要分子结构参数是分子中氯原子的取代个数、卤素–碳键断裂所需的能量和分子表面静电势的平衡常数。对于HNMs,最高占据分子轨道能和分子表面正静电势的平均值是与细胞毒性高度相关的描述符。模型验证和定义域的表征结果显示两个模型都有较好的预测能力和稳健性。因此,这两个模型可以预测应用域内的其他HANs、HAc Ams和HNMs化合物的log IC50值,为此类化合物的生态风险评价提供基础数据。
田艳花[2]（2021）在《君迁子叶对N-亚硝胺形成与诱导癌变的抑制作用及机理》文中进行了进一步梳理癌症已成为当今全球第二大致死病因。N-亚硝胺（N-nitrosamines,NAs）是世界公认的致癌物质,NAs不仅广泛存在于饮用水、土壤、烟草烟雾、食品、化妆品和部分工业用品中,且可在人体内形成。亚硝酸盐（NIT）和生物胺是形成NAs的前体物。NIT广泛存在于各种食品原料和生活环境中,同时也是肉制品常用的添加剂。生物胺是氨基酸的分解产物。由于NAs及其前体物NIT和生物胺的普遍存在性,人体无法避免与NAs接触。如何预防NAs对人体的危害成为备受关注的问题。抑制NAs形成或阻断NAs诱导癌变的通路是预防NAs危害的有效途径。因此,从天然产物中分离并制备抑制NAs形成或阻断NAs诱导癌变通路的有效成分,深入探究其作用机理,继而研究其在药品和食品生产中的应用具有重要意义。本论文以广泛分布在我国各地的柿树科柿属植物君迁子（黑枣）（Diospyros lotus L.）的叶为研究对象,制备和筛选了抑制NAs形成的主要活性组分;分析鉴定了活性组分中抑制NAs形成的活性成分;分离并制备了主要活性成分杨梅苷（Mytr）;研究了Mytr对NAs致L-02细胞损伤的抑制作用及机理;探究了Mytr抑制内源性NAs形成以及阻断NAs诱导癌变的机理;考查了Mytr作为添加剂对蒸煮肠中NAs形成的抑制作用及机理。论文主要内容如下:1.制备并筛选了君迁子叶中抑制NAs形成的主要活性组分。采用醇沉和D101大孔树脂柱对君迁子叶水提液进行分离和纯化,得到7个样品组分（A,Z,Fr1～Fr5）。比较了7个组分的多酚含量,对DPPH·和NIT的清除活性,对模拟胃液条件形成NAs的抑制作用,以及对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑制作用。结果表明君迁子叶水提液中的多酚主要被富集在Fr2（38.37 g/100g）和Fr3（49.79 g/100g）中。其中Fr3对DPPH·和NIT的清除作用,对N-二甲基亚硝胺（NDMA）和N-二乙基亚硝胺（NDEA）形成的抑制作用,以及对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑制作用明显强于其它组分（p<0.05）。表明君迁子叶中抑制NAs形成的主要活性组分为Fr3。2.分析鉴定和制备了Fr3中抑制NAs形成的主要活性成分。首先,通过对比Fr3抑制亚硝化反应前后的色谱图,推测出Fr3中抑制NAs形成的活性成分峰,并利用质谱等分析方法,确定出Fr3中抑制NAs形成的4种活性成分:杨梅酮（Myt）,Mytr,杨梅酮-3-O-β-D-半乳糖苷（Myt-Gal）和杨梅酮-3-O-β-D-葡萄糖苷（Myt-Glc）。其次,建立HPLC法同时测定4种活性成分含量的方法,并测定4种活性成分在君迁子叶和Fr3中的含量,结果表明Mytr在君迁子叶（2107.49 mg/100g）和Fr3（28240.69mg/100g）中的含量显着高于其它3种成分,分别是Myt的164.39和33.61倍。继而进一步比较了4种活性成分的抗氧化、清除NIT和抑制NDMA形成的活性,Mytr的活性显着强于Fr3、Myt-Gal和Myt-Glc（p<0.05）,微弱于Myt。最后,采用凝胶色谱对Fr3进行进一步分离和纯化,得到纯度为95.18%的Mytr。综合以上结果,确定君迁子叶中抑制NAs形成的主要活性成分为Mytr。3.Mytr对NAs致L-02细胞损伤的抑制作用及机理。通过观察和比较样品组和NDEA模型组的细胞形态、细胞存活率、细胞内ROS水平、细胞凋亡率和细胞周期,研究了Mytr对NDEA致L-02细胞损伤的抑制作用及机理。结果表明50～200μM的Mytr对正常肝L-02细胞无损伤;NDEA可诱导L-02细胞损伤,导致细胞凋亡;与正常对照组相比,NDEA模型组的细胞存活率显着下降（p<0.05）,凋亡率及胞内ROS水平显着升高（p<0.05）,G0/G1期细胞增加、S期和G2/M期细胞减少;Mytr各剂量组均可有效逆转模型组的各项指标水平,与模型组相比,Mytr高剂量组（200μM）细胞存活率提升49.80%,凋亡率下降47.40%,胞内ROS水平降为模型组的38.68%,G0/G1期细胞减少、S期和G2/M期细胞增加。表明Mytr可有效抑制NAs诱导L-02细胞损伤,其机制与阻断细胞凋亡通路、调节细胞周期、降低细胞内ROS水平有关。4.Mytr抑制内源性NAs形成与阻断NAs诱导癌变的机理。给实验大鼠长期同时灌胃亚硝酸钠（S-NIT）和氨基比林诱损剂8周造模;样品组大鼠在摄入诱损剂前,先灌胃不同剂量的样品。实验结束后,比较各实验组大鼠的肝脏形态、结节产生情况、组织病理学改变、血清和肝脏生化指标等,探究Mytr抑制大鼠体内NAs形成以及阻断NAs诱导癌变的机理。结果如下:（1）与正常对照组相比,模型组大鼠体重增加缓慢,相对肝重明显增大,肝颜色发暗,表面粗糙,光泽度差,3例表面出现瘤块;肝细胞内出现大量空泡、肝小叶结构破坏,出现多核等细胞异型性变化,纤维化明显,天狼猩红及PCNA染色阳性区域明显增加;血清ALB及A/G水平显着降低（p<0.05）,AFP、ALP、ALT、TP、GLB、TBIL和AST水平显着升高（p<0.05）,尤其AFP水平为正常对照组的7.61倍;肝组织MDA及8-OHd G含量明显升高（p<0.05）,GSH含量、CAT和SOD酶的活性显着下降（p<0.05）;肝Ⅰ相代谢酶CYP1A1和Ⅱ相代谢酶GST-pi的基因表达水平和蛋白表达量显着升高（p<0.05）,Ⅰ相代谢酶CYP1A2、CYP2E1和Ⅱ相代谢酶GST-mu、GST-alpha、UGT1A1和UGT1A6的基因表达水平和蛋白表达量明显降低（p<0.05）。（2）Mytr中、高剂量组显着逆转了模型组的各项指标水平。与模型组相比,Mytr高剂量组大鼠体重明显增加,相对肝重显着降低,肝色泽、光滑度及光泽度明显好转,未出现瘤块;肝小叶结构较好,纤维化、空泡、细胞异型性变化、天狼猩红及PCNA染色阳性区域明显减少;血清ALB及A/G水平显着升高（p<0.05）,AFP、ALP、ALT、TP、GLB、TBIL和AST水平明显降低（p<0.05）,尤其AFP水平仅为模型组的29.41%;MDA及8-OHd G含量分别降为模型组的79.64%和73.85%,GSH含量及CAT和SOD的活性分别升为模型组的1.80、1.42和1.80倍;CYP1A1和GST-pi的基因表达水平和蛋白表达量显着降低（p<0.05）,CYP1A2、CYP2E1、GST-mu、GST-alpha、UGT1A1和UGT1A6的基因表达水平和蛋白表达量明显升高（p<0.05）。结论:长期给实验大鼠摄入高剂量S-NIT和氨基比林,可由于形成内源性NAs导致肝脏发生癌变;Mytr可有效抑制S-NIT和氨基比林内源形成NAs所致的肝脏癌变,其抑癌机理与减轻大鼠肝脏脂质氧化和DNA损伤、提升肝脏抗氧化物（酶）的活性和调节肝脏Ⅰ相和Ⅱ相代谢酶的表达水平有关。5.Mytr作为添加剂对蒸煮肠中NAs形成的抑制作用及机理。通过比较各实验组蒸煮肠在储藏过程中（0～28 d）的p H值、细菌总数、脂质过氧化物（POV）、硫代巴比妥酸反应物（TBARS）、挥发性盐基氮（TVB-N）、NIT及9种NAs的含量,探究Mytr对蒸煮肠中NAs形成的抑制作用及机理。结果表明Mytr可有效抑制蒸煮肠在储藏过程中形成NAs,其机理与抑菌、延缓蛋白质和脂肪腐败以及清除NIT有关。
王文平[3]（2021）在《重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的毒性评价及重楼皂苷Ⅰ的肝毒性机制探究》文中提出研究目的:药源性肝损伤是一项严重的公共卫生问题,据调查统计,我国药源性肝损伤的发病率逐年升高;重楼是一种临床常用中药,因其抗肿瘤活性日益受到重视。重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ是重楼中3种重要的皂苷类成分,越来越多的研究和报道显示其对多种肿瘤细胞均具有杀伤作用。但重楼在抗肿瘤作用的同时毒副作用研究较少,尤其是其单体类成分。本研究围绕重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的潜在毒性及其作用机制进行深入的探索。以期为中药重楼的临床合理应用以及基于重楼皂苷单体的药物研发提供借鉴和参考。研究方法:（1）从细胞、模式生物-斑马鱼、动物3个层面进行了重楼皂苷单体的毒性评价。首先选择了 9种细胞考察了重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的细胞毒性情况,包括3种肝细胞（HepaRG、HL-7702和WRL-68细胞）,3种肾细胞（HK-2、HKC和293T细胞）和3种心脏细胞（H9c2、HUVEC和HCMEC细胞）;利用模式生物-斑马鱼模型考察不同浓度重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ对斑马鱼生存率的影响,确定了 LC50、LC10与最大非致死浓度（MNLC）;体视荧光显微镜观察重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ给药前后肝脏、肾脏和心脏的形态,统计斑马鱼的肾脏水肿率、心率和心包水肿率。利用Image-Pro Plus 5.1.0软件统计给予重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ前后斑马鱼肝脏面积和荧光强度、肾脏面积和荧光强度、心脏SV-BA距离,评价重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的潜在肝、肾、心毒性;通过HE染色和TUNEL染色观察斑马鱼给药前后肝组织病理情况及肝细胞凋亡情况;通过小鼠的急性毒性实验,得出LC50值。然后进行小鼠血清生化检测和组织病理切片分析。各个层面数据相互支持,补充验证,使研究基础更加全面可靠,结论更加合理。（2）选用HepaRG细胞研究重楼皂苷Ⅰ的肝细胞毒性机制。利用酶标仪、流式细胞仪、倒置荧光显微镜等对HepaRG细胞乳酸脱氢酶（LDH）释放、DAPI染色、活性氧（ROS）、线粒体膜电位（MMP）、细胞凋亡及细胞周期等进行测定,利用Western blot对凋亡相关蛋白进行检测;选用HUVEC细胞研究重楼皂苷Ⅰ的心血管毒性机制。从抑制新血管生成和促进心血管细胞凋亡两个方面评价了重楼皂苷Ⅰ的血管毒性机制。进行了LDH释放、细胞迁移、细胞凋亡、DAPI染色、细胞周期以及体外血管生成等研究,测定了近30个相关蛋白的表达。（3）利用TMT标记定量蛋白质组学技术检测给药组和对照组小鼠肝脏组织中的差异蛋白,对差异蛋白进行GO及Pathway通路富集分析;利用STRING11.0构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络;采用IPA软件进一步筛选出与表型相关的潜在生物标志物;利用Q300靶向代谢组学技术研究给药组和对照组小鼠血清样本中内源性代谢物的变化情况。采用PCA、OPLS-DA等分析小鼠内源性代谢物的轮廓变化。比较给药前后小鼠血清样本代谢谱的差异,寻找与重楼皂苷Ⅰ致肝毒性相关的代谢差异物及代谢调控网络。使用Cytoscape对蛋白组学和代谢组学做关联分析。采用PCR和Western blot技术对肝毒性机制中的关键蛋白进行进一步的验证。研究结果:（1）重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ毒性实验结果:重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ均具有明显的细胞毒性,能显着的促进H9c2细胞外其余8种细胞的凋亡,且呈现浓度和时间依赖性。对于H9c2细胞,3种皂苷均呈现出低剂量促进增殖,高剂量抑制增殖的作用;斑马鱼实验结果:重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ对斑马鱼的LC50分别为121、213、570 ng/mL,LC10分别为109、178、456ng/mL,MNLC分别为99、146、357ng/mL;毒性器官评价方面,重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ对斑马鱼具有显着的肝脏毒性,能明显降低斑马鱼肝脏面积和荧光强度;重楼皂苷Ⅰ能显着影响斑马鱼的心率,提示其具有心血管毒性;重楼皂苷Ⅰ和Ⅶ能降低斑马鱼肾脏面积和荧光强度,具有一定的肾毒性,但3种皂苷均未造成肾水肿;斑马鱼病理切片显示重楼皂苷Ⅰ给药组的肝组织出现空泡和严重的肝细胞坏死;TUNEL染色结果显示重楼皂苷Ⅰ给药组出现了肝细胞凋亡;动物实验结果:小鼠体内实验发现,重楼皂苷Ⅰ具有体内毒性,其LC50为24.5 mg/kg;给药组血清中ALT、AST显着升高,SOD降低;给药组病理切片显示出显着的肝细胞损伤和脂肪样变性以及一定的心脏毒性。