一、肾腺苷脱氨酶及其结合蛋白的纯化和性质研究（论文文献综述）
王文偲[1]（2021）在《RFTS区域突变诱导的DNMT1蛋白酶裂解驱动神经退行性疾病的产生》文中进行了进一步梳理细胞进行增殖时,除了需要将遗传物质DNA准确的传递给子细胞,还要将DNA甲基化谱式准确传承,这对于细胞命运和功能的维系至关重要。DNMT1是维持DNA甲基化谱式的关键酶。近年来发现HSAN1E（Hereditary Sensory and Autonomic Neuropathy type 1E）和 ADC A-DN（Autosomal Dominant Cerebellar Ataxia-Deafness and Narcolepsy）两种神经退行性疾病的病因是DNMT1的DNA复制位点靶向顺序（RFTS）结构域的点突变。然而,到目前为止,这些DNMT1 RFTS结构域的突变如何影响体内DNMT1功能并因此导致神经退行性疾病产生尚不清楚,因此我们构建了Dnmt1 RFTS点突变的小鼠,研究突变对DNMT1蛋白的影响及导致疾病产生的可能机制。我们通过基因编辑技术构建了的Dnmt1 Y500C（Dnmt1-M1）、P496Y（Dnmt1-M2）点突变小鼠（与HSAN1E患者中发现突变位点对应）和Dnmt1 C585R（Dnmt1-M6）点突变小鼠（与ADCA-DN患者中发现突变位点对应）。我们的研究表明,三种基因型的纯合突变小鼠在胚胎10.5天左右死亡,并表现出明显缺乏DNMT1蛋白,而杂合子则可以存活、可育并且在生长和外观上没有明显异常。DNA甲基化检测发现这些杂合子小鼠在各个组织中存在轻度DNA甲基化下降。行为学及神经干细胞研究表明杂合子小鼠具有神经退行性疾病表型,包括学习和记忆受损,神经干细胞的增殖和分化活性降低。对DNMT1蛋白的检测发现,在杂合子小鼠中,各组织的DNMT1蛋白水平只有野生型小鼠的一半左右。通过制备不同基因型的小鼠胚胎干细胞我们对突变如何影响DNMT1蛋白水平进行了深入研究,发现RFTS突变不影响Dnmt1基因的转录和mRNA水平,但显着降低突变体DNMT1蛋白的稳定性。我们发现DNMT1突变蛋白稳定性的下降不是由于突变蛋白对蛋白酶体降解的敏感性增加或者自噬降解的增强,而是由于突变的DNMT1蛋白在RFTS结构域内部受到特异蛋白酶的酶切。虽然这个特异蛋白酶还没有被鉴定,但我们发现该蛋白酶酶切所产生的N-端DNMT1片段特异定位到核仁并形成聚集体（foci）。为了研究DNMT1的RFTS突变是否在人类细胞中也诱导DNMT1的特异蛋白酶降解,我们通过单碱基编辑技术在HS683（人脑视神经胶质瘤细胞）中构建内源DNMT1 Y495C点突变的细胞系,发现该突变导致细胞增殖受损并同样出现DNMT1的核仁定位,说明在人和小鼠中突变DNMT1的致病机制具有一定的相似性。需要说明的是,我们通过单碱基编辑技术也在HeLa细胞中构建了DNMT1 Y495C点突变的细胞系,表明突变的DNMT1在没有被酶切的情况下,其蛋白稳定性、细胞定位以及酶活性与野生型DNMT1相比没有明显的改变。这些研究表明RFTS突变引起的DNMT1降解,而不是突变本身,是导致DNMT1突变体功能缺陷的原因,并且很可能导致HSAN1E和ADCA-DN患者的神经退行性疾病表型。综上所述,我们从生化和生理的层面上说明了 DNMT1的RFTS区域点突变造成HSAN1E疾病产生的机制,并对ADCA-DN的致病机制进行了初步的探索,这对临床上HSAN1E和ADCA-DN疾病的研究和治疗提供了新的重要信息。
周志斌[2]（2020）在《环状RNA CircCDH13对microRNA的调控在骨性关节炎中的作用及其机制研究》文中提出研究背景:骨性关节炎（Osteoarthritis,OA）是最常见的年龄相关性关节退行性疾病之一,以慢性关节炎症、关节软骨组织破坏、软骨下骨质硬化及骨赘逐渐生成为主要特征。OA早期症状以受累关节疼痛、僵硬,活动能力下降为主,晚期将导致关节功能丧失而致残,这不仅极大地影响着患者的身体健康及生活质量,还持续增加着家庭及社会的人力与财力负担。由此,OA的预防与治疗已经逐渐成为一项急需解决的医学难题。此外,当前OA的临床治疗方法有限,主要为对症治疗,缺乏有效的对因治疗手段,关节置换常常是终末期OA的唯一选择。因此,深入研究OA的病理过程,探索其确切的致病机理及调控机制,对于OA的防治具有重要的临床价值和社会意义。环状RNA（circular RNA,circ RNA）是一种新近发现的内源性RNA分子。与传统的线性RNA结构不同,circ RNA既没有5’端帽子,也没有3’端尾巴,其闭合的环状结构由序列通过共价键形成。Circ RNA主要由pre-m RNA通过可变剪接加工产生,具有表达丰富、组织特异性高及稳定性好等特点。研究表明,circ RNA具有强大的生物学功能,可在转录及转录后水平对基因表达进行调控。Circ RNA可以参与调控机体正常细胞生长发育、维持干细胞特性,也可以在心衰、椎间盘退变、肿瘤等多种疾病的发生发展过程中,发挥关键的调节作用。然而,虽然circ RNA在机体生理功能及多种疾病中的作用已被大量研究阐述,circ RNA参与OA疾病进程的相关报道国内外数量甚少,有待进一步研究。研究目的与方法:本研究运用芯片技术,检测了circ RNA在OA软骨组织和正常软骨组织中的表达情况。通过PCR、Sanger测序、Northern blot等方法,对Circ CDH13的差异表达情况及其环化特性进行了验证。采用体外干扰、过表达技术,在软骨细胞中进行了Circ CDH13的功能获得及缺失实验,以Annexin V-FITC流式细胞仪及TUNEL染色对软骨细胞凋亡进行检测,以Western blot、细胞免疫荧光对软骨细胞中MMP13、Col2a1、ADAMTS-5及Aggrecan的表达进行检测。通过生物信息学预测、RNA pulldown等方法,结合双荧光素酶报告基因实验预测并验证Circ CDH13与mi R-296-3p及mi R-296-3p与PTEN的靶向结合。