本文主要研究内容
作者王新燕（2019）在《超分支扩增灵敏检测DNA甲基转移酶的方法研究》一文中研究指出：DNA甲基化是表观遗传学基因调控的主要形式,在细胞增殖、基因转录和衰老中起关键作用,已经在多种类型的癌症中发现了过度甲基化和低甲基化现象。DNA甲基转移酶(MTases)可催化S-腺苷-L-甲硫氨酸的甲基转移至靶序列的胞嘧啶/腺嘌呤。异常的DNA甲基化与DNA MTase活性的异常有关,因此DNA MTase有望成为抗癌/抗微生物药物的靶标物。然而,已报道的DNA MTase检测方法常常涉及费时费力的操作、昂贵的仪器和放射性标记的底物。在本文中,我们发展了一种简单、无需标记的荧光方法,利用末端转移酶(TdT)和核酸内切酶IV(Endo IV)催化启动超分支扩增,实现对DNA腺嘌呤甲基转移酶(Dam)的超灵敏检测。我们设计了一条3’末端进行了氨基修饰的具有发夹结构的DNA底物探针,该探针的茎部位是一段回文序列,可被Dam识别发生甲基化,进而被核酸内切酶Ⅰ(DpnI)特异性识别切割,得到三条单链DNA,其中两条单链DNA暴露出3’-OH末端,由此引发TdT和Endo IV催化启动的超分支扩增反应。以SYBR Gold为荧光指示剂,可实时检测DNA扩增产物的荧光信号。本论文的创新点在于(1)超分支扩增的引入导致荧光信号增强,提高了检测灵敏度。(2)对发夹探针和辅助探针的3’末端进行氨基修饰,有效防止TdT引发的非特异性扩增。(3)TdT对DNA中游离的3’-OH末端的高精确性识别以及Endo IV对双链DNA中完整的脱嘌呤/脱嘧啶(AP)位点的特异性识别水解,实现了零背景检测信号。该方法选择性好,检测灵敏度高,对纯Dam的检测限为0.003 U/mL,对大肠杆菌细胞中的内源性Dam检测限为9.61×10~-66 mg/mL。另外,该方法还可用于Dam抑制剂的筛选,在疾病诊断和药物开发中具有广泛的应用前景。
Abstract
DNAjia ji hua shi biao guan wei chuan xue ji yin diao kong de zhu yao xing shi ,zai xi bao zeng shi 、ji yin zhuai lu he cui lao zhong qi guan jian zuo yong ,yi jing zai duo chong lei xing de ai zheng zhong fa xian le guo du jia ji hua he di jia ji hua xian xiang 。DNAjia ji zhuai yi mei (MTases)ke cui hua S-xian gan -L-jia liu an suan de jia ji zhuai yi zhi ba xu lie de bao mi ding /xian piao ling 。yi chang de DNAjia ji hua yu DNA MTasehuo xing de yi chang you guan ,yin ci DNA MTaseyou wang cheng wei kang ai /kang wei sheng wu yao wu de ba biao wu 。ran er ,yi bao dao de DNA MTasejian ce fang fa chang chang she ji fei shi fei li de cao zuo 、ang gui de yi qi he fang she xing biao ji de de wu 。zai ben wen zhong ,wo men fa zhan le yi chong jian chan 、mo xu biao ji de ying guang fang fa ,li yong mo duan zhuai yi mei (TdT)he he suan nei qie mei IV(Endo IV)cui hua qi dong chao fen zhi kuo zeng ,shi xian dui DNAxian piao ling jia ji zhuai yi mei (Dam)de chao ling min jian ce 。wo men she ji le yi tiao 3’mo duan jin hang le an ji xiu shi de ju you fa ga jie gou de DNAde wu tan zhen ,gai tan zhen de jing bu wei shi yi duan hui wen xu lie ,ke bei Damshi bie fa sheng jia ji hua ,jin er bei he suan nei qie mei Ⅰ(DpnI)te yi xing shi bie qie ge ,de dao san tiao chan lian DNA,ji zhong liang tiao chan lian DNAbao lou chu 3’-OHmo duan ,you ci yin fa TdThe Endo IVcui hua qi dong de chao fen zhi kuo zeng fan ying 。yi SYBR Goldwei ying guang zhi shi ji ,ke shi shi jian ce DNAkuo zeng chan wu de ying guang xin hao 。ben lun wen de chuang xin dian zai yu (1)chao fen zhi kuo zeng de yin ru dao zhi ying guang xin hao zeng jiang ,di gao le jian ce ling min du 。(2)dui fa ga tan zhen he fu zhu tan zhen de 3’mo duan jin hang an ji xiu shi ,you xiao fang zhi TdTyin fa de fei te yi xing kuo zeng 。(3)TdTdui DNAzhong you li de 3’-OHmo duan de gao jing que xing shi bie yi ji Endo IVdui shuang lian DNAzhong wan zheng de tuo piao ling /tuo mi ding (AP)wei dian de te yi xing shi bie shui jie ,shi xian le ling bei jing jian ce xin hao 。gai fang fa shua ze xing hao ,jian ce ling min du gao ,dui chun Damde jian ce xian wei 0.003 U/mL,dui da chang gan jun xi bao zhong de nei yuan xing Damjian ce xian wei 9.61×10~-66 mg/mL。ling wai ,gai fang fa hai ke yong yu Damyi zhi ji de shai shua ,zai ji bing zhen duan he yao wu kai fa zhong ju you an fan de ying yong qian jing 。
论文参考文献
论文详细介绍
论文作者分别是来自山东师范大学的王新燕，发表于刊物山东师范大学2019-07-06论文，是一篇关于甲基转移酶论文,超分支扩增论文,实时荧光检测论文,零背景论文,山东师范大学2019-07-06论文的文章。本文可供学术参考使用，各位学者可以免费参考阅读下载，文章观点不代表本站观点，资料来自山东师范大学2019-07-06论文网站，若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权，请联系我们删除。
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