（2）重楼皂苷Ⅰ肝细胞毒性机制:重楼皂苷Ⅰ显着升高了 HepaRG细胞中ROS水平,引起MMP下降,Cyt c从线粒体向胞浆中释放,早期及晚期凋亡细胞增多,LDH的释放量升高。改变了周期蛋白P21、cyclinA、cyclinE和CDK2的表达,诱导细胞周期阻滞。并且明显激活了凋亡通路蛋白Fas、P53、caspase-3、caspase-8、caspase-9的表达,且呈现剂量依赖关系;重楼皂苷Ⅰ血管毒性机制:重楼皂苷Ⅰ显着促进了心血管细胞LDH的释放,抑制细胞迁移和血管生成,改变周期分布,诱导细胞凋亡。给药后的细胞中VEGFR2、p-VEGFR2、Src、p-Src、PI3K、Src、P38、PLCy 等近 30 种蛋白的表达均发生了改变。（3）蛋白组学结果:共筛选出302个差异蛋白,其中上调蛋白182个,下调蛋白120个。差异蛋白具有氧化还原酶活性、催化活性等分子功能,参与了脂肪酸代谢、有机酸的代谢、药物代谢、氧化还原过程等生物过程。主要分布在细胞质和细胞内膜结合细胞器包括线粒体、内质网等;Pathway结果显示,差异蛋白在细胞色素P450酶对药物的代谢、细胞色素P450对外源物质的代谢、过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（PPARγ）等途径上富集程度较高;PPI网络分析发现差异蛋白主要聚集在三个功能区域,包括细胞色素P450酶、脂质代谢过程、氧化还原过程;IPA商业数据库筛选出9个与肝毒性相关的差异蛋白作为潜在生物标志物;代谢组学结果:给药组代谢物轮廓明显偏离对照组;通过多维和单维的差异代谢物的交集,筛选并初步鉴定出97种差异代谢物,25条代谢通路。结果归纳显示重楼皂苷Ⅰ造成了体内5个方面的代谢异常,包括氨基酸代谢、脂肪酸代谢、谷胱甘肽代谢、能量代谢、蛋白质合成;其中D-谷氨酰胺与D-谷氨酸代谢,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢,花生四烯酸代谢,氨酰tRNA生物合成等代谢通路影响值相对较高;代表性差异代谢物为花生四烯酸、焦谷氨酸、乙醇酸、酰基肉碱等。对全文中研究的重楼皂苷Ⅰ的肝毒性情况进行了综合分析,总结并推测了重楼皂苷Ⅰ造成肝毒性的机制。采用qPCR及Western blot验证了关键蛋白Bax、CYP1A2、P53、Fas的表达,对推测的肝损伤机制进行了初步验证。研究结论:（1）细胞实验研究发现重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ均具有肝脏、肾脏、心血管细胞毒性;斑马鱼实验研究确定了 3种皂苷中毒性最强的为重楼皂苷Ⅰ,毒性最明确的毒性靶部位是肝脏和心血管;斑马鱼肝脏病理切片、TUNEL染色,小鼠生化指标、病理切片检测进一步验证了重楼皂苷Ⅰ的肝脏和心脏毒性;（2）重楼皂苷Ⅰ肝细胞毒性机制为ROS应激通路和死亡受体通路介导的细胞凋亡;心血管毒性主要作用通路为VEGFR2激活的下游PI3K/AKT/mTOR、Src/eNOS、PLCy/ERK/MEK、P38信号通路,JAK2/STAT3信号传导通路和Bcl-2家族介导的凋亡通路,从诱导心血管细胞凋亡和抑制新生血管两方面产生心血管毒性。（3）蛋白质组学和代谢组学实验结果结合全文数据推测重楼皂苷Ⅰ诱导的肝毒性机制可能为CYP450酶和脂质代谢介导的线粒体功能障碍为主体的肝细胞损伤。药物影响了:①多种CYP450酶。主要包括Ⅰ相代谢酶CYP1A1、CYP1A2和Ⅱ相代谢酶GSTA3和UGT1A1表达紊乱,呈现下调趋势。药物在体内的水解、代谢过程被减慢,随着作用时间的延长,药物毒性反应增加。未被代谢的药物作用可能作用于线粒体,造成线粒体功能障碍;也很有可能是Ⅱ相药物代谢酶下调,产生的毒性代谢中间产物作用于线粒体,进一步产生了肝脏毒性;②脂质代谢。线粒体损伤后β-氧化的功能受到影响,体内的游离脂肪酸不能被氧化而转化成甘油三脂,导致了体内脂质的蓄积。同时ATP合成减少,供能障碍。脂质蓄积还能产生脂毒性进一步影响线粒体功能,产生过量ROS;③线粒体氧化应激。过量的ROS生成诱导线粒体氧化应激,释放Cyt c,升高Bax,降低Bcl-2,进而激活caspase家族导致肝细胞凋亡。Western blot验证结果显示药物代谢酶CYP1A2显着下调以及凋亡关键蛋白Bax表达上调。qPCR结果显示凋亡相关基因P53、Bax以及Fas的表达均显着上调,验证实验佐证了机制推论的合理性。
肖志明[4]（2021）在《典型双酚类化合物在鸡蛋和蛋鸡体内代谢转化规律研究》文中研究说明环境内分泌干扰物（Environmental endocrine disrupting chemicals,EDCs）又称环境类激素（Environmental hormone）,是指可通过干扰动物或人体内保持自身平衡和调节发育过程天然激素的合成、分泌、运输、结合、反应和代谢等过程,从而对动物或人体的生殖、神经和免疫系统等的功能产生影响的外源性化学物质。EDCs具有低含量以及干扰动物和人体内分泌过程、“三致”（致癌、致畸、致突变）、诱发糖尿病等毒性效应,能够通过食物链危害人体健康。目前,对于EDCs影响食品安全相关研究是国际上的热点研究课题,但关于EDCs在“环境—饲料—养殖动物—畜禽产品”全链条迁移转化方面仍存在盲区。针对上述问题,本研究建立了饲料及畜产品中双酚类EDCs的高灵敏度确证分析方法,揭示了双酚类EDCs在饲料及畜产品中的赋存状态,并在国际上首次阐明了新型双酚类化合物BPF在蛋鸡体内的迁移转化及代谢规律,初步探明了其从“环境—饲料—养殖动物—畜禽产品”全链条迁移中的Carry-over和Transfer factor,为饲料和畜产品中双酚类EDCs的风险评估和限量制定提供基础性数据支撑。研究建立了饲料和动物源性食品中八种双酚类化合物（BPA、BPS、BPF、BPAF、BPB、BPP、BPAP、BPBP）的直接提取和超声探针辅助酶解（Enzymatic probe sonication,EPS）结合超高效液相色谱—串联质谱（UPLC-MS/MS）检测方法。方法的检出限（LODs）为0.02～0.05?g/kg,定量限（LOQs）为0.1～0.2?g/kg,平均回收率在81.2～106.0%之间,批内变异系数为0.6～9.7%,批间变异系数均≤12.5%,在0～50?g/L范围内的线性关系良好（R2≥0.996）。本研究EPS时间仅为120 s,而传统酶解方法需要12 h以上,从而大幅提升工作效率,特别适用于大批量动物源性样品的检测处理。将建立的EPS-UPLC-MS/MS方法用于市售动物源性食品中双酚类化合物的暴露分析,结果显示BPA、BPS、BPF、BPAF、BPP和BPB的检出率分别为65.2%、42.4%、33.7%、29.4%、28.3%和27.2%,表明BPA替代品已经得到了大范围应用,并对动物源性食品造成一定程度的污染。通过Pearson相关性分析结果显示BPA和BPAF、BPS和BPF、BPS和BPAF、BPF和BPAF之间均具有显着相关性,表明这些化合物在动物源性食品中存在共同污染,可能具有相同的污染来源。研究发现BPF暴露对蛋鸡的生产性能具有显着影响,空白对照组、低剂量组（0.1 mg/kg）、中剂量组（0.5 mg/kg）和高剂量组（2.5 mg/kg）蛋鸡的产蛋率分别为82.8±2.3%、89.3±3.8%、82.2±4.3%和75.6±3.3%。低剂量组、高剂量组蛋鸡产蛋率与空白对照组相比均具有极显着性差异（p<0.001）,中剂量组蛋鸡产蛋率和空白对照组之间则无差异,表明BPF暴露对蛋鸡产蛋率的影响呈现典型的非剂量—效应关系（Non-linear/non-monotonic dose-response curve）。鉴于非剂量—效应关系是内分泌干扰物的典型特征之一,也与动物和人体正常的激素作用是一致的,表明BPF暴露对蛋鸡可能具有内分泌干扰效应。BPF在蛋鸡体内吸收迅速,在暴露第2天即可从鸡蛋中检出BPF,并在暴露期第11天达到峰浓度(Cmax),低、中、高剂量组Cmax分别为1.63±1.30μg/kg、7.06±2.83μg/kg和26.2±4.96μg/kg。中剂量组在暴露后第8天即超过了欧盟规定的人体BPA每日耐受摄入量（Tolerable Daily Intake,TDI）4μg/kg bw/day,而高剂量组仅需暴露4天后即可超过TDI限量规定。BPF在蛋黄中的含量（69.1±7.4μg/kg）远高于蛋清中（3.0±0.4μg/kg）,蛋黄中BPF浓度大约是蛋清中的23倍。蛋鸡肝脏中BPF的含量水平远高于血浆、鸡蛋和肌肉,表明肝脏是双酚类化合物主要的作用靶标。低、中、高剂量组肝脏中BPF的消除半衰期大约为5.8、4.5和4天。肝脏中BPF消除呈现先快后慢的趋势,低剂量组在消除期第14天后低于方法LODs,中、高剂量组则在第28天后低于方法LODs。采用超高效液相色谱—高分辨率质谱（UPLC-HRMS）研究了BPF在蛋鸡体内外代谢,发现BPF在鸡肝微粒体中主要发生细胞色素P450酶参与的羟基化、水解和氧化反应,发现了5种I相代谢产物,分别为4-（Hydroxymethyl）phenol（m/z 123）、o-OH BPF（m/z 215）、GSH conjugated BPF（m/z 504）和GSH conjugated o-OH BPF（m/z 520）。BPF在蛋鸡体内则主要发生葡萄糖醛酸酶和硫酸酯酶参与的羟基化及结合反应,共发现了6种II相代谢产物,分别为肝脏细胞色素P450酶作用下生成的羟基化Hydroxylated BPF（m/z 215）,芳基硫酸酯酶作用下生成的单磺酸结合BPF（BPF-sulfate,m/z 279）以及双磺酸结合BPF（BPF-disulfate,m/z 359）,葡萄糖醛酸酶作用下生成的单葡萄糖醛酸结合BPF（BPF-glucuronide,m/z 375）和双葡萄糖醛酸结合BPF（BPF-diglucuronide,m/z 551）,以及BPF-磺酸/葡萄糖醛酸（BPF-sulfate/glucuronide,m/z 455）。
孟迪[5]（2020）在《Bacillus amyloliquefaciens YP6在降解有机磷农药中的作用及机理》文中认为有机磷农药广泛地应用于家庭和农业中病虫害的防治,但其对非靶标生物的高毒性及潜在的迟发性神经毒性,已经造成了严重的环境污染和生态破坏。论文筛选高效降解毒死蜱的菌株,分析其16S rRNA和gyrB基因序列、研究其生理生化特征和降解特性;通过全基因组测序获得该菌株完整的遗传信息;利用转录组测序技术探讨其降解有机磷农药的机制,并获得降解相关的基因;研究其降解酶的基因特性、降解功能和酶学性质;利用环境模式生物斑马鱼对辛硫磷酶解产物的毒理性进行评估;具有一定的理论意义和潜在的应用价值。论文的主要研究结果如下:（1）比较了实验室保藏的20株具有促生和解磷作用的芽孢杆菌,从中筛选出一株高效降解毒死蜱的菌株YP6,经16S rRNA和gyrB基因序列分析及生理生化实验鉴定,确定菌株YP6属于解淀粉芽孢杆菌,并命名为Bacillus amyloliquefaciens YP6,其保藏号为CCTCC NO:M 2018875。Bacillus amyloliquefaciens YP6是一株广谱型降解菌,对有机磷农药毒死蜱、敌敌畏、敌百虫、三唑磷和辛硫磷具有较高的降解能力,尤其对辛硫磷的降解效率最高;该菌能够以辛硫磷为唯一磷源生长,但不能以其为唯一碳源;该菌能够在含有辛硫磷的LB液体培养基中快速生长并高效降解辛硫磷。利用响应面组合获得了该菌的最优降解条件:培养基初始pH 7.2,培养温度40°C和初始接种量为4.17%（v/v）。在最适条件下,该菌可耐受并降解高达700 mg·L-1的辛硫磷。通过液质联用（HPLC-MS）检测了菌株YP6降解辛硫磷的代谢中间产物并推测出该菌对辛硫磷的降解途径。（2）通过PacBio+Illumina Hiseq高通量测序方法对菌株YP6进行了全基因组测序,GenBank登录号为CP032146。该菌株仅含有一条大小为4009619 bp的染色体、GC含量为45.9%、共4322个基因,其中4210个CDS已注释到各大公共数据库中。对菌株的基因组进行生物信息学分析发现该菌与Bacillus amylollquefaciences MT45的亲缘关系最为接近,而且与NCBI数据库中已完成全基因组测序和组装的35株解淀粉芽孢杆菌全基因组对比,该菌的蛋白编码基因数远多于其它35株菌,但注释到“碳水化合物运输和代谢（G）”、“翻译,核糖体结构及合成（J）”、“转录（K）”、“细胞壁/细胞膜/包膜合成（M）”和“信号转导机制（T）”的基因数目却最少;此外,该菌株中含有一些促生物质（IAA合成前体物质色氨酸、铁载体和植酸酶）、抗菌活性的次级代谢产物（如Surfactin、Fengycin、Bacilysin、Macrolactin和Bacilaene）、编码鞭毛、细菌趋化性所需的全部基因,同时含有一些异型生物质（如氨基苯甲酸酯、阿特拉津、苯甲酸盐、氯烷烃、氯苯等）降解代谢途径中部分所需酶的基因。（3）辛硫磷作用下的转录组测序结果发现,菌株YP6降解辛硫磷的过程中有689个基因表达上调,851个基因表达下调。糖ABC转运蛋白、多药ABC转运蛋白、MFS转运蛋白等可能参与了菌株YP6将污染物运输到细胞内的过程。