利用腺相关病毒沉默小鼠体内Circ CDH13表达,通过番红-固绿染色、X线及micro-CT检测Circ CDH13沉默对DMM诱导的小鼠膝关节OA的作用,并以Western blot、免疫组化检测MMP13、Col2a1、ADAMTS-5及Aggrecan的表达情况。研究结果:我们的研究发现,相比正常软骨组织,人OA软骨组织中存在大量circ RNA差异表达,其中,Circ CDH13在OA软骨组织及IL-1β诱导的OA体外细胞模型中表达量均显着增高。Sanger测序结果显示Circ CDH13的反向剪接位点附近序列与Circ Base数据库一致,Northern blot结果证实Circ CDH13在c DNA中可被双向引物扩增,同时PCR结果表明Circ CDH13可以抵抗RNase R酶的消化。通过RNA干扰及过表达技术,以IL-1β建立OA体外模型,在体外研究Circ CDH13对OA中软骨细胞的作用。结果显示,Circ CDH13体外干扰时,相比IL-1β刺激组,si RNA转染组软骨细胞凋亡率显着降低,软骨细胞细胞外基质Col2a1、Aggrecan表达量显着增加,基质降解酶MMP13、ADAMTS-5表达量显着减少;而Circ CDH13体外过表达时,软骨细胞凋亡率显着增加,Col2a1、Aggrecan合成减少,MMP13、ADAMTS-5分泌增多。细胞“核质”分离实验显示,Circ CDH13主要定位于软骨细胞细胞质中。mi Randa与Target Scan数据库预测及Circ CDH13 pulldown检测发现mi R-296-3p是Circ CDH13的靶向mi RNA。双荧光素酶报告基因实验结果显示,相比对照组,与mi R-296-3共转染后,Circ CDH13-wt组荧光检测强度显着下降,而Circ CDH13-mut组荧光检测强度变化无统计学差异,表明mi R-296-3p可直接与Circ CDH13靶向结合。PCR检测发现,mi R-296-3p在OA软骨组织中显着低表达。功能实验结果进一步表明,mi R-296-3p体外过表达可显着抑制IL-1β及Circ CDH13诱导的软骨细胞凋亡,Col2a1、Aggrecan降解及MMP13、ADAMTS-5合成。Target Scan数据库预测PTEN为mi R-296-3p下游靶基因,双荧光素酶报告基因实验发现,与mi R-296-3p共转染后,相比对照组,PTEN 3’UTR wt组荧光检测强度显着降低,而PTEN 3’UTR mut组荧光检测强度变化无统计学差异,表明mi R-296-3p可直接与PTEN靶向结合。Western blot结果显示,PTEN在OA中显着高表达。PTEN功能实验显示,PTEN过表达显着上调软骨细胞凋亡率,同时显着降低Col2a1、Aggrecan表达,升高MMP13、ADAMTS-5表达。功能实验结果进一步表明,在软骨细胞中,mi R-296-3p可以通过对PTEN表达的负向调控,显着抑制PTEN诱导的软骨细胞凋亡、Col2a1、Aggrecan的降解及MMP13、ADAMTS-5的合成。研究还发现,Circ CDH13在小鼠中存在同源的circ RNA（mmu＿circ＿0014630）,人鼠来源的Circ CDH13（hsa＿circ＿0040646与mmu＿circ＿0014630）序列同源性达89%。构建Circ CDH13腺相关病毒沉默载体,小鼠关节腔内注射治疗8周后,结果显示,相比DMM组,小鼠体内Circ CDH13沉默组小鼠膝关节软骨破坏减轻,骨赘生成减少,同时软骨细胞细胞外基质Col2a1、Aggrecan合成增加,基质降解酶MMP13、ADAMTS-5分泌减少。结论:综上所述,本研究通过体内外实验,发现OA软骨组织中存在大量circ RNA差异表达,其中Circ CDH13在OA软骨组织及OA体外细胞模型中表达量均显着增高。功能上,高表达的Circ CDH13主要通过诱导软骨细胞凋亡,促进软骨细胞细胞外基质降解及其降解酶的合成,进而促进OA的发生发展。机制上,定位于软骨细胞细胞质中的Circ CDH13可以作为mi R-296-3p海绵,通过与mi R-296-3p靶向结合,解除mi R-296-3p对其下游靶基因PTEN表达的抑制,参与OA进程的调控。Circ CDH13在人与小鼠中高度同源,体内沉默小鼠Circ CDH13后,可减少DMM诱导的小鼠膝关节软骨破坏,骨赘生成,以及软骨细胞细胞外基质降解及其降解酶的分泌,有效地缓解了DMM诱导的小鼠膝关节骨性关节炎的进展。
曹晓娜[3]（2018）在《与Tudor-SN蛋白结合的RNA潜在功能分析及调控方式探讨》文中指出目的:多功能蛋白Tudor-SN是RNA结合蛋白,可参与细胞应激,发挥对mRNA的保护作用,并且可以通过形成RISC复合物参与RNA干扰等过程。可见Tudor-SN与RNA之间存在密切的联系。课题组已经利用Tudor-SN进行了Pulldown-on-chip mRNAs实验。本课题旨在进一步对Tudor-SN所结合的RNA进行功能分析以及调控机制的探讨。方法:本课题分为三大部分第一部分:对Tudor-SN Pulldown-on-chip mRNAs的结果进行生物信息学分析,并对结合结果进行验证。利用DAVID在线分析网络平台,对钓取的RNA结果进行GO分析和KEGG信号通路分析。在HeLa细胞中,采用RIP技术验证Tudor-SN与RNA的结果情况。第二部分:对Flag-Tudor-SN钓取蛋白的质谱结果进行生物信息学分析并进行结合验证。利用DAVID在线分析网络平台,对钓取的蛋白进行GO分析和KEGG信号通路分析。在HeLa细胞中,采用co-IP和GST pull down技术验证Tudor-SN与蛋白的结果情况。第三部分:研究Tudor-SN对其结合RNA和蛋白的调控作用。（1）Tudor-SN对其结合RNA核质分布的影响。在正常状态下,在HeLa WT和HeLa Tudor-SN-/-（以下简称为HeLa KO）细胞中分离胞核胞质RNA,RT-PCR检测RNA在细胞中的分布变化。（2）研究Tudor-SN对其结合RNA稳定性的影响。应用RNA合成抑制剂放线菌素D分别处理HeLa WT和HeLa KO细胞,RT-PCR检测该RNA在3小时,6小时,9小时,12小时等不同时间点的降解变化。（3）在应激状态下,Tudor-SN结合的三种应激颗粒蛋白较正常状态下核质分布的改变。在IPZ（转运受体importin-β小分子抑制剂）的作用下,三种应激颗粒蛋白核质分布的改变。在HeLa WT细胞中采用RNA干扰技术,敲低IPO5（入核转运受体）观察应激颗粒蛋白核质分布的改变。结果:1.生物信息学分析结果显示,Tudor-SN结合的mRNA主要参与的生物学过程包括翻译过程、RNA加工相关、细胞粘附、蛋白折叠、Wnt信号通路、细胞分类周期泛素化蛋白连接酶活性、T细胞受体信号通路、mRNA稳定性调控、抗原加工、NIK/NF-kappaB、DNA损伤应答、蛋白酶体泛素依赖的蛋白代谢调控、脂肪酸合成、ATP合成的分类。KEGG通路分析显示Tudor-SN结合的mRNA主要参与核糖体、代谢通路、氧化磷酸化、蛋白酶体、RNA转运、萜类化合物生物合、溶酶体等,并且参与到帕金森氏综合症、阿尔茨海默病、亨廷顿氏舞蹈病等相关疾病的信号通路中。对于Tudor-SN钓取的结果,在HeLa细胞中通过RIP实验进行了部分验证。2.生物信息学分析结果显示,Tudor-SN结合的蛋白主要参与的生物学过程包括poly（A）RNA结合,ATP结合,RNA解旋酶活性,ATP依赖性RNA解旋酶活性,双链RNA结合,蛋白质结合,解旋酶活性,泛素蛋白连接酶结合,钙粘蛋白结合参与细胞间粘附等。在内源和外源的IP结合实验和GST-puldown实验中,验证了核转运受体和与mRNA稳定性相关蛋白与Tudor-SN的结合。3.正常状态下,Tudor-SN对所结合的mRNA的核质分布的影响并不明显。在HeLa WT和HeLa KO中,加入RNA合成抑制剂放线菌素D。结果显示在HeLa WT细胞中,与Tudor-SN结合的mRNA的降解速率在加药后3小时,6小时,9小时,12小时的测量点均低于其在HeLa KO细胞中百分比值。4.应激状态下,三种应激颗粒蛋白hnRNP A1、HuR、TIA1细胞核强信号的细胞比例均比正常状态下降,细胞质强信号的细胞比例则升高。在应激状态下,hnRNP A1蛋白在IPZ（转运受体importin-β的小分子抑制剂）的作用下,细胞核强信号下降,细胞质强信号升高。将IPO5（入核转运受体）蛋白在HeLa细胞中进行敲除后,hnRNP A1蛋白的核质分布变化与加入IPZ相似。结论:1.将Tudor-SN结合RNA的数据,利用DAVID在线分析网络平台,得出GO分析结果:9类分子功能,28类生物学过程和25类细胞组分。KEGG信号通路分析,得出RNA主要参与了12类不同的信号通路。对于Tudor-SN钓取的结果,通过RIP实验进行了部分验证。2.将Tudor SN结合蛋白的数据,利用DAVID在线分析网络平台,得到GO分析结果:9类分子功能,72类生物学过程和14类细胞组分。KEGG信号通路分析,得出集合蛋白主要参与了2类不同的信号通路。在内源和外源的IP结合实验和GST-puldown实验中,验证了核转运受体和与mRNA稳定性相关蛋白与Tudor-SN的结合。3.在正常状态下,Tudor-SN对所结合的mRNA的核质分布的影响并不明显,可以维持所结合的mRNA的稳定性。4.在应激状态下,Tudor-SN与应激颗粒蛋白形成复合物,可能以应激颗粒的形式参与importin-β受体介导的对所结合mRNA的核质转运和应激保护。
王荣[4]（2013）在《诱导多功能干细胞（iPS）对小鼠下肢缺血再灌注损伤的保护作用研究》文中指出诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells,i PS cells）是一种新型干细胞,系经转入4个特定的转录因子（Oct 3/4,Sox2,Klf4、c-Myc）到小鼠或人的体细胞,诱导其重编程为未分化的多能细胞。它可分化成内皮细胞、平滑肌细胞和外膜细胞,通过移植hi PSCs衍生的这些细胞可以促进血管和肌肉的再生。针对局部缺血损伤,i PS细胞发挥其作用依赖于其定向富集于损伤部位。目的:本工作拟在i PS细胞,研究mi NA对i PS细胞的迁移、黏附影响;建立小鼠急性下肢缺血再灌注损伤缺血模型,观察i PS细胞是否对下肢缺血再灌注损伤有保护作用。方法:我们在成功制备出诱导多功能干细胞的前提下进行研究。首先体外研究:向i PS细胞转染consi RNA和mi RNA217观察转染后的i PS细胞迁移粘附的情况。体外:以C57BL/6J,8-10周龄雄性小鼠,制作小鼠下肢缺血再灌注损伤模型,右下肢作为对照组,分别在术后当天和第二天从尾静脉注射pbs、ips、mef（胚胎成纤维细胞）、controlsi RNA+ips、mi RNA-217+ips 6?104个/只/次/200ul.。细胞事先用红色荧光染料处理,观察72h后取材。结果:1、参照Yamanaka方法成功制备出诱导性多功能干细胞。2、给予mi RNA-217刺激i PS细胞后,对i PS细胞的迁移能力无明显影响。3、在急性小鼠缺血再灌注损伤模型,观察到ips形态呈梭形,ips细胞可以归巢到缺血/再灌注损伤的股动脉血管内膜。4、缺血再灌注损伤小鼠尾静脉注射ips细胞或MEF后28天,小鼠组织器官均无肉眼可见的肿瘤发生。5、尾静脉注射i PS细胞组较PBS和MEF组下肢缺血损伤侧肢体的血流灌注明显改善（*P<0.05）,而经Lipo2000和mi RNA-217预处理的i PS组较单独注射i PSCs组的治疗效果明显下降（*P<0.05）。6、在损伤的后肢组织HE染色显示:i PS细胞组肌细胞核数量明显多于MEF、PBS、con-si RNA+i PS和mir RNA-217组,后4组的细胞数量、形态无明显差异（n=9）。7.Di I（呈红色荧光）标记的i PS细胞的定位显示,i PS组较consi RNA+i PS组和mi RNA-217+i PS 2组小鼠损伤组织中阳性细胞数明显多（P<0.05）。8.CD31免疫荧光化学方法检后肢缺血再灌注损伤部位小鼠肌肉组织血管的改变情况:阳性计数在PBS、MEF、i PS、con-si RNA+i PS、mi RNA217+i PS5组间比较无统计学差异。