水解酶、单加氧酶、NADPH-细胞色素P450还原酶、糖基转移酶可能参与了辛硫磷水解、脱硫氧化、脱烷基以及糖基转移的代谢过程。细菌趋化性、双组分传感器、DNA摄取与重组和DNA修复等基因的表达上调有利于菌体抵御污染物造成的氧化胁迫。通过qRT-PCR验证了部分基因在转录水平上的表达情况,且结果与转录组数据一致。（4）基于HPLC-MS检测的菌株YP6对辛硫磷的降解中间产物、全基因组数据以及辛硫磷作用下的转录组数据分析锁定了3个碱性磷酸酯酶基因（D2M30＿2812、D2M30＿0296和D2M30＿1007）和1个NADPH-细胞色素P450还原酶基因（D2M30＿0765）,分别编码AP1、AP2、AP3和P450B-1。通过生物信息学分析获得了AP1、AP2、AP3和P450B-1的一级结构、二级结构和三级结构信息,并成功得到了AP2、AP3和P450B-1的蛋白模型。通过异源表达获得了具有生物活性的重组AP1、AP2、AP3和P450B-1;辛硫磷降解实验发现除AP1外,AP2、AP3和P450B-1对辛硫磷均表现出良好的降解性能。对重组酶的酶学性质研究,获得了AP2、AP3和P450B-1的最适p H（5.5、10.0和5.0）、最适反应温度（30、40和40°C）以及不同浓度、不同金属离子对重组酶活性的影响。以对硝基磷酸苯二钠（pNPP）作为AP2和AP3的底物,7-乙氧基香豆素作为P450B-1的底物Km分别为260.4、12.2和1.6 mmol·L-1;kcat分别为2.3×105、3.3×106和1.7×10-2 s-1;kcat/Km分别为8.8×102、2.7×105和1.1×10-2 L·s-1·mmol-1。（5）AP2、P450B-1以及AP2与P450B-1联合处理均能降解辛硫磷,且降解率分别为61.1、34.8和73.2%;通过HPLC-MS检测三种处理方式后的辛硫磷酶解产物发现AP2主要作用于辛硫磷中的P-O键,而P450B-1主要参与O-C2H5键的脱乙基反应。通过斑马鱼的急性毒性检验,显示这三种酶处理辛硫磷方式均有一定程度的解毒效果,其中AP2和P450B-1联合作用对辛硫磷的降解不仅速度快,而且降解比较完全,降解后产物的毒性与未降解辛硫磷相比明显降低。
李晨星[6]（2020）在《Variovorax paradoxus S110细胞色素P450：CYP116B256v2的异源表达及催化特性研究》文中进行了进一步梳理细胞色素P450单加氧酶（Cytochrome P450 monooxygenases）是一种广泛存在于自然界中的亚铁血红素–硫醇盐蛋白超家族,可催化羟基化、环氧化和O-脱烷基等多种类型的反应,特别是其可以在温和条件下,催化复杂化合物中惰性C-H键的区域和立体选择性氧化反应,从而实现传统化学反应难以实现的各类合成反应,因而其在有机合成,药物合成等方面具有很高的应用价值。为丰富P450酶作为合成生物学的酶元件库、探索新型催化反应进一步提高P450酶的应用价值,本研究利用生物信息学手段挖掘到来自两种不同菌株（Sphingomonas wittichii RW1和Variovorax paradoxus S110）的细胞色素P450单加氧酶并对它们进行异源表达和催化特性分析,主要研究结果如下:分别对这两种不同来源的P450酶进行异源表达,发现只有来源于Variovorax paradoxus S110菌株中的P450酶能在大肠杆菌中实现异源可溶表达,以下称之为P450VpMO。对其氨基酸序列进行分析并与其他已报道的P450家族蛋白氨基酸序列比对发现该酶属于P450酶CYP116B家族,是一种新型电子自供体类蛋白。P450VpMO的光谱学性质研究结果显示,其氧化状态在420 nm处有最大吸收峰,利用连二亚硫酸钠将P450VpMO还原并与一氧化碳结合后其最大吸收峰偏移至450 nm处,具有典型的P450酶光谱学特征;以4’-甲氧基苯乙酮脱甲基反应为模式反应对P450VpMO的酶学性质进行研究,发现其最适pH为8.0,最适温度为45℃,并且在温度低于35℃时具有良好的稳定性,Km值为0.458 mmol·L-1,kcat为2.438 min-1。底物谱研究表明,与已研究报道的P450SMO,P450Labr,P450-Hal1等相似,P450VpMO不仅可以氧化硫醚,催化苯乙烯,还可以对多种含烷基底物进行脱烷基化的反应。底物谱结果显示相比于硫醚的氧化和苯乙烯的催化,P450VpMOpMO O-脱烷基的反应活性最高,其中对4’-甲氧基苯乙酮的脱甲基反应转化率高达91%。另外,进一步研究发现重组P450VpMO还可以降解含甲氧基的抗生素污染物甲氧苄胺嘧啶。综上研究表明,P450VpMO是细胞色素P450单加氧酶家族一种电子自供体类型的新型P450酶,具有较高的电子传递效率,可以催化多种不同的反应类型是合成生物学重要的酶元件,具有极高的应用价值。
张羽[7]（2020）在《典型有毒污染物对克氏原螯虾的毒性效应与作用机制研究》文中研究表明随着我国城镇化进程加速以及工业化的快速推进,工业废水排放和突发性水污染对水生态环境和人类健康等方面影响日益严重。在众多种类的水环境有毒污染物中,重金属类、天然毒素类以及抗炎药物类污染物最为普遍;而在上述三类有毒污染物中,镉（Cd）、LR型微囊藻毒素（Microcystin-LR,MC-LR）和双氯芬酸（DCF）三种典型污染物的污染状况则尤为突出。由于水体内有毒污染物所引发的环境问题日益严峻,其所导致的生态毒理效应己成为全球关注的重大环境热点问题之一。然而,目前针对有毒污染物的毒性机制研究还存在诸多不足。基于以上现状,针对有毒污染物对水生动物的毒性作用机制研究已成为目前环境毒理学领域亟待深入研究的科研课题。本文系统地研究Cd、MC-LR及DCF三种染污物对克氏原螯虾（Procambarus clarkii）的抗氧化防御系统、肝胰腺基因转录特征、肠道菌群及主要靶器官的组织病理变化等方面的影响,为有毒污染物的水环境生态风险评估提供理论依据。通过研究克氏原螯虾的肝胰腺、鳃和肠道等主要靶器官对有毒污染物的氧化应激反应发现,在Cd暴露实验中,克氏原螯虾肝胰腺内的丙二醛（MDA）含量以及超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽硫转移酶（GST）三种抗氧化酶活性均出现不同程度提高,并在暴露于不同浓度Cd达到72 h时均达到显着水平。另外,MC-LR和DCF暴露实验表明,锰超氧化物歧化酶基因（Mn SOD）、过氧化氢酶基因（CAT）、谷胱甘肽硫转移酶基因（GST）、谷胱甘肽过氧化物酶基因（GPx）、金属硫蛋白基因（MT）和热休克蛋白70基因（HSP70）在不同器官内的表达呈现出不同的变化趋势,即MC-LR和DCF在肝胰腺、鳃和肠道内均会引起不同程度的氧化应激与抗氧化防御。同时,不同的抗氧化应激相关基因的表达水平也发生不同程度的变化来对氧化应激作用做出反应。通过对肝胰腺组织病理分析发现,当克氏原螯虾暴露于有毒污染物时,其肝胰腺组织均出现了包括腔体膨胀和空泡结构等病理变化。与此同时,转录组测序分析发现,2、5和10 mg/L Cd暴露组分别产生1061、747和1086个差异表达基因（DEGs）。在5和10 mg/L Cd暴露组内,DEGs分别显着富集到5个和10个GO条目。另外,10 mg/L Cd引起抗原加工提呈等通路发生显着富集。在MC-LR暴露实验中,10和40μg/L MC-LR暴露组分别产生了372和781个DEGs。在10和40μg/L MC-LR暴露组中,DEGs分别显着富集到1个和33个GO条目。此外,40μg/L MC-LR还引起半乳糖代谢通路的显着富集。在DCF暴露实验中,1和10 mg/L DCF暴露组分别有642和586个基因发生异常表达。10 mg/L DCF暴露组中的DEGs显着富集到12个GO条目。上述三种有毒污染物还引起了克氏原螯虾肝胰腺内氧化还原及免疫相关基因的差异表达,进而对氧化还原平衡、解毒、代谢以及免疫等功能产生影响。通过对肠道组织进行组织病理分析发现,5和10 mg/L Cd均会引起肠道组织出上皮细胞排列异常、固有层扩大及微绒毛空泡等病理变化;与此同时,1和10mg/L DCF也会导致类似的病理变化;相比之下,MC-LR暴露后的肠道则出现了嗜酸性颗粒细胞（EGCs）,并在40μg/L MC-LR暴露条件下出现了肌层疏松及淋巴细胞向固有层浸润的现象。利用16S r RNA高通量测序技术对克氏原螯虾肠道菌群进行鉴定,并探究肠道群落多样性和群落结构对Cd、MC-LR和DCF的响应变化规律。结果发现,Cd、MC-LR和DCF均会对肠道菌群的多样性及组成产生影响,并改变克氏原螯虾肠道细菌在不同分类水平的丰度,进而破坏肠道菌群平衡,损害肠道微生物群落的功能和稳定性。
周文莉[8]（2020）在《“Cocktail”探针药物法评价人工牛黄对大鼠肝微粒体细胞色素P450不同亚型酶体内外代谢活性的影响》文中研究表明目的:人工牛黄作为牛黄（Bovis Calculus）的代用品,具有化痰定惊和清热解毒的效果,在临床上广泛用于治疗心血管系统、呼吸系统和中枢神经系统疾病,目前已和很多药物组成了中成药制剂。在人工牛黄被广泛使用的同时,由于中西药配伍使用所引发的严重不良反应逐渐受到重视,其中尤以中西药复方制剂感冒通（人工牛黄、双氯芬酸钠和扑尔敏组成的中西药复方制剂）引发血尿的症状最为突出,患者在使用该药一段时间后出现以血尿为主的近千例不良反应的报道。通过进一步的研究发现,发生相互作用的机制主要是由细胞色素P450酶介导的代谢性相互作用。本课题采用LC-MS/MS测定方法和探针药物法,研究人工牛黄对CYP450酶（Cyp2e1、Cyp3a1、Cyp2d1、Cyp2c11、Cyp2c6、Cyp2c7、Cyp2b1和Cyp1a2）体内外代谢活性的影响,以期为人工牛黄与其他西药或中药联合应用提供参考。方法:体外试验:采用大鼠肝微粒体外孵育法建立测定CYP450酶特异性底物对应的代谢产物N-去乙基阿莫地喹（Cyp2c7）、对乙酰氨基酚（Cyp1a2）、右啡烷（Cyp2d1）、1-羟基咪达唑仑（Cyp3a1）、羟化安非他酮（Cyp2b1）、4-羟基美芬妥英（Cyp2c11）、6-羟基氯唑沙宗（Cyp2e1）和4-羟基甲苯磺丁脲（Cyp2c6）的LC-MS/MS定量分析方法,并对该法进行方法学验证。建立以非那西丁/安非他酮/阿莫地喹/氯唑沙宗/甲苯磺丁脲/美芬妥英/右美沙芬/咪达唑仑作为CYP450酶（Cyp1a2/Cyp2b1/Cyp2c7/Cyp2e1/Cyp2c6/Cyp2c11/Cyp2d1/Cyp3a1）特异性底物的体外评价体系用于研究对大鼠肝微粒体CYP450酶抑制作用,CYP450酶的活性用对应的代谢产物的浓度来表征,并通过对八个阳性抑制剂（α-萘黄酮/噻替哌/槲皮素/奎尼丁/磺胺苯吡唑/噻氯匹定/酮康唑/4-甲基吡唑）的CYP450酶抑制潜能的考察,验证该体系的可靠性。考察人工牛黄提取液对CYP450酶亚型的影响,以孵育体系中加入人工牛黄与未加人工牛黄的对照组进行比较,测定代谢产物,分析人工牛黄对酶亚型的影响。体内试验:建立同时测定大鼠体内CYP450酶特异性底物对应的代谢产物的LC-MS/MS分析方法,并对该法进行方法学验证。将12只SD雄性大鼠随机平均分为2组:人工牛黄组（10mg/kg）和对照组,连续灌胃14天,第15天各组大鼠分别尾静脉注射探针药物,于预设时间点眼眦取血,用建立的分析方法测定大鼠血浆中八种代谢产物的血药浓度,用DAS2.0软件计算代谢产物的主要药代动力学参数,通过对比人工牛黄组和空白组的主要药动学参数,评价人工牛黄在大鼠体内对细胞色素P450不同亚型酶Cyp2e1、Cyp3a1、Cyp2d1、Cyp2c11、Cyp2c6、Cyp2c7、Cyp2b1和Cyp1a2酶代谢活性的影响。结果:体外试验:建立了检测周期短,灵敏度高,操作简便的可以同时测定体外肝微粒体中八种探针底物代谢产物的LC-MS/MS方法。测得IC50和FDA参考值相近,表明体外孵育的评价体系中八种阳性抑制剂对各自的CYP450酶均有显着抑制作用。结果显示,人工牛黄对Cyp3a1、Cyp2d1、Cyp2c11、Cyp2c6四种酶亚型均有不同程度的抑制作用,对Cyp2e1、Cyp2c7、Cyp2b1和Cyp1a2酶活性无明显影响。体内试验:建立了一种LC-MS/MS分析方法,可以同时测定八种探针药物代谢产物对乙酰氨基酚、N-去乙基阿莫地喹、右啡烷、1-羟基咪达唑仑、羟化安非他酮、4-羟基美芬妥英、4-羟基甲苯磺丁脲和6-羟基氯唑沙宗在大鼠体内的血药浓度。专属性、线性关系良好,准确度、精密度高,稳定性及基质效应均符合生物样本检测要求。与对照组相比,实验组对乙酰氨基酚、N-去乙基阿莫地喹、右啡烷、1-羟基咪达唑仑、羟化安非他酮、4-羟基甲苯磺丁脲和6-羟基氯唑沙宗的主要药动学参数AUC（0t）、AUC（0∞）、MRT（0-t）、MRT（0∞）、Vd、CL和t1/2都没有无显着性差异。人工牛黄提取物对4-羟基美芬妥英的药动学参数产生了明显的影响,AUC（0～t）明显的增加,Vd明显降低。结论:人工牛黄体外对Cyp3a1、Cyp2d1、Cyp2c11、Cyp2c6四种酶亚型均有不同程度的抑制作用,对Cyp2e1、Cyp2c7、Cyp2b1和Cyp1a2活性无明显影响。人工牛黄在体内对Cyp2c11有诱导作用,对Cyp2e1、Cyp3a1、Cyp2d1、Cyp2c6、Cyp2c7、Cyp2b1和Cyp1a2酶活性无影响。
范冰冰[9]（2020）在《赤芍总苷抗肝肿瘤药效物质分析及作用机制研究》文中指出目的赤芍为毛茛科植物芍药Paeonia lactiflora Pall.或川赤芍Paeonia veichii Lynch的干燥根。味苦,性微寒,归肝经,有清热凉血、散瘀止痛的功效。用于热入营血,温毒发斑,吐血衄血,目赤肿痛,肝郁胁痛,经闭痛经,症瘕腹痛,跌扑损伤,痈肿疮疡等症。赤芍总苷具有多种药理作用,如抗血栓、抗氧化、抗肿瘤、抗内毒素、保护神经系统和心脏等作用。本课题对赤芍的有效组分赤芍总苷进行提取、纯化及药效筛选研究,采用UPLC-QTOF-MS等现代分析仪器和方法对赤芍总苷的化学成分进行研究;采用网络药理学研究方法,利用疾病靶点数据库、Swiss Target Prediction、SEA等网络数据库平台的大数据资源,揭示赤芍总苷治疗肝癌所调控的靶点及信号通路。通过H22荷瘤肝癌小鼠模型及体外Hep G2细胞模型,开展赤芍总苷抗肿瘤体内及体外药理、药效学研究,明确赤芍总苷是否具有抗肝肿瘤作用;并从细胞周期、凋亡、相关基因、蛋白角度及对细胞色素P450酶不同亚型活性及基因水平的影响对赤芍总苷发挥抗肝肿瘤作用的机理进行研究;通过大鼠血清中肝损伤、氧化应激、线粒体损伤指标的含量变化,探究赤芍总苷是否引起大鼠肝脏毒性。本研究明确赤芍总苷具有抗肝肿瘤作用,并从多角度阐释其作用机制,为赤芍总苷的临床应用及进一步开发利用提供实验依据和理论基础。方法1.采用紫外-可见分光光度法和高效液相色谱法,通过L9（34）正交试验设计,以液料比、提取时间、提取次数为考察因素,以芍药苷、赤芍总苷、出膏率的综合评分为评价指标,筛选赤芍总苷最佳提取工艺;采用紫外-可见分光光度法,结合大孔树脂技术,通过静、动态吸附与解吸试验,筛选赤芍总苷的最佳纯化工艺。采用MTT法,通过肝癌Hep G2细胞增殖抑制率比较赤芍、赤芍总苷体外抗肝肿瘤作用。2.采用UHPLC-Q-TOF-MS技术,结合对照品、文献、相关数据库信息比对的办法,对赤芍总苷化学成分进行研究;采用分子网络研究方法,构建赤芍总苷分子离子可视化网络图,结合质谱相关信息,全面表征赤芍总苷成分。3.采用体外药效MTT法,以细胞增殖抑制率为评价指标,开展赤芍总苷对肝癌Hep G2细胞增殖影响的研究;通过建立H22肝癌荷瘤小鼠模型,以抑瘤率、脏器指数、瘤体病理切片及血清中细胞因子ALT、AST、FAS、FASL、IL-2、IFN-γ、TNF-α的含量为考察指标,开展赤芍总苷体内抗肝肿瘤药效学研究。4.采用网络药理学研究方法,利用TCMSP、SEA及Swiss Target Prediction网络数据库平台的大数据资源,挖掘赤芍总苷成分调控靶点基因信息;利用Drugbank、Dis Ge NET、及TTD数据库,查找肝癌相关靶点,从而得到赤芍总苷成分调控肝癌的生物学靶点;采用STRING等数据库,得到靶点之间蛋白互作网络图,探讨靶点之间的相互关系,并通过对靶点进行GO基因功能注释分析,明确赤芍总苷成分参与调控肝癌生物过程、细胞组成和分子功能;进而利用KEGG数据库对靶点进行信号通路富集分析,从大数据方面揭示赤芍总苷治疗肝癌所调控的靶点及信号通路。5.利用流式细胞仪,采用Annexin V-FITC/PI双染色法,开展赤芍总苷对肝癌Hep G2细胞凋亡影响的研究;采用PI单染色法,开展赤芍总苷对肝癌Hep G2细胞周期影响的研究。6.采用实时荧光定量q RT-PCR技术,检测经赤芍总苷作用于肝癌Hep G2细胞后,细胞中相关基因的表达量;采用Western Blot技术,检测经赤芍总苷作用于肝癌Hep G2细胞后,细胞中相关蛋白的表达量,分别从基因及蛋白水平阐释赤芍总苷抗肝肿瘤作用机制。7.通过ELISA法检测大鼠肝脏中细胞色素P450亚酶CYP1A2,CYP3A4,CYP2D6,CYP2C9,CYP2E1活性,采用实时荧光定量q RT-PCR技术检测CYP1A2,CYP3A2,CYP2D1,CYP2C11,CYP2E1 m RNA水平的表达,考察赤芍总苷对细胞色素P450酶不同亚型的影响。8.通过ELISA法检测大鼠血清中ALT、AST、ALP及γ-GT的含量变化,探究赤芍总苷对肝脏组织的损伤程度;通过ELISA法检测大鼠血清中SOD、MDA及GSH的含量变化,探究赤芍总苷对肝脏组织氧化损伤的程度;通过ELISA法检测大鼠血清中Na+-K+-ATPase的含量变化,探究赤芍总苷对肝脏组织线粒体的损伤程度。结果1.赤芍总苷的最佳提取工艺为8倍量30%乙醇,回流提取2次,每次2 h;赤芍总苷的最佳纯化工艺为选用HPD-700大孔吸附树脂,上样生药浓度为0.1g/m L,树脂比上柱量为0.3g/m L（原药材/湿树脂）,2BV水除杂,5BV 30%乙醇洗脱,即得赤芍总苷化学物质组分。赤芍、赤芍总苷作用于肝癌Hep G2细胞的增殖抑制率分别为69.66%、66.00%。2.采用UHPLC-Q-TOF-MS技术,经正离子检测模式,经对照品、文献与相关数据库信息确定芍药苷、苯甲酰芍药苷、芍药内酯苷、氧化芍药苷;比对推测出芍药内酯苷异构体、毛蕊异黄酮苷、牡丹皮苷E、没食子酰芍药苷或异构体构建赤芍总苷的分子可视化网络,共找到5个分子网络成分簇,其中一个分子簇为芍药苷及其相关化合物。3.利用TCM-SP、SEA及Swiss Target Prediction网络数据库平台,挖掘出赤芍总苷成分共调控139个潜在靶蛋白。利用Drugbank、Dis Ge NET、及TTD数据库,共找到5727个癌症相关靶点。通过VENNY软件对赤芍总苷各成分靶蛋白与肝癌潜在靶点进行映射,共得到99个交集靶点,主要包含IL-2、Bcl-2、TNF、PTEN等。通过靶点之间蛋白互作网络图,明确靶点之间的相互关系,并通过对靶点进行GO基因功能注释分析,明确赤芍总苷成分在生物过程方面主要富集于细胞增殖的正调控、凋亡过程的负调控、MAPK级联、炎症反应的负性调节等;在细胞组成方面主要富集于线粒体、细胞外间隙、死亡诱导信号复合物等;在分子功能方面主要富集于一氧化氮合酶调节活性、蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶活性、生长因子活性等各种蛋白酶活性。KEGG通路富集分析结果显示有84条通路参与到赤芍总苷作用于肝癌细胞的过程,主要包括MAPK、PI3K/Akt、VEGF、肿瘤坏死因子、癌症中心碳代谢等信号通路。4.体外药效实验结果显示,赤芍总苷1mg/m L给药浓度作用于肝癌Hep G2细胞24h,36h,48h的抑制率分别为66.00%、72.52%、74.10%,IC50值分别为0.71、0.57、0.52mg/m L;体内药效实验结果显示,环磷酰胺组、赤芍总苷低、中、高剂量组的抑瘤率分别为57.61%、23.06%、36.64%、48.13%,除赤芍总苷低剂量组,肿瘤的抑制作用均超过30%（中药的瘤重抑制率>30%,评定药物具有抑瘤作用）,符合相关要求。5.与模型组比较,赤芍总苷高、中剂量组血清中ALT、AST、FAS、FASL的含量显着降低、IL-2的含量显着升高,均有显着性差异（p<0.01或p<0.05）,赤芍总苷各剂量组血清中IFN-γ、TNF-α的含量显着降低,均有显着性差异（p<0.01）。6.赤芍总苷作用于肝癌Hep G2细胞36h,低、中、高剂量组的凋亡率分别为11.7%、16.9%、22.9%;与模型组比较,赤芍总苷中剂量组肝癌Hep G2细胞G2/M期的比例降低。7.赤芍总苷作用于肝癌Hep G2细胞36h后,与模型组比较,赤芍总苷组细胞中Akt、Bcl-2、PI3K、MEK、ERK m RNA和蛋白的水平均不同程度降低,均有显着性差异（p<0.01）,PTEN、Bax m RNA的水平均不同程度升高,均有显着性差异（p<0.01）。8.与空白组比较,赤芍总苷组CYP1A2活性显着增强,有显着性差异（p<0.01）,CYP3A4、CYP2D6、CYP2C9和CYP2E1活性没有显着性变化;与空白组比较,赤芍总苷组CYP1A2 m RNA水平显着升高,有显着性差异（p<0.01）,CYP3A2,CYP2D1,CYP2C11和CYP2E1 m RNA水平没有显着性变化。9.与空白组比较,赤芍总苷组大鼠血清中ALT、AST、ALP、γ-GT、SOD、MDA、GSH及Na+-K+-ATPase的含量没有显着变化。结论1.本课题优化了赤芍总苷的提取纯化方法,其工艺简单且操作方便,为赤芍总苷的后续药效研究奠定了一定基础。2.采用UHPLC-Q-TOF-MS技术、构建赤芍总苷化学成分网络,能够全面表征赤芍总苷成分,并能呈现成分之间的关系,为其开发利用及药效研究奠定实验基础。3.采用网络药理学研究手段,挖掘赤芍总苷成分调控肝癌的生物学靶点,通过蛋白网络互作分析、基因功能注释分析、靶点调控通路分析等,实现赤芍总苷抗肝肿瘤作用机制的快速、系统分析,发现赤芍总苷抗肝癌作用可能与PI3K/Akt、MAPK等信号通路相关。4.赤芍总苷对Hep G2肝癌细胞增殖有抑制作用,其作用机制是通过诱导Hep G2细胞凋亡、降低G2/M期细胞的比例,扰乱细胞正常分裂状态达到抑制作用。5.赤芍总苷能够减轻肝脏损伤程度,对肝脏具有一定的保护作用。6.赤芍总苷发挥抗肝肿瘤作用可能与抑制Hep G2细胞的增殖、诱导其凋亡,调控PI3K/Akt及MEK/ERK信号通路有关。7.赤芍总苷可能通过诱导CYP450酶亚型CYPl A2的活性发挥抗肝肿瘤作用。8.赤芍总苷在一定剂量范围内及一定给药时间内,不影响肝脏的功能,没有肝毒性,值得进一步深入研究。
罗丹丹[10]（2020）在《八氢姜黄素立体异构体对药物代谢酶和肝损伤的作用研究》文中研究说明目的:姜黄（Rhizoma Curcumae Longae）是姜科植物姜黄（Curcumalonga L.）的干燥根茎,主要活性成分为姜黄素（Curcumin）。由于抗氧化和抗炎活性较高,姜黄素被广泛用于肝脏相关疾病的预防和治疗。然而,姜黄素的稳定性、溶解度和生物利用度较差,临床应用价值很低。因此,姜黄素的体内代谢产物如四氢姜黄素（Tetrahy drocurcumin）和八氢姜黄素（Octahydrocurcumin）,成为近几年国内外的生物医学研究热点。八氢姜黄素是姜黄素的氢化代谢产物,具有比姜黄素更强的抗炎和抗氧化活性。但是,由于获取困难,未见八氢姜黄素的肝保护作用研究。八氢姜黄素的化学结构中含有2个手性C原子。由于结构对称性,产生了 2个立体异构体,分别是（3R,5S）-octahydrocurcumin（又称 Meso-octahydrocurcumin,Meso-OHC）和（3S,5S）-octahydrocurcumin（（3S,5S）-OHC）。然而,姜黄素的体内代谢是否能够产生八氢姜黄素立体异构体未见报道。当立体异构体作用于人体的手性环境时,其立体结构在生物体内引起不同酶系的分子识别造成“手性识别”现象,从而产生不同的药效。但是,关于八氢姜黄素的2个立体异构体,是否能在生物体内引起“酶系识别”作用,从而产生差异性的药理活性未见报道。本文首先采用对乙酰氨基酚（Acetaminophen,APAP）诱导的小鼠急性肝损伤模型,探讨八氢姜黄素的肝保护作用及相关机制;通过高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography,HPLC）检测大鼠灌胃姜黄素之后不同代谢样品,确认八氢姜黄素立体异构体是否存在;采用快速柱层析结合萃取法制备Meso-OHC和（3S,5S）-OHC纯品,用于后续动物实验;采用制备液相法制备Meso-OHC和（3S,5S）-OHC单体,用于后续化学结构鉴定和细胞实验;采用“Cocktail”探针药物法研究Meso-OHC和（3S,5S）-OHC对L-02细胞的药物代谢酶影响,以探讨立体异构体是否会引起“酶系识别”作用;采用APAP诱导的小鼠急性肝损伤模型研究Meso-OHC和（3S,5S）-OHC的肝保护作用及相关机制,以探讨立体异构体间的差异性药理活性。方法和结果:1.八氢姜黄素抗APAP诱导的急性肝损伤的作用及机制研究采用APAP诱导的小鼠急性肝损伤模型研究八氢姜黄素的肝保护作用,并以姜黄素和四氢姜黄素为参考,确认其作用强度。实验过程中,测定下述指标以探讨八氢姜黄素的作用及机制:测定ALT和AST活性;制备H&E病理切片;测定肝组织中GSH、SOD、CAT、T-AOC、MDA和ROS水平;体外肝微粒体孵育法测定CYP2E1酶活性;RT-PCR 法测定 CYP2E1、GCLC、GCLM、NQO1 和 HO-1 的 mRNA 表达;Western blot法检测CYP2E1、GCLC、GCLM、NQO1和HO-1的总蛋白、胞浆Keap1和核内外Nrf2蛋白的表达;分子对接探讨八氢姜黄素与CYP2E1酶和Keap1蛋白之间的结合机制。实验结果表明,八氢姜黄素（25,50和100 mg/kg）具有良好的抗APAP肝损伤作用,且呈剂量依赖性。八氢姜黄素可显着改善小鼠肝功能（ALT和AST）及肝脏组织病理状态,并且作用强度优于姜黄素和四氢姜黄素。八氢姜黄素抗APAP肝损伤的主要作用机制为:改善肝脏氧化应激状态（提高GSH、SOD、CAT和T-AOC水平,降低MDA和ROS水平）;与CYP2E1酶结合并抑制其活性和表达;与Keap1蛋白结合,抑制Keap1蛋白的表达,继而促进Nrf2蛋白核转位,最终激活Keap1-Nrf2抗氧化应激通路;诱导Keap1-Nrf2抗氧化应激通路下游目的基因（GCLC、GCLM、NQO1和HO-1）的表达。2.姜黄素大鼠体内代谢研究以大鼠为研究对象,收集大鼠灌胃姜黄素（100 mg/kg）后的血液、肝脏、尿液和粪便样品。采用HPLC法分析代谢样品中是否存在八氢姜黄素立体异构体。