9.实时PCR检测显示:注射i PS和con-si RNA-i PS组在各个基因中的变化趋势一致。在i PS、con-si RNA-i PS、mi R-217-i PS 3个组的IL-1βm RNA表达水平比PBS（1±0.24）和MEF（0.86±0.4）明显升高,有统计学差异。IL-2m RNA在i PS组的表达明显高于其余4组。TNF-α和MCP-1基因在i PS组表达水平最低,与其余4组比较均有统计学差异。IGF-1表达水平在i PS、con-si RNA-i PS,mi R-217-i PS 3个组中的表达水平均较PBS和MEF组高（P<0.05）。其余基因在各组之间比较无统计学差异。10、Teto定量:IPS细胞组的总DNA中Teto含量最高,与PBS组和MEF组比,i PS细胞组和mi RNA217+i PS细胞组有显着性差异（*P<0.05）;与其他细胞组相比,IPS细胞组Teto含量明显多（*P<0.05）。结论:i PS细胞可定向归巢到缺血/再灌注损伤部位,本实验剂量6?104个/只/次/200ul下无成瘤性,但能减小炎症梗死面积并改善血流恢复和下肢功能,i PS细胞对后肢缺血再灌注损伤治疗中具有靶向治疗和保护作用。mi RNA-217减轻i PS细胞的粘附,减弱i PS对后肢缺血再灌注损伤的的治疗作用。
赵虹[5]（2012）在《探讨调控人SND1蛋白表达的分子机制》文中认为研究目的：人SND1蛋白被发现是一种潜在的多功能蛋白,目前已证实其在基因转录、RNA干扰、细胞应激、脂肪代谢等多个生物活动中发挥重要作用。因此,SND1蛋白表达异常势必对其生物功能的发挥产生不同的影响,而目前人们对调控SND1蛋白表达的机制却知之甚少。任何一种蛋白质的表达都需要经过转录起始、pre-mRNA的转录、转录后修饰、蛋白翻译、翻译后修饰等众多精细复杂而协调有序的调控过程。本文旨在从基因转录起始水平探讨调控人SND1蛋白表达的分子机制,并从mRNA和蛋白水平初步探讨调控其表达的分子机制,进而深入了解其表达如何影响生理或病理过程的分子机制。方法：本课题分三部分进行,第一部分：利用生物信息学数据库和软件对SND1基因特点进行预测与分析,推测SND1基因启动子的核心区域及参与调控SND1基因转录起始的关键转录因子。第二部分：结合生物信息学分析结果,构建包含SND1基因启动子的虫荧光素酶质粒,通过虫荧光素酶活性检测法和染色质免疫沉淀技术对其启动子活性及转录因子的作用进行检测和验证。第三部分：通过RNA核酸印迹实验明确SND1的mRNA水平上是否存在多种转录本,其可能翻译后形成SND1蛋白的亚型。通过GST融合蛋白钓取法检测SND1蛋白在体外能否与自身结合形成二聚体或者多聚体,该结构可能参与蛋白本身转运、储存、降解等生物过程。结果：①分析出人SND1基因的启动子特点：其启动子序列中缺乏典型的TATA盒结构,含有3个CAAT序列和多个GC盒。CpG岛位于-650～-+295区域内（以转录起始位点为+1,上游为正,下游为负）。②成功构建人SND1核心启动子及其截短片段的虫荧光素酶质粒,即,SND1（-493/+14）-luc和SND1（-863/-493）-luc.③转录因子Sp1和stat6都能增加SND1（-863/+14）-luc质粒的虫荧光素酶活性,其中Sp1对其表达的调控作用很强,而stat6对其表达的调控作用较弱,都存在剂量依赖性。④转录因子Spl.stat6和NF-Y在体内均能与人SND1启动子结合。⑤TGF-β信号传导通路可能通过Spl参与调控人SND1的表达,IL-4/stat6信号传导通路不参与调控人SND1的表达。⑥正常和应激状态下,HeLa细胞和MD-MB-231细胞中人SND1的mRNA都只检测到一个转录本。⑦人SND1蛋白通过SN结构域在体外与其自身蛋白结合,而TD和TSN结构域在体外不能与其自身蛋白结合。⑧人SND1蛋白的SNl,SN2,SN3和SN4各个单独的结构域均能在体外与其自身蛋白结合,SN3的结合能力最强,SN1的结合能力最弱。结论：①人SND1基因的启动子序列中缺乏典型的TATA盒结构,含有3个CAAT序列和多个GC盒。CpG岛位于-650～+295区域内（以转录起始位点为+1,上游为正,下游为负）。②转录因子Sp1、stat6和NF-Y参与调控人SND1基因的转录,Sp1可能通过TGF-β信号传导通路在调控过程中发挥重要作用。③正常和应激状态下细胞SND1的mRNA仅有一个转录本,不存在多个剪切状态。④人SND1蛋白在体外通过SN结构域与自身蛋白结合形成二聚体或者多聚体。
廖青[6]（2012）在《重组大鼠肾上腺髓质素质粒对力竭运动大鼠心脏缺氧的保护作用的研究》文中研究说明目的：通过与真核表达载体pVAX1的重组,构建大鼠肾上腺髓质素真核表达质粒（pVAX1-ADM）。采取肌肉注射法将不同剂量的重组质粒导入大鼠后肢腓肠肌内,建立大鼠力竭缺氧模型,研究重组大鼠肾上腺髓质素质粒对力竭运动大鼠心脏缺氧的保护作用。方法：1.构建重组大鼠肾上腺髓质素质粒（pVAX1-ADM）:提取SD雄性大鼠肾上腺组织总RNA,通过RT-PCR逆转录法获得ADM基因的cDNA,进一步扩增cDNA模板并克隆至PMD-18T载体,将克隆产物亚克隆至真核表达载体pVAX1上最终获得重组产物pVAX1-ADM。采取碱性裂解法和聚乙二醇法反复大量提取足够浓度及纯度的重组质粒。2.雄性SD大鼠18只,体重（203±18.4）g,根据体重完全随机分为3组,6只／组,分别为正常对照组、空载体组和pVAX1-ADM700μ g/kg组。3组大鼠分别注射生理盐水1ml、pVAX1质粒DNA生理盐水溶液1ml和700μg/kg剂量pVAX1-ADM生理盐水溶液1ml,1次／周,共注射4周。模型建立完成后,通过免疫组织化学方法对所取大鼠心肌组织进行重组质粒pVAX1-ADM的表达情况进行检测。3.不同剂量pVAX1-ADM对力竭大鼠心脏的保护作用：雄性SD大鼠48只,体重（223.24±23.77） g,按体重随机分为6组,8只／组,分别为正常对照组（C组）、力竭对照组（Ex组）、还原型谷胱甘肽阳性药物组（G组）,pVAX1-ADM700μ g/kg剂量组（P1组）、pVAX1-ADM1100μ g/kg剂量组（P2组）、pVAX1-ADM1400μ g/kg剂量组（P3组）。除正常对照组外,其余5组根据大鼠力竭心脏缺氧模型进行一次力竭性运动。每周给C组、Ex组注射生理盐水1ml,G组注射还原型谷胱甘肽（GSH）0.125g/ml生理盐水溶液1ml,P1、P2、P3组分别注射pVAX1-ADM700μ g/kg、1100μg/kg和1400μ g/kg生理盐水溶液1ml。第四周大鼠运动至完全力竭后,取大鼠心肌组织测定组织中CK、LDH、MDA及SOD的水平,并对心肌组织作组织形态学观察,同时收集大鼠血液作血浆粘度、红细胞聚集指数、红变形指数等血流变指数检测。结果：1.通过与Genebank中所查询的ADM基因序列比较,证实所构建重组质粒DNA序列与之完全一致。同时,经过Xba I与HindⅢ双酶切鉴定,结果为阳性。通过紫外分光光度法测定经大量提取纯化后的重组质粒的纯度为：OD260=0.924,OD280=0.505,OD260/OD280=1.828,浓度为4.63mg/ml。2.通过对大鼠腓肠肌组织的组织形态学切片观察,结果显示正常对照组、空载体组心肌组织ADM表达量较低,而pVAXl-ADM700μ g/kg组表达量较高。3.大鼠心肌组织的MDA、T-SOD、CK和LDH的最终检测结果显示,相对于Ex组,P1组、P2组、P3组和G组的CK、LDH和MDA含量均明显降低（P＜0.05）,指标结果具有显着性差异（P＜0.05）,有统计学意义；T-SOD含量明显增加（P＜0.05）,指标结果具有显着性差异（P＜0.05）,有统计学意义。组织形态学检测表明与C组相比较,Ex组心肌组织结构损坏严重,炎性细胞聚集,水肿明显。相较于Ex组,P1组、P2组、P3组和G组心肌组织结构损伤情况均得到明显减缓,组织水肿情况有所减轻。大鼠血液血流变检测结果显示,P1组、P2组、P3组和G组的全血高切粘度、全血低切粘度、血浆粘度、红细胞聚集指数和红细胞变形指数都比Ex组有明显降低（P＜0.05）,指标结果之间的差异具有统计学意义；红细胞压积较Ex组的有明显升高（P＜0.05）,差异具有统计学意义。结论：1.成功构建大鼠pVAXl-ADM重组质粒,通过大量提取纯化所获质粒DNA的纯度及浓度均符合后续实验要求。2.700μ g/kg重组质粒导入大鼠腓肠肌后能使大鼠腓肠肌组织中的ADM表达量上调,以上表明重组大鼠肾上腺髓质素真核表达质粒构建成功,可在大鼠体内正常摄入并表达。3.700μ g/kg、1100μ g/kg、1400μ g/kgpVAXl-ADM和阳性药物GSH导入后都可提高力竭性运动大鼠心肌组织的SOD活力,降低MDA含量,降低心肌组织内CK活力和LDH含量,改善血流状况,对力竭性运动大鼠的心脏有保护作用且具有一定剂量效应,其中以1400μg/kg pVAXl-ADM的效果最好。
陈新焕[7]（2011）在《人核糖核苷酸还原酶的质子电子偶联传递通路研究》文中进行了进一步梳理核糖核苷酸还原酶（RR）存在于所有的生物细胞中,其功能是将核糖核苷酸（NDPs）还原为脱氧核糖核苷酸（dNDPs）,是DNA合成限速酶,其活性直接影响细胞增殖及肿瘤发生发展,是抗肿瘤药物的重要靶标分子。RR结构和功能研究为阐明其酶活性机制和研发靶向抗肿瘤药物提供理论和实验依据。根据金属辅助因子不同,RR可分为三类,而基于序列同源性和别构调节机制,第Ⅰ类又可进一步分为la, Ib, and Ic三个亚类,人、鼠和大肠杆菌等的RR属于Ia亚类。目前对Ia RR结构和功能的研究主要是以大肠杆菌为模板,其中经典模型认为它是两个R1大亚基和两个R2小亚基组成的异四聚体。在大肠杆菌RR,存在着一条双向的质子电子偶联传递通路,由R2上的·Tyrl22→Trp48→Tyr356和R1上的Tyr731→Tyr730→·Cys439组成,能够将自由基从R2上的·Tyrl22传递到35?距离之外的R1的·Cys439上,为RR酶催化活性所必需。在R2参与电子传递的具有氧化还原活性的氨基酸残基附近需要一个质子传递媒介,从而实现长距离电子传递与短距离的质子传递相偶联。R2的Tyr356位于大、小亚基之间,Trp48与Tyr356以及R1之间的质子电子偶联传递机制长期以来尚未阐明。本课题以人RR小亚基M2（hRRM2）为研究模型,试图找出Trp102（对应大肠杆菌Trp48）和Tyr369（对应大肠杆菌Tyr356）之间参与质子电子偶联传递的重要氨基酸位点。首先我们构建了野生型和突变型hRRM2表达质粒,通过原核表达和纯化得到hRRM2蛋白,筛选获得晶体,经x线衍射解析得到hRRM2的晶体结构（PDB:30LJ;分辨率2.1?）。然后,根据我们解析的hRRM2晶体结构,将Trp102周围5?内的6个氨基酸全部突变成丙氨酸。酶活性分析结果显示,只有hRRM2突变体E106A的酶活性完全丧失。为了进一步证明Elu106的重要性,我们将hRRM2的Elu106进行多种类型突变,结果显示只有hRRM2突变体E106D具有10%的酶活性,而其余hRRM2突变体,如E106Q、E106A、E106R、E106K.E106L和E106Y的酶催化活性都完全丧失,进一步证实了hRRM2的Elu106位点在RR酶催化中是必需的。表面等离子体共振（SPR）研究结果显示,hRRM2突变体E106D和E106Q不影响hRRMl和hRRM2的结合；x线衍射晶体结构分析显示,hRRM2突变体E106A、E106D和E106Q与野生型hRRM2的结构差别微小,排除Elu106突变通过影响蛋白空间构象而影响酶的催化活性；电子顺磁共振（EPR）检测显示,hRRM2突变体E106A、E106D和E106Q也能形成双铁-酪氨酰自由基中心,并且强度与野生型蛋白一致,表明Elu106不参与酪氨酰自由基的形成。应用RR自杀性抑制剂2-叠氮-2-脱氧-胞苷二磷酸（CzDP）实验证实,hRRM2突变体E106A和E106Q中自由基传递通路是阻断的,而hRRM2突变体E106D具有部分自由基传递的功能。基于蛋白晶体结构,构建hRRM1和hRRM2全酶模型并进行动力学分析和理论计算表明,hRRM2的Elu106为hRR质子电子偶联传递通路关键位点,其机制是作为hRRM2的Tyr369的质子传递媒介参与酶活性必需的自由基传递。以上研究首次发现Elu106是一个新的RR酶活性关键位点,其机制是作为hRRM2质子电子偶联传递通路中的质子受体／供体而为酶活性所必需。同时,基于蛋白晶体结构,首次提出人RR的全酶结构模型。这些结果对于进一步阐明RR酶分子的质子电子偶联传递机制具有重要意义,并为设计新的抗肿瘤药物提供了RR结构和功能相关的重要实验依据。