实验结果表明,大鼠灌胃姜黄素后,其血液、肝脏、尿液和粪便样品中均可检测出八氢姜黄素立体异构体（M1和M2,其中M2极性较大）。此外,2种立体异构体在不同样品中的分布比例有所不同:血液中M2:M1=0.34:1;肝脏中M2:M1=0.73:1;尿液中 M2:M1=4.59:1;粪便中 M2:M1=0.81:1。3.八氢姜黄素立体异构体拆分制备和结构鉴定采用快速柱层析结合萃取法制备M1和M2的纯品,为动物实验提供药物储备;采用制备液相法制备M1和M2的单体,为化学结构鉴定和细胞实验提供药物储备;采用液相质谱（Liquid mass spectrometry,LC-MS）、核磁共振氢谱与碳谱（Nuclear paramagnetic resonance spectroscopy,NMR）、比旋光度以及X-射线单晶衍射法确定M1和M2的绝对构型。采用快速柱层析结合萃取法获得M1和M2的纯品,纯度均大于95%;经制备液相纯化后获得M1和M2的单体,纯度大于98%。经LC-MS和1H-NMR检测分析后,M1和M2的结构数据基本一致,均符合八氢姜黄素相关文献记录,确认两者均为八氢姜黄素。经13C-NMR和比旋度检测分析,确认M1和M2分别为Meso-OHC和（3S,5S）-OHC,符合相关文献记录。此外,采用溶剂扩散法首次制备出了 M1单晶,经X-射线单晶衍射法检测分析后,确认M1的绝对构型为Meso型。4.八氢姜黄素立体异构体对L-02细胞药物代谢酶的作用研究采用“Cocktail”探针药物法结合分子对接,评价Meso-OHC和（3S,5S）-OHC对L-02 的药物代谢酶（CYP1A2、CYP2A6、CYP2C9、CYP2C8、CYP2E1 和 UGTs）活性影响及相关机制;采用RT-PCR法,测定Meso-OHC和（3S,5S）-OHC对CYP1A2、CYP2A6、CYP2C9、CYP2C8、CYP2E1 和 UGTs 酶 mRNA水平的影响。实验结果表明,6.25、12.5、25、50、100 和 200μM 剂量下,Meso-OHC 和（3S,5S）-OHC对L-02细胞活力无影响,可用作后续细胞实验剂量。6.25～100μM剂量下,Meso-OHC和（3S,5S）-OHC对L-02细胞的大部分药物代谢酶（CYP1A2、CYP2A6、CYP2C9、CYP2C8和UGTs）的活性或者表达无显着影响,表明其潜在的药物与药物之间相互作用（Drug-drug interaction,DDI）风险较低。此外,Meso-OHC 和（3S,5S）-OHC均可以抑制CYP2E1酶的活性和表达,并且Meso-OHC的作用强度显着优于（3S,5S）-OHC。以上结果表明,CYP2E1酶对Meso-OHC和（3S,5S）-OHC具有选择性识别作用。分子对接进一步表明,Meso-OHC和（3S,5S）-OHC均可与CYP2E1酶活性部位结合,但结合部位和结合能有所不同。5.八氢姜黄素立体异构体抗APAP诱导的急性肝损伤作用和机制研究采用APAP诱导的小鼠急性肝损伤模型研究Meso-OHC和（3S,5S）-OHC的肝保护作用和机制。实验过程中,测定下述指标以探讨Meso-OHC和（3S,5S）-OHC的作用和机制:测定ALT和AST活性;制备H&E病理切片;测定GSH、SOD、CAT、T-AOC和MDA水平;免疫组化法测定3-NT和4-HNE的表达;Elisa法测定CYP2E1和UGT1A1 酶活性、TNF-α 和 IL-1β水平;RT-PCR 测定 CYP2E1、UGT1A1、TNF-α、IL-1β、GCLC、GCLM、NQO1 和 HO-1 的基因表达;Western blot 法检测 CYP2E1、UGT1A1、IκBα、p-IκBα、GCLC、GCLM、NQO1 和 HO-1 的总蛋白表达,胞浆 Keap1、核内外p65和Nrf2蛋白表达;分子对接法研究八氢姜黄素立体异构体与p65蛋白和Keap1蛋白之间的结合机制。实验结果表明,Meso-OHC和（3S,5S）-OHC（25,50和100mg/kg）具有良好的抗APAP肝损伤作用,且呈剂量依赖性。Meso-OHC和（3S,5S）-OHC均可显着改善小鼠肝功能（ALT和AST）及肝脏组织病理状态,并且Meso-OHC的作用强度优于（3S,5S）-OHC。Meso-OHC和（3S,5S）-OHC的肝保护主要作用机制为:改善肝脏氧化应激状态（提高GSH、SOD、CAT和T-AOC水平,降低MDA、3-NT和4-HNE的水平）;抑制CYP2E1酶活性和表达;诱导UGT1A1酶活性和表达;与Keap1蛋白结合,抑制Keap1蛋白的表达,进而促进Nrf2核转位,最终激活Keap1-Nrf2抗氧化应激通路;诱导Keap1-Nrf2抗氧化应激通路下游目的基因（GCLC、GCLM、NQO1和HO-1）的表达;与p65蛋白结合,抑制IκBα向p-IκBα的转化,进而抑制p65蛋白核转位,最终抑制NFκB（p65）炎症通路的活化;抑制NFκB（p65）炎症通路下游目的基因（TNF-α和IL-1β）的表达。此外,两者作用机制存在一定差异:Meso-OHC激活Keap1-Nrf2通路的作用强度优于（3S,5S）-OHC,（3S,5S）-OHC抑制NFκB（p65）炎症通路的作用强度优于Meso-OHC。结论:本文的研究结果首次证实了八氢姜黄素具有良好的抗APAP诱导的肝损伤作用,主要机制为抑制CYP2E1酶和激活Keap1-Nrf2抗氧化应激通路。姜黄素的体内代谢可以产生八氢姜黄素立体异构体,并且2种八氢姜黄素立体异构体在不同的代谢部位（血液、肝脏、尿液和粪便）中的分布状况有所不同。CYP2E1酶对八氢姜黄素立体异构体具有选择性识别作用,主要机制为结合能和结合位点不同。八氢姜黄素立体异构体具有抗APAP诱导的肝损伤作用,主要机制为抑制CYP2E1酶、激活Keap1-Nrf2抗氧化应激通路、抑制NFκB（p65）炎症通路的活化。此外,八氢姜黄素立体异构体在APAP诱导的肝损伤模型中,存在差异性的肝保护行为:Meso-OHC对小鼠肝功能的改善作用优于（3S,5S）-OHC;Meso-OHC激活Keap1-Nrf2抗氧化应激通路的作用强度优于（3S,5S）-OHC;（3S,5S）-OHC抑制NFκB（p65）炎症通路的作用强度优于Meso-OHC。
二、细胞色素P450酶在化学物质诱导肝脏癌变作用及研究现状（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、细胞色素P450酶在化学物质诱导肝脏癌变作用及研究现状（论文提纲范文）
（1）含氮消毒副产物的P450酶代谢与细胞毒性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 消毒副产物简介 |
| 1.1.1 含氮消毒副产物 |
| 1.1.2 卤代乙酰胺的毒理学研究进展 |
| 1.1.3 卤代乙腈的毒理学研究进展 |
| 1.1.4 卤代硝基甲烷的毒理学研究进展 |
| 1.2 细胞色素P450 酶简介 |
| 1.2.1 细胞色素P450 酶的催化循环过程概述 |
| 1.2.2 细胞色素P450 酶的反弹机制和双自旋态反应性机制 |
| 1.3 理论基础与计算方法 |
| 1.3.1 密度泛函理论和B3LYP泛函 |
| 1.3.2 溶剂效应及极化连续介质模型 |
| 1.3.3 过渡态理论 |
| 1.3.4 Marcus电子转移理论 |
| 1.4 化学反应性与细胞毒性的关系 |
| 1.5 QSAR模型建立的一般过程 |
| 1.6 研究目标与研究内容 |
| 1.6.1 研究目标 |
| 1.6.2 研究内容 |
| 1.6.3 技术路线 |
| 第二章 细胞色素P450 酶代谢卤代硝基甲烷的DFT计算 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 计算方法 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 氧化反应机理 |
| 2.3.2 还原反应机理 |
| 2.3.3 氧化反应和还原反应的比较 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 含氮消毒副产物细胞毒性IC_(50)与生物巯基反应性的相关性研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 含氮消毒副产物细胞毒性IC_(50)的QSAR研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 HNMs及其他含氮消毒副产物的实验IC_(50)值 |
| 4.2.2 分子结构描述符 |
| 4.2.3 模型的建立与验证 |
| 4.2.4 模型应用域的定义及离域点的确定 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 QSAR模型的建立与机理解释 |
| 4.3.2 QSAR模型的验证 |
| 4.3.3 离域点 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 主要创新点 |
| 5.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 A |
| 作者简历及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）君迁子叶对N-亚硝胺形成与诱导癌变的抑制作用及机理（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩写符号说明 |
| 第一章 综述 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 国内外对NAs的研究概况 |
| 1.2.1 NAs及其危害 |
| 1.2.2 NAs的来源 |
| 1.2.3 降低NAs危害的方法 |
| 1.3 国内外对君迁子叶的研究概况 |
| 1.3.1 君迁子种属分布及资源 |
| 1.3.2 君迁子叶研究现状 |
| 1.4 国内外对Mytr的研究现状 |
| 1.5 本论文研究意义及研究内容 |
| 1.5.1 研究意义 |
| 1.5.2 研究内容及技术路线 |
| 第二章 君迁子叶抑制NAs形成及活性组分制备与筛选 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 主要材料与试剂 |
| 2.2.2 主要仪器 |
| 2.2.3 样品采集与处理 |
| 2.2.4 组分的制备及分析 |
| 2.2.5 PC含量测定 |
| 2.2.6 DPPH·清除实验 |
| 2.2.7 NIT清除实验 |
| 2.2.8 NAs形成抑制实验 |
| 2.2.9 抑菌活性的测定 |
| 2.2.10 数据处理 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 各组分的分离效果 |
| 2.3.2 PC含量 |
| 2.3.3 清除DPPH·活性 |
| 2.3.4 清除NIT活性 |
| 2.3.5 抑制NAs形成活性 |
| 2.3.6 抑菌活性 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 君迁子叶抑制NAs形成的活性成分分析与制备 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 主要材料与试剂 |
| 3.2.2 主要仪器 |
| 3.2.3 活性成分分析 |
| 3.2.4 活性成分确定与含量测定 |
| 3.2.5 活性成分的活性比较 |
| 3.2.6 主要活性成分的制备 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 Fr_3中抑制NAs形成的活性成分 |
| 3.3.2 活性成分的含量 |
| 3.3.3 活性成分的活性 |
| 3.3.4 主要活性成分的结构鉴定 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 君迁子叶活性成分Mytr对 NAs致 L-02 细胞损伤的抑制作用及机理 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 主要材料与试剂 |
| 4.2.2 主要仪器 |
| 4.2.3 细胞培养和样品制备 |
| 4.2.4 细胞活力测定 |
| 4.2.5 细胞内ROS的测定 |
| 4.2.6 细胞形态观察 |
| 4.2.7 细胞凋亡率及周期检测 |
| 4.3 数据处理 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 Mytr对正常肝L-02 细胞活力的影响 |
| 4.4.2 Mytr和 NDEA对 L-02 细胞存活率的影响 |
| 4.4.3 Mytr和 NDEA对 L-02 细胞内ROS的影响 |
| 4.4.4 Mytr和 NDEA对 L-02 细胞形态的影响 |
| 4.4.5 Mytr和 NDEA对 L-02 细胞凋亡率的影响 |