刘智慧[8]（2004）在《寡肽（OGP、HIV-1 tat～[47-57]）的合成、聚合及功能研究以及NRSF/REST在转录调控方面的研究》文中指出本论文由两部分组成,第一部分是成骨生长肽（Osteogenic Growth Peptide,OGP）和 HIV-1 tat[47-57]的合成、聚合及功能研究;第二部分是神经细胞限制性沉 默 因 子 （ Neuron restrictive silencer factor/repressor element-1 silencingtranscription factor,NRSF/REST）在转录调控方面的研究。 第一部分第一章阐述了 OGP 的合成及在造血方面与人重组粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF）的协同作用。OGP 体外促进成骨细胞 MC3T3 E1 和成纤维细胞 NIH 3T3 增殖,提高碱性磷酸酶活性,促进基质矿化;体内能够促进成骨和造血。OGP 可以增加正常小鼠外周血白细胞和骨髓细胞数,提高放射性损伤小鼠骨髓移植后的存活率;环磷酰胺造成的小鼠骨髓损伤给予OGP（10-15）（ OGP的 C 端 5 肽）,可以加快小鼠外周血白细胞的恢复,并可以动员小鼠外周血干祖细胞。本论文工作发现 OGP 能显着地协同 rhG-CSF 促进小鼠外周血白细胞数和淋巴细胞数增加,说明 OGP 是一种可以增强目前临床上广泛使用的 rhG-CSF功能的新的因子,是一种潜在的具有开发前景的新药。 免疫分析法是追踪生理活性多肽特性的一个必要工具。为了研究 OGP 的特性,本论文第一部分第二章阐述了 OGP 的聚合、通过 OGP 聚合物制备其特异性的抗体以及对 OGP 的免疫分析。含有分支或侧链的大分子化合物（polyvalent dendrimers）,在免疫、抗病毒、作为 DNA 和药物的载体等方面有所应用。而被应用的含有多肽分支或侧链的化合物（peptide dendrimers）主要有两种类型:一种是以多价化合物如多聚赖氨酸（pLL）为核心结构,通过表面的分支单位偶联多条多肽链;另一种是多重抗原肽（MAP）系统,它只有分支单位和偶联在上面的多肽链,没有核心结构。本章阐述了一种简单的方法制备多肽聚合物（多聚分支肽）:将含有双键的丙烯酰基偶联到多肽的 α-或 ε-氨基,通过自由基引发得到多聚分支肽。对于无侧链氨基的人胰岛素原 C 肽,含有侧链氨 1<WP=3>基的 OGP,含有侧链氨基并且含有很多疏水性氨基酸的 penetratin,我们采用了不同的策略制备并得到了相应的多聚分支肽（poly-C peptide, poly-OGP,poly-penetratin）。用 poly-C peptide,poly-OGP 来免疫新西兰大白兔能够得到相应的抗体,并且能够应用于免疫分析。 有文章报道 peptide dendrimers 可以用于转基因研究,所以我们尝试将多聚分支肽作为质粒 DNA 的载体。第一部分第三章阐述了多聚分支 HIV-1 tat[47-57]的制备及其在转基因方面的研究。通过 Sephadex G 150 我们对多聚分支 tat（poly-tat）进行了分离纯化,结果发现不同大小的聚合物都能够用作质粒 DNA运输的载体,转染效率和细胞毒性与聚合产物的大小具有相关性。 第二部分阐述了 NRSF/REST 被下调后细胞的基因表达变化以及细胞分化。NRSF/REST 是一种基因转录的负调控因子,在非神经类细胞中高表达,关闭了神经类基因;在神经细胞中表达下降,相应的受其负调控的神经基因开放,暗示 NRSF/REST 在胚胎发育中神经组织的发育,神经祖细胞分化起着重要作用。本论文通过 SiRNA 下调 NRSF,通过 microarray 高通量地检测基因表达的变化,并用 Real-time PCR 进行验证,发现了新的受到 NRSF/REST 调控的基因。结合生物信息学,发现一些基因中含有 NRSF/REST 特异结合序列,即 NRSE 元件。神经细胞特异性表达基因 Synapsin I 在非神经细胞中表达说明,NRSF/REST 对非神经细胞向神经细胞的分化具有重要意义。用 RNAi 联合 microarray 来进行转录调控的研究,为寻找转录因子新的靶基因提供了更加直接,有效和便利的工具。
张玮[9]（2003）在《复方鳖甲软肝方药物血清对大鼠离体肝星形细胞作用机理研究》文中研究表明肝纤维化是诸多慢性肝病的基础病理改变。肝纤维化的机制为细胞外基质（extracelluar matrix，ECM）的合成与降解失衡，导致ECM过度沉积所致。肝纤维化进一步发展即肝硬化。此时，肝的正常组织结构已被破坏，进一步发展，肝中央静脉周围和汇管区出现小叶间隔，形成假小叶，即可出现肝功能障碍。因此，积极防治肝纤维化的发生，无论从延缓或阻断肝硬化的形成，还是逆转肝纤维化病理进程，均具有十分重要的意义。近年来，大量资料表明，肝星形细胞（hepatocyte stellate cells ，HSC）是肝脏主要产生ECM的细胞，也是各种病因导致肝纤维化发生的共同中心环节。HSC活化是产生胶原的关键环节。HSC活化后，可出现细胞性状和细胞功能的改变。最突出的表现为ECM的合成与降解的失衡。HSC的活化可分为活化启动和活化持续两个阶段。HSC的活化依靠于细胞内信号转导的同时，还与核转录因子的调节密切相关。目前以HSC为靶向治疗肝纤维化的主要措施包括：①去除病因，减轻肝脏炎症，间接抑制HSC的活化；②选择性阻止HSC合成ECM；③促进HSC对ECM的降解④促进过剩的HSC凋亡，减少其数量。