| 4.4.6 Mytr和 NDEA对 L-02 细胞周期的调控 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 君迁子叶活性成分Mytr对内源性NAs形成与诱导癌变的抑制作用及机理 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 主要材料与试剂 |
| 5.2.2 仪器 |
| 5.2.3 动物分组及给药 |
| 5.2.4 肝脏外观观察 |
| 5.2.5 血清指标检验 |
| 5.2.6 组织病理学检验 |
| 5.2.7 肝组织脂质过氧化产物含量及抗氧化酶活性的测定 |
| 5.2.8 肝组织Ⅰ相和Ⅱ相代谢酶m RNA表达水平的测定 |
| 5.2.9 肝Ⅰ相和Ⅱ相代谢酶蛋白表达量的测定 |
| 5.3 数据处理 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 肝脏外观 |
| 5.4.2 体重、肝重与相对肝重 |
| 5.4.3 血清生化结果 |
| 5.4.4 肝组织病理学结果 |
| 5.4.5 大鼠肝脏PCNA表达 |
| 5.4.6 肝组织过氧化产物含量及抗氧化酶的活性 |
| 5.4.7 肝Ⅰ相和Ⅱ相代谢酶m RNA相对表达水平和蛋白表达量 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 君迁子叶活性成分Mytr对蒸煮肠中NAs形成的抑制作用及机理 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验材料与方法 |
| 6.2.1 主要材料 |
| 6.2.2 主要试剂 |
| 6.2.3 主要仪器 |
| 6.2.4 蒸煮肠制作 |
| 6.2.5 新鲜度检测 |
| 6.2.6 NIT含量测定 |
| 6.2.7 NAs含量的测定 |
| 6.3 数据统计与处理 |
| 6.4 结果与讨论 |
| 6.4.1 Mytr对蒸煮肠p H值的影响 |
| 6.4.2 Mytr对蒸煮肠POV和 TBARS值的影响 |
| 6.4.3 Mytr对蒸煮肠TVB-N值的影响 |
| 6.4.4 Mytr对蒸煮肠中细菌总数的影响 |
| 6.4.5 Mytr对蒸煮肠中NIT含量的影响 |
| 6.4.6 Mytr对蒸煮肠中NAs含量的影响 |
| 6.5 小结 |
| 第七章 总结与展望 |
| 7.1 总结 |
| 7.2 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简况及联系方式 |
（3）重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的毒性评价及重楼皂苷Ⅰ的肝毒性机制探究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 综述一 重楼的药效成分、药理作用和不良反应研究现状 |
| 1 药效成分 |
| 2 药理作用 |
| 3 不良反应研究现状 |
| 4 总结与讨论 |
| 参考文献 |
| 综述二 中药药源性肝损伤机制研究进展 |
| 1 CYP代谢 |
| 2 线粒体稳态 |
| 3 氧化损伤 |
| 4 细胞凋亡 |
| 5 胆汁淤积 |
| 6 Ca~(2+)浓度平衡破坏 |
| 7 免疫激活介导的炎症因子释放 |
| 8 特异反应 |
| 9 总结与讨论 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 技术路线图 |
| 第一章 重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的体内外毒性评价 |
| 第一节 重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的细胞毒性实验 |
| 1 概述 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 第二节 模式生物-斑马鱼评价重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的毒性 |
| 1 概述 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 第三节 重楼皂苷Ⅰ的小鼠毒性实验研究 |
| 1 概述 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 第四节 小结与讨论 |
| 1 重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的细胞毒性实验 |
| 2 模式生物-斑马鱼评价重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的毒性 |
| 3 重楼皂苷Ⅰ的小鼠毒性实验研究 |
| 本章总结与讨论 |
| 第二章 重楼皂苷Ⅰ的细胞毒性机制研究 |
| 第一节 肝细胞毒性机制研究 |
| 1 概述 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 第二节 心血管细胞毒性机制研究 |
| 1 概述 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 第三节 小结与讨论 |
| 1 肝细胞毒性机制研究 |
| 2 心血管毒性机制研究 |
| 本章总结 |
| 第三章 基于蛋白组学和代谢组学探索重楼皂苷Ⅰ的体内肝毒性机制 |
| 第一节 TMT标记定量蛋白质组学 |
| 1 概述 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 5 生物信息分析 |
| 6 机制分析 |
| 7 PPI网络 |
| 8 潜在生物标志物 |
| 第二节 Q300靶向代谢组学 |
| 1 概述 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 5 通路富集 |
| 6 通路分析 |
| 7 潜在生物标志物 |
| 第三节 小结与讨论 |
| 1 TMT标记定量蛋白质组学 |
| 2 Q300靶向代谢组学 |
| 3 蛋白组学-代谢组学关联分析 |
| 第四节 重楼皂苷Ⅰ肝毒性机制验证 |
| 1 动物组织Western blot验证 |
| 2 斑马鱼qPCR实验验证 |
| 3 小结与讨论 |
| 结语 |
| 1 重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的体内外毒性评价 |
| 2 重楼皂苷Ⅰ的细胞毒性机制研究 |
| 3 重楼卓苷Ⅰ的蛋白组学和代谢组学研究 |
| 4 重楼皂苷Ⅰ肝毒性机制推测与分析 |
| 5 不足与展望 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）典型双酚类化合物在鸡蛋和蛋鸡体内代谢转化规律研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 环境内分泌干扰物(EDCs)概述 |
| 1.1.1 EDCs定义 |
| 1.1.2 EDCs类别 |
| 1.1.3 EDCs暴露 |
| 1.1.4 EDCs危害 |
| 1.1.5 EDCs作用机制 |
| 1.2 双酚类EDCs概述 |
| 1.2.1 双酚类EDCs相关法律法规规定 |
| 1.2.2 双酚类EDCs理化性质 |
| 1.2.3 双酚类EDCs暴露 |
| 1.2.4 双酚类EDCs毒性作用 |
| 1.2.5 双酚类EDCs检测技术 |
| 1.2.6 双酚类EDCs代谢 |
| 1.3 本论文研究内容 |
| 1.3.1 研究背景及意义 |
| 1.3.2 研究内容 |
| 第二章 饲料及畜产品中双酚类化合物检测方法建立及暴露评估 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 试验方法 |
| 2.1.3 统计分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 基质添加标准曲线 |
| 2.2.2 方法的检出限(LODs)和定量限(LOQs) |
| 2.2.3 方法的选择性 |
| 2.2.4 准确度、精密度和重现性 |
| 2.2.5 实际样品测定 |
| 2.2.6 人体通过动物源性食品摄入双酚类EDCs暴露评估 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 质谱条件优化 |
| 2.3.2 色谱条件优化 |
| 2.3.3 直接提取法条件优化 |
| 2.3.4 超声探针辅助酶解(EPS)条件优化 |
| 2.3.5 双酚类EDCs检测结果比较 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 典型双酚类化合物BPF在鸡蛋和蛋鸡体内迁移转化规律研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 蛋鸡暴露试验方法 |
| 3.1.2 样品测定 |
| 3.1.3 统计分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 饲料和饲料原料中常规营养成分及BPF本底测定结果 |
| 3.2.2 混合均匀度测定 |
| 3.2.3 BPF暴露对蛋鸡生产性能的影响 |
| 3.2.4 BPF在鸡蛋中的分布规律 |
| 3.2.5 BPF在蛋鸡血液中的代谢规律 |
| 3.2.6 BPF在蛋鸡肝脏中的代谢规律 |
| 3.2.7 BPF在蛋鸡肌肉中的代谢规律 |
| 3.2.8 Carry-over和Transfer factor |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 结合态BPF占总BPF的比例 |
| 3.3.2 BPF对蛋鸡生产性能的影响及其内分泌干扰作用机制 |
| 3.3.3 Carry-over rates和transfer factors |
| 3.4 小结 |
| 第四章 典型双酚类化合物BPF在蛋鸡体内外代谢比较研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 试验方法 |
| 4.1.3 UPLC-HRMS测定 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 鸡肝微粒体蛋白浓度测定结果 |
| 4.2.2 鸡肝微粒体细胞色素P450酶活力测定结果 |
| 4.2.3 UPLC-HRMS质量控制 |
| 4.2.4 BPF裂解途径解析 |
| 4.2.5 BPF在鸡肝微粒体中的I相代谢产物 |
| 4.2.6 BPF在蛋鸡体内的II相代谢产物 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 药物体内外代谢研究方法 |
| 4.3.2 UPLC-HRMS非靶向筛查技术 |
| 4.3.3 样品前处理和仪器条件优化 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 结论 |
| 5.1 研究总结 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 研究展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（5）Bacillus amyloliquefaciens YP6在降解有机磷农药中的作用及机理（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词索引表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 有机磷农药概述 |
| 1.1.1 有机磷农药的结构 |
| 1.1.2 有机磷农药的发展 |
| 1.1.3 有机磷农药的污染 |
| 1.1.4 有机磷农药的危害 |
| 1.2 有机磷农药的生物降解 |
| 1.2.1 生物降解简介 |
| 1.2.2 有机磷农药降解菌 |
| 1.2.3 有机磷农药降解酶 |
| 1.3 微生物基因组研究 |
| 1.3.1 基因组及基因组学简介 |
| 1.3.2 微生物基因组分析 |
| 1.4 微生物转录组研究 |
| 1.4.1 转录组及转录组学简介 |
| 1.4.2 微生物转录组分析 |
| 1.5 斑马鱼及其在毒理学中的应用 |
| 1.5.1 斑马鱼的特点 |
| 1.5.2 斑马鱼在环境污染物中的毒性评价 |
| 1.6 论文的立题依据和研究内容 |
| 1.6.1 立题依据 |
| 1.6.2 研究内容 |
| 第二章 降解菌株的筛选、鉴定及降解特性 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 菌种 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.2.3 实验试剂 |
| 2.2.4 培养基 |
| 2.2.5 实验方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 不同菌株促生能力的检测 |
| 2.3.2 不同菌株对毒死蜱的降解特性 |
| 2.3.3 菌株YP6的鉴定 |
| 2.3.4 菌株YP6的底物谱分析 |
| 2.3.5 菌株YP6在不同培养基中的生长状况及对辛硫磷的降解特性 |
| 2.3.6 菌株YP6降解辛硫磷条件的优化 |
| 2.3.7 菌株YP6对辛硫磷的耐受性 |
| 2.3.8 菌株YP6降解辛硫磷的代谢产物检测与代谢途径分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 菌株YP6的全基因组测序及分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 菌种 |
| 3.2.2 实验仪器与试剂 |
| 3.2.3 实验方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 菌株B.amyloliquefaciens YP6 基因组DNA提取 |
| 3.3.2 菌株YP6基因组组装与测序 |
| 3.3.3 菌株YP6基因组注释 |
| 3.3.4 比较基因组学分析 |
| 3.3.5 菌株YP6基因组中促生物质和抗菌物质合成基因簇 |
| 3.3.6 菌株YP6基因组注释中降解相关特性分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 菌株YP6降解辛硫磷的机制 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 菌种 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.2.3 实验试剂 |
| 4.2.4 培养基 |
| 4.2.5 实验方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 RNA-seq测序质量 |
| 4.3.2 RNA-seq |
| 4.3.3 辛硫磷作用下细胞应激响应相关的差异表达基因 |
| 4.3.4 辛硫磷作用下物质运输相关的差异表达基因 |
| 4.3.5 辛硫磷作用下代谢相关的差异表达基因 |
| 4.3.6 辛硫磷作用下参与促生物质和抗菌物质合成相关的差异表达基因 |
| 4.3.7 qRT-PCR验证 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 辛硫磷降解酶基因及其异源表达 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 菌种 |
| 5.2.2 实验仪器 |
| 5.2.3 实验试剂 |
| 5.2.4 培养基 |
| 5.2.5 实验方法 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 AP1、AP2、AP3和P450B-1 的生物信息学分析 |
| 5.3.2 AP1、AP2、AP3和P450B-1 蛋白同源建模 |
| 5.3.3 异源表达 |
| 5.3.4 辛硫磷降解验证 |
| 5.3.5 酶学性质 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 辛硫磷酶解产物对斑马鱼的急性毒理研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 试验动物 |
| 6.2.2 实验仪器 |
| 6.2.3 盐溶液 |
| 6.2.4 实验方法 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 辛硫磷酶解产物液质分析 |
| 6.3.2 辛硫磷的最大非致死浓度(MNLC)和LC_(10) |
| 6.3.3 酶处理辛硫磷对斑马鱼的急性毒性的影响 |
| 6.4 讨论 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 论文主要创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ:作者在攻读博士学位期间发表的论文 |
| 附录Ⅱ:Bacillus amyloliquefaciens属全基因组信息 |
| 附录Ⅲ:菌株YP6促生物质和抗菌物质基因(簇)结构示意图 |
| 附录Ⅳ:异型生物质降解途径及相关基因 |
（6）Variovorax paradoxus S110细胞色素P450：CYP116B256v2的异源表达及催化特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 P450酶概述 |
| 1.1.1 P450酶的来源及命名 |
| 1.1.2 P450酶分类 |
| 1.2 P450酶的催化反应机制以及反应类型 |
| 1.2.1 P450酶的催化反应机制 |
| 1.2.2 P450酶的催化反应类型 |
| 1.3 P450酶的功能 |
| 1.4 P450酶的应用 |
| 1.4.1 P450酶在医药中应用 |
| 1.4.2 P450酶与环境污染物 |
| 1.4.3 P450酶在农业中应用 |
| 1.4.4 P450酶在实际应用中遇到问题 |
| 1.5 CYP116B家族P450酶的研究现状 |
| 1.6 Variovorax sp.功能简介 |
| 1.6.1 有机硫化合物代谢与Variovorax sp. |
| 1.6.2 除草剂代谢与Variovorax sp. |
| 1.6.3 工业污染物代谢与Variovorax sp. |
| 1.6.4 Variovorax sp.与P450酶 |
| 1.7 本论文立题依据以及研究内容 |
| 1.7.1 立题依据 |
| 1.7.2 本论文的主要研究内容 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌种与质粒 |
| 2.1.2 主要实验仪器 |
| 2.1.3 主要实验试剂及来源 |
| 2.1.4 主要培养基 |
| 2.2 分析方法 |
| 2.2.1 菌体浓度测定方法 |
| 2.2.2 蛋白浓度测定方法 |
| 2.2.3 光谱学性质测定方法(一氧化碳示差法) |
| 2.2.4 P450_(VpMO)酶活力的测定 |
| 2.2.5 SDS-PAGE检测分析方法 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 P450_(VpMO)目的基因与表达载体的克隆及酶连 |
| 2.3.2 胶回收方法 |
| 2.3.3 大肠杆菌Top10 以及BL21(DE3)感受态细胞制备与质粒转化 |
| 2.3.4 菌液PCR验证以及质粒抽提方法 |
| 2.3.5 目的蛋白表达与纯化方法 |
| 2.3.6 蛋白的浓缩 |
| 2.3.7 镍柱的重生 |
| 2.3.8 酶学性质的测定 |
| 2.3.9 重组P450_(VpMO)底物谱测试 |
| 第三章 结果与讨论 |
| 3.1 质粒构建与蛋白表达纯化 |
| 3.1.1 P450spwi01与P450Vp MO的质粒构建及蛋白表达纯化 |
| 3.1.2 P450_(VpMO)质粒构建及蛋白表达纯化 |
| 3.2 重组P450_(VpMO)光谱学性质的鉴定 |
| 3.3 重组P450_(VpMO)系统进化树的构建 |
| 3.4 重组P450_(VpMO)酶学性质测定 |
| 3.4.1 p H与温度对重组P450Vp MO酶活力的影响 |
| 3.4.2 重组P450_(VpMO)温度稳定性 |
| 3.4.3 重组P450_(VpMO)动力学参数测定 |
| 3.5 重组P450_(VpMO)的底物谱探索 |
| 3.5.1 重组P450_(VpMO)对硫醚类物质的氧化 |
| 3.5.2 重组P450_(VpMO)对苯乙烯的催化 |
| 3.5.3 重组P450_(VpMO)羟基化作用 |
| 3.5.4 重组P450Vp MO O-脱烷基反应 |
| 3.5.5 重组P450_(VpMO)对苯胺类物质反应测试 |
| 3.5.6 重组P450_(VpMO)对抗生素的降解测试 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录1 :作者在攻读硕士学位期间发表的论文 |
| 附录2 :本文中相关反应的液相色谱图 |
（7）典型有毒污染物对克氏原螯虾的毒性效应与作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 课题背景 |
| 1.2 典型有毒污染物及其毒性 |
| 1.2.1 镉及其毒性 |
| 1.2.2 微囊藻毒素及其毒性 |
| 1.2.3 双氯芬酸及其毒性 |
| 1.3 典型有毒污染物暴露对甲壳类水生动物毒性研究现状 |
| 1.3.1 Cd暴露对甲壳类水生动物毒性研究现状 |
| 1.3.2 MC-LR暴露对甲壳类水生动物毒性研究现状 |
| 1.3.3 DCF暴露对甲壳类水生动物毒性研究现状 |
| 1.4 克氏原螯虾在毒理学中的应用 |
| 1.4.1 克氏原螯虾作为靶生物的优势 |
| 1.4.2 克氏原螯虾在毒理学中的研究现状 |
| 1.5 研究目的、意义与主要内容 |
| 1.5.1 课题来源 |
| 1.5.2 研究的目的与意义 |
| 1.5.3 本课题研究内容 |
| 1.5.4 本课题技术路线 |
| 第2章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验试剂与仪器 |
| 2.1.1 实验试剂 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.2 实验设计 |
| 2.2.1 Cd暴露实验 |
| 2.2.2 MC-LR暴露实验 |
| 2.2.3 DCF暴露实验 |
| 2.3 氧化应激指标的测定 |
| 2.3.1 蛋白含量的测定 |
| 2.3.2 丙二醛(MDA)含量的测定 |
| 2.3.3 超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定 |
| 2.3.4 过氧化氢酶(CAT)活性的测定 |
| 2.3.5 谷胱甘肽硫转移酶(GST)活性的测定 |
| 2.4 组织病理切片 |
| 2.4.1 样本包埋与固定 |
| 2.4.2 HE染色 |
| 2.4.3 图像采集 |
| 2.5 实时荧光定量PCR检测 |
| 2.5.1 反转录 |
| 2.5.2 荧光定量PCR检测 |
| 2.6 高通量测序及分析 |
| 2.6.1 转录组测序及分析 |
| 2.6.2 Illumina测序及分析 |
| 第3章 污染物对克氏原螯虾的氧化胁迫作用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 Cd对克氏原螯虾的氧化胁迫作用 |
| 3.2.1 Cd对肝胰腺内MDA含量的影响 |
| 3.2.2 Cd对肝胰腺内抗氧化酶活性的影响 |
| 3.3 MC-LR对克氏原螯虾的氧化胁迫作用 |
| 3.3.1 MC-LR对抗氧化基因表达的影响 |
| 3.3.2 MC-LR对其他应激相关基因表达的影响 |
| 3.4 DCF对克氏原螯虾的氧化胁迫作用 |
| 3.4.1 DCF对抗氧化基因表达的影响 |
| 3.4.2 DCF对其他应激相关基因表达的影响 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 污染物暴露作用下克氏原螯虾肝胰腺病理及分子调控机制 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 Cd暴露作用下克氏原螯虾肝胰腺病理及分子调控特征 |
| 4.2.1 Cd对肝胰腺组织病理的影响 |
| 4.2.2 Cd暴露实验中转录组测序质量评估 |
| 4.2.3 Cd暴露实验中肝胰腺基因功能注释 |
| 4.2.4 Cd暴露实验中差异表达基因的分析 |
| 4.2.5 Cd暴露实验中转录组数据的q RT-PCR验证 |
| 4.3 MC-LR暴露作用下克氏原螯虾肝胰腺病理及分子调控特征 |
| 4.3.1 MC-LR对肝胰腺病理的影响 |
| 4.3.2 MC-LR暴露实验转录组测序质量评估 |
| 4.3.3 MC-LR暴露实验中肝胰腺基因功能注释 |
| 4.3.4 MC-LR暴露实验差异表达基因的分析 |
| 4.3.5 MC-LR暴露实验中转录组数据的q RT-PCR验证 |
| 4.4 DCF暴露作用下克氏原螯虾肝胰腺病理及分子调控特征 |
| 4.4.1 DCF对肝胰腺病理的影响 |
| 4.4.2 DCF暴露实验中转录组测序质量评估 |
| 4.4.3 DCF暴露实验中肝胰腺基因的功能注释 |
| 4.4.4 DCF暴露实验中差异表达基因的分析 |
| 4.4.5 DCF暴露实验中转录组数据的q RT-PCR验证 |
| 4.5 克氏原螯虾肝胰腺病理及分子调控机制解析 |
| 4.6 本章小结 |
| 第5章 污染物暴露作用下克氏原螯虾肠道病理及菌群响应机制 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 Cd对肠道病理与菌群的作用研究 |