目前，西医对肝纤维化的治疗主要集中在防止肝损伤、抗炎、干预细胞内信号转导通路、拮抗促纤维化细胞因子作用、抑制胶原合成（转录水平或翻译水平）、促进胶原降解和促进HSC凋亡等多个方面。中医药对肝纤维化的治疗通常采用是活血化瘀、益气养阴、软肝散结、清热利湿和调理肝脾等治则。本实验采取的复方鳖甲软肝方由鳖甲、党参等十一味中药组成。其功能为：扶正祛邪，活血化瘀。扶正：党参健脾益气，紫河车益肾填精。驱邪：板蓝根清热解毒。活血化瘀：鳖甲，入肝、肾经，既可软坚散结，又可滋阴潜阳。当归养血活血，莪术行气祛瘀。其临床有效率达81.67%，治愈率达55.23%。本方系国家级中药新药（批准文号：国药准字1999，2-102号）已上市。本研究拟采用复方鳖甲软肝方药物血清对大鼠离体肝星形细胞作用机理开展实验研究。目的在于进一步深入了解复方鳖甲软肝方药物血清对HSC的增殖，活化以及对ECM降解和合成的影响。此外，本研究还从活化的HSC细胞内信号转导及核转录因子方面探讨复方鳖甲软肝方对HSC活化所产生的影响。<WP=4>1.复方鳖甲软肝方药物血清对HSC增殖影响的实验研究本实验从离体的角度观察复方鳖甲软肝方药物血清对肝星形细胞（HSC）增殖的影响，以探讨其抗肝纤维化的作用机制。研究表明，肝纤维化是一种常见的慢性进行性肝病，肝星形细胞的活化增殖以及细胞外基质（ECM）的沉积是肝纤维化的两个重要环节。肝星形细胞的大量增殖，可以合成过多的胶原、蛋白多糖等ECM成分，与肝纤维化的发生、发展过程密切相关。本实验结果显示，不同剂量的复方鳖甲软肝方药物血清作用48 h、72 h均可抑制肝星形细胞的增殖，尤以高、中剂量组明显，提示复方鳖甲软肝方药物血清抑制肝星形细胞增殖的药物效应与药物浓度呈量效依赖关系，其机制可能与药物中的有效物质能阻止HSC分泌血小板衍生生长因子（PDGF）和阻止HSC已分泌的PDGF与HSC受体结合有关，从而起到抑制肝星形细胞的活化增殖，达到治疗肝纤维化的作用。而培养24h，各组无显着性差异，提示HSC的增殖需要一个从接受细胞信号刺激活化到HSC增殖数量发生显着变化的时间过程，从本实验结果提示，该时间过程无疑要大于24h。因此，如何在早期通过抑制HSC的增殖途径达到遏止HSC的迅速增殖，无疑具有重要的临床意义。与本室以往活血化瘀方药物血清的MTT实验结果相比，培养48h、72h，复方鳖甲软肝方药物血清与活血化瘀方药物血清均可显着抑制肝星形细胞的活化增殖，表明复方鳖甲软肝方药物血清与活血化瘀方药物血清均能抑制肝星形细胞的增殖。2.复方鳖甲软肝方药物血清对HSC活化影响的实验研究本实验采用免疫组化技术观察复方鳖甲软肝方药物血清对肝星形细胞（HSC）中α-SMA、desmin、突触素表达的影响，以探讨其抗肝纤维化的作用机制。研究表明，肝星形细胞的活化是肝纤维化的中心环节。活化的主要特征包括肝星形细胞中α-SMA、desmin和突触素的表达。本实验结果显示在时间上desmin、突触素的表达早于α-SMA的表达。突触素作为一种较新的HSC活化指标，可通过自分泌、旁分泌等方式参与肝纤维化发生、发展过程。并为肝纤维化的发生发展过程中神经调节的参与提供了指标依据。实验结果还显示，复方鳖甲软肝方药物血清作用24h、48h、72h均可显着抑制desmin和突触素的表达；复方鳖甲软肝方药物血清作用48h、72h还可显着α-SMA的表达，提示复方鳖甲软肝方药物血清可抑制HSC的活化。由于肝纤维化时α-SMA、desmin和突触素在表达时间上存在差异，而复方鳖甲软肝方药物血清抑制α-SMA、desmin和突触素的表达时间上也同样存在差异，故推测复方鳖甲软肝方药物血清抑制α-SMA、desmin和突触素表达的作用机制可能存在差异，详情有待进一步研究。实验结果还显示，培养24h，各组α-SMA表达并不显着，提示HSC中α-SMA的表达同样需要一个时间阶段，同增殖实验结果提示一样，如在早期加以积极治疗，则可取得更好的疗效。与本室以往<WP=5>活血化瘀方药物血清对α-SMA影响的实验结果相比
龚文华[10]（2001）在《肾腺苷脱氨酶及其结合蛋白的分离纯化和性质研究》文中进行了进一步梳理目的：探讨人肾细胞腺苷脱氨酶（ADA）的分子特性。方法：用免疫亲和层析法分离纯化人肾ADA，测氨法测定 ADA活性，经SDS-PAGE测定其分子量。结果：获得的ADA达电泳纯，酶比活力为2561.41U/mg， 得率26.59％。经SDS-PAGE分析，全酶由45.6KD的 小分子ADA亚单位和无ADA活性的结合蛋白（ADBP， 分子量分别为68.1KD和108.7KD）构成。 用腺苷或脱氧腺苷作底物，测得全酶的Km值分别为 89μmol/L和67μmol/L，最适温度37～40℃，最适pH 6.5～7.0。对氯苯甲酸能显着抑制酶活性，二硫苏糖 醇可使被抑制的酶活性得到部分恢复。 当腺苷浓度在50～150μmol/L范围内，ADBP对ADA 活性的抑制率为18.4％～21.5％。结论：人肾细胞中ADA为小分子ADA亚单位和无ADA活性 的ADBP构成的大分子ADA，巯基是该酶活性中心的 必需基因，且ADBP对ADA活性有抑制作用。
二、肾腺苷脱氨酶及其结合蛋白的纯化和性质研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、肾腺苷脱氨酶及其结合蛋白的纯化和性质研究（论文提纲范文）
（1）RFTS区域突变诱导的DNMT1蛋白酶裂解驱动神经退行性疾病的产生（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 表观遗传学介绍 |
| 1.2 DNA甲基化修饰 |
| 1.2.1 DNA甲基转移酶体系 |
| 1.2.2 DNMT3A/3B结构和酶活的调控 |
| 1.2.3 DNMT1的结构、酶活调控及维持DNA甲基化的机制 |
| 1.3 表观遗传因子与神经系统疾病 |
| 1.3.1 表观遗传学与大脑发育 |
| 1.3.2 与表观遗传因子改变相关的神经系统疾病 |
| 1.3.3 神经退行性疾病中的染色质紊乱 |
| 1.3.4 治疗神经系统疾病的表观遗传靶点 |
| 1.4 HSAN1E和ADCA-DN疾病简介 |