| 5.2.1 Cd对肠道病理的影响 |
| 5.2.2 Cd对肠道微生物群落多样性的影响 |
| 5.2.3 Cd对肠道微生物群落结构的影响 |
| 5.3 MC-LR对肠道病理及菌群的作用研究 |
| 5.3.1 MC-LR对肠道病理的影响 |
| 5.3.2 MC-LR对肠道微生物群落多样性的影响 |
| 5.3.3 MC-LR对肠道微生物群落结构的影响 |
| 5.4 DCF对肠道病理及菌群的作用研究 |
| 5.4.1 DCF对肠道病理的影响 |
| 5.4.2 DCF对肠道微生物群落多样性的影响 |
| 5.4.3 DCF对肠道微生物群落结构的影响 |
| 5.5 克氏原螯虾肠道病理及菌群响应机制解析 |
| 5.6 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的论文及其它成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）“Cocktail”探针药物法评价人工牛黄对大鼠肝微粒体细胞色素P450不同亚型酶体内外代谢活性的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 1. 人工牛黄的研究进展 |
| 2. 药物相互作用的研究进展 |
| 3. 课题设计 |
| 第一章 “COCKTAIL”探针药物法评价人工牛黄对大鼠肝微粒体细胞色素P450不同亚型酶体外代谢活性的影响 |
| 一、同时测定大鼠肝微粒体中八种CYP450酶的底物代谢产物的LC-MS/MS方法的建立与验证 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 药品与试剂 |
| 1.2 仪器和设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 储备液及工作液的配制 |
| 2.1.1 代谢产物储备液及工作液的配制 |
| 2.1.2 探针底物储备液的配制 |
| 2.1.3 各抑制剂储备液及工作液的配制 |
| 2.1.4 内标储备液的配制 |
| 2.1.5 Tris-Hcl缓冲液(pH7.4)的配制 |
| 2.1.6 MgCl_2溶液的配制 |
| 2.2 肝微粒体酶体外孵育反应体系 |
| 2.3 样品预处理 |
| 2.4 分析条件 |
| 2.4.1 色谱条件 |
| 2.4.2 质谱条件 |
| 2.5 方法学考察 |
| 2.5.1 专属性考察 |
| 2.5.2 线性范围考察 |
| 2.5.3 精密度和准确度考察 |
| 2.5.4 基质效应考察 |
| 2.5.5 稳定性考察 |
| 2.5.6 阳性抑制剂对CYP450酶活性的抑制考察 |
| 3 结果 |
| 3.1 专属性 |
| 3.2 线性关系 |
| 3.3 精密度和准确度 |
| 3.4 基质效应 |
| 3.5 稳定性 |
| 3.6 抑制验证分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 色谱条件优化 |
| 4.2 内标物质的选择 |
| 4.3 酶亚型及底物的选择 |
| 4.4 肝微粒体样品预处理方法的选择 |
| 5 小结 |
| 二、“COCKTAIL”探针药物法评价人工牛黄对大鼠肝微粒体细胞色素P450不同亚型酶体外代谢活性的影响 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 药品与试剂 |
| 1.2 仪器和设备 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 溶液的配制 |
| 2.1.1 各探针底物储备液的配制 |
| 2.1.2 内标储备液的配制 |
| 2.1.3 人工牛黄提取液的制备 |
| 2.1.4 Tris-Hcl缓冲液(pH7.4)的配制 |
| 2.1.5 MgCl_2溶液的配制 |
| 2.2 孵育体系 |
| 2.3 人工牛黄对大鼠肝微粒体CYP450酶活性的影响 |
| 2.3.1 实验分组 |
| 2.3.2 孵育方法 |
| 2.4 统计学方法 |
| 3.结果 |
| 3.1 人工牛黄对大鼠肝微粒体细胞色素P450不同亚型酶活性的影响 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 第二章 “COCKTAIL”探针药物法评价人工牛黄对大鼠肝微粒体细胞色素P450不同亚型酶体内代谢活性的影响 |
| 一、同时测定大鼠血浆中八种CYP450酶的底物代谢产物的LC-MS/MS方法的建立与验证 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 药品与试剂 |
| 1.2 仪器和设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 溶液配制 |
| 2.2 血浆样品处理方法 |
| 2.3 分析条件 |
| 2.3.1 色谱条件 |
| 2.3.2 质谱条件 |
| 2.4 方法学考察 |
| 2.4.1 专属性考察 |
| 2.4.2 线性范围考察 |
| 2.4.3 精密度和准确度考察 |
| 2.4.4 基质效应考察 |
| 2.4.5 稳定性试验考察 |
| 3 结果 |
| 3.1 专属性 |
| 3.2 线性关系 |
| 3.3 精密度和准确度 |
| 3.4 基质效应 |
| 3.5 稳定性 |
| 4 讨论 |
| 4.1 流动相的选择 |
| 4.2 血浆样品前处理方法的选择 |
| 5 小结 |
| 二、“COCKTAIL”探针药物法评价人工牛黄对大鼠肝微粒体细胞色素P450不同亚型酶体内代谢活性的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 药品与试剂 |
| 1.2 仪器和设备 |
| 1.3 实验动物 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 探针底物混合溶液的配制 |
| 2.2 实验动物分组 |
| 2.3 给药剂量 |
| 2.3.1 探针底物的给药剂量 |
| 2.3.2 人工牛黄的给药剂量及给药方式 |
| 2.4 血浆样品的采集 |
| 2.5 样品处理与检测 |
| 2.6 统计学处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 人工牛黄对大鼠各代谢产物药代动力学参数的影响 |
| 3.1.1 对乙酰氨基酚 |
| 3.1.2 N-去乙基阿莫地喹 |
| 3.1.3 右啡烷 |
| 3.1.4 1-羟基咪达唑仑 |
| 3.1.5 羟化安非他酮 |
| 3.1.6 4-羟基美芬妥英 |
| 3.1.7 4-羟基甲苯磺丁脲 |
| 3.1.8 6-羟基氯唑沙宗 |
| 4 讨论 |
| 4.1 剂量的确定 |
| 4.1.1 人工牛黄给药剂量的确定 |
| 4.1.2 探针药物给药剂量及给药方式的选择 |
| 4.2 大鼠的选择 |
| 4.3 人工牛黄对大鼠CYP450不同亚型酶体内外代谢活性的影响 |
| 5 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 胞色素P450酶研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 攻读硕士学位期间成果 |
| 致谢 |
（9）赤芍总苷抗肝肿瘤药效物质分析及作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一章 赤芍本草考证及赤芍研究进展 |
| 第一节 赤芍本草考证 |
| 第二节 赤芍化学成分和药理作用的研究进展 |
| 第三节 赤芍总苷抗肝癌疗效研究 |
| 第二章 赤芍总苷的提取纯化及化学成分表征研究 |
| 第一节 赤芍总苷提取工艺研究 |
| 第二节 赤芍总苷纯化工艺研究 |
| 第三节 赤芍、赤芍总苷抗肝肿瘤作用比较研究 |
| 第四节 基于液质联用技术赤芍总苷化学成分表征研究 |
| 第五节 基于分子网络的赤芍总苷化学成分可视化分析 |
| 第六节 小结 |
| 第三章 赤芍总苷体内、外抗肝肿瘤药效学研究 |
| 第一节 赤芍总苷体外抗肝肿瘤作用研究 |
| 第二节 赤芍总苷体内抗肝肿瘤作用研究 |
| 第三节 赤芍总苷对H22荷瘤小鼠血清细胞因子的影响 |
| 第四节 小结 |
| 第四章 赤芍总苷作用机制初步研究 |
| 第一节 基于网络药理学的赤芍总苷抗肝癌分子机制研究 |
| 第二节 赤芍总苷对人肝癌细胞周期及细胞凋亡的影响 |
| 第三节 赤芍总苷介导PI3K/Akt信号通路抗肝肿瘤作用研究 |
| 第四节 赤芍总苷介导MEK/ERK信号通路抗肝肿瘤作用研究 |
| 第五节 小结 |
| 第五章 赤芍总苷对大鼠细胞色素P450酶的影响及肝毒性评价 |
| 第一节 细胞色素P450酶的研究概况 |
| 第二节 赤芍总苷对大鼠P450酶亚型的活性影响 |
| 第三节 赤芍总苷对大鼠P450酶亚型mRNA表达的影响 |
| 第四节 赤芍总苷对大鼠血清细胞因子的影响 |
| 第五节 小结 |
| 分析讨论 |
| 结论 |
| 创新性自我评价 |
| 参考文献 |
| 附录 综述 |
| 赤芍总苷药理作用的研究进展 |
| 中药抗肿瘤作用机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 在学期间科研成绩 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（10）八氢姜黄素立体异构体对药物代谢酶和肝损伤的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 文献研究 |
| 第一章 八氢姜黄素及其立体异构体的研究进展 |
| 一、八氢姜黄素立体异构体的化学结构和来源 |
| 二、八氢姜黄素的生物活性 |
| 第二章 手性化合物的立体选择性和拆分制备 |
| 第三章 对乙酰氨基酚诱导的急性肝损伤 |
| 一、APAP诱导的肝损伤的发病机制 |
| 二、APAP诱导的肝损伤的防治策略 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第一章 八氢姜黄素抗APAP诱导的急性肝损伤作用和研究 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验结果 |
| 三、小结 |
| 第二章 姜黄素大鼠体内代谢研究 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验结果 |
| 三、小结 |
| 第三章 八氢姜黄素立体异构体拆分制备和结构鉴定 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验结果 |
| 三、小结 |
| 第四章 八氢姜黄素立体异构体对L-02细胞药物代谢酶的作用研究 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验结果 |
| 三、小结 |
| 第五章 八氢姜黄素立体异构体在对乙酰氨基酚致肝损伤中的保护作用研究 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验结果 |
| 三、小结 |
| 结语 |
| 本文创新之处 |
| 不足之处及后续工作思路 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文和参与科研情况 |
| 致谢 |
| 附件 |
四、细胞色素P450酶在化学物质诱导肝脏癌变作用及研究现状（论文参考文献）
- [1]含氮消毒副产物的P450酶代谢与细胞毒性研究[D]. 陆雨晨. 浙江师范大学, 2021(02)
- [2]君迁子叶对N-亚硝胺形成与诱导癌变的抑制作用及机理[D]. 田艳花. 山西大学, 2021(01)
- [3]重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ的毒性评价及重楼皂苷Ⅰ的肝毒性机制探究[D]. 王文平. 北京中医药大学, 2021(02)
- [4]典型双酚类化合物在鸡蛋和蛋鸡体内代谢转化规律研究[D]. 肖志明. 中国农业科学院, 2021
- [5]Bacillus amyloliquefaciens YP6在降解有机磷农药中的作用及机理[D]. 孟迪. 江南大学, 2020(01)
- [6]Variovorax paradoxus S110细胞色素P450：CYP116B256v2的异源表达及催化特性研究[D]. 李晨星. 江南大学, 2020(01)
- [7]典型有毒污染物对克氏原螯虾的毒性效应与作用机制研究[D]. 张羽. 哈尔滨工业大学, 2020
- [8]“Cocktail”探针药物法评价人工牛黄对大鼠肝微粒体细胞色素P450不同亚型酶体内外代谢活性的影响[D]. 周文莉. 安徽中医药大学, 2020
- [9]赤芍总苷抗肝肿瘤药效物质分析及作用机制研究[D]. 范冰冰. 辽宁中医药大学, 2020(01)
- [10]八氢姜黄素立体异构体对药物代谢酶和肝损伤的作用研究[D]. 罗丹丹. 广州中医药大学, 2020(06)