| 1.4.1 HSAN1E和ADCA-DN患者临床表型 |
| 1.4.2 HSAN1E和ADCA-DN致病机制研究现状 |
| 第二章 实验材料及方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验质粒载体 |
| 2.1.2 抗体 |
| 2.1.3 细胞和菌株 |
| 2.1.4 引物序列 |
| 2.1.5 试剂 |
| 2.1.6 实验常用仪器 |
| 2.1.7 常用实验试剂配制方法 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 质粒的构建 |
| 2.2.2 细胞的培养、制备、转染 |
| 2.2.3 细胞稳系的构建 |
| 2.2.4 利用CRISPR/Cas9和Donor DNA系统构建Dnmt1点突变的基因型小鼠 |
| 2.2.5 检测蛋白的稳定性 |
| 2.2.6 蛋白质免疫印迹 |
| 2.2.7 免疫荧光实验 |
| 2.2.8 染色质免疫共沉淀 |
| 2.2.9 纯化蛋白 |
| 2.2.10 盐离子浓度梯度洗脱 |
| 2.2.11 提取RNA,反转录,实时荧光定量PCR |
| 2.2.12 抽提基因组DNA及检测DNA甲基化 |
| 2.2.13 小鼠干细胞EB分化及RA诱导神经细胞 |
| 2.2.14 小鼠组织样品处理 |
| 2.2.15 小鼠行为学实验 |
| 2.2.16 小鼠成体神经干细胞分离和培养 |
| 2.2.17 数据分析 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 构建Dnmt1点突变的小鼠模型 |
| 3.2 Dnmt1纯和突变小鼠胚胎致死 |
| 3.3 Dnmt1杂合突变小鼠在各成体组织中的DNMT1蛋白和DNA甲基化水平降低 |
| 3.4 Dnmt1杂合突变小鼠的神经发生能力受损 |
| 3.5 Dnmt1杂合突变小鼠的认知能力受损 |
| 3.6 小鼠胚胎干细胞的内源性DNMT1突变蛋白不稳定 |
| 3.7 内源突变的DNMT1蛋白很可能被蛋白水解酶裂解 |
| 3.8 RFTS结构域突变的DNMT1蛋白表现出异常的核仁定位 |
| 3.9 核仁错误定位的DNMT1蛋白是截短的DNMT1 |
| 3.10 碱基编辑产生的DNMT1-M1突变的HS683细胞增殖缺陷并表现出DNMT1核仁错误定位 |
| 3.11 未发生蛋白水解裂解的突变DNMT1蛋白在亚细胞定位、蛋白稳定性和酶活性方面基本正常 |
| 第四章 总结和讨论 |
| 4.1 Dnmt1杂合突变确实引起神经病变并导致纯和突变胚胎致死 |
| 4.2 突变的DNMT1被蛋白酶裂解导致蛋白水平下降 |
| 4.3 酶切后产生的截短体能够定位于核仁 |
| 4.4 突变DNMT1被酶切后导致DNA甲基化水平下降 |
| 4.5 突变的DNMT1导致HSAN1E疾病产生的机制模型 |
| 参考文献 |
| 附录 (缩略语) |
| 在学期间所取得的科研成果 |
| 后记 |
（2）环状RNA CircCDH13对microRNA的调控在骨性关节炎中的作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 材料和方法 |
| 一、主要实验材料 |
| 二、主要实验方法 |
| 实验结果 |
| 第一部分 CircCDH13在人骨性关节炎软骨组织中的差异表达及环化特性验证 |
| 一、人骨性关节炎软骨组织中circ RNA的差异表达谱 |
| 二、CircCDH13在人骨性关节炎软骨组织及体外细胞模型中的表达情况 |
| 三、CircCDH13环化特性的验证 |
| 第二部分 CircCDH13对骨性关节炎体外模型中人软骨细胞的作用 |
| 一、CircCDH13体外RNA干扰及过表达效果验证 |
| 二、CircCDH13对骨性关节炎体外模型中人软骨细胞凋亡的作用 |
| 三、CircCDH13 对骨性关节炎体外模型中人软骨细胞细胞外基质代谢的影响 |
| 第三部分 CircCDH13在人软骨细胞中对miR-296-3p具有“海绵吸附”作用 |
| 一、CircCDH13在人软骨细胞中的“核质”定位 |
| 二、CircCDH13靶向miRNAs的预测与筛选 |
| 三、CircCDH13对miR-296-3p具有“海绵吸附”作用的验证 |
| 第四部分 miR-296-3p对CircCDH13调控的软骨细胞凋亡及细胞外基质代谢的作用 |
| 一、miR-296-3p对骨性关节炎体外模型中人软骨细胞的作用 |
| 二、miR-296-3p对CircCDH13调控的软骨细胞凋亡及细胞外基质代谢的作用 |
| 第五部分 PTEN是 miR-296-3p的下游靶基因,并介导miR-296-3p在骨性关节炎中的作用 |
| 一、miR-296-3p下游靶基因的预测与验证 |
| 二、miR-296-3p在人软骨细胞中对PTEN表达的调控作用 |
| 三、PTEN介导miR-296-3p在骨性关节炎中的作用 |
| 第六部分 CircCDH13体内沉默对DMM诱导的小鼠骨性关节炎具有缓解作用 |
| 一、人鼠CircCDH13同源性分析与验证 |
| 二、小鼠来源CircCDH13体内沉默效果验证 |
| 三、小鼠来源CircCDH13体内沉默对DMM诱导的小鼠骨性关节炎具有缓解作用 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 环状RNA的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文及参加科研工作情况 |
| 致谢 |
（3）与Tudor-SN蛋白结合的RNA潜在功能分析及调控方式探讨（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语Ⅹ |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、Tudor-SN结合RNA的分类及潜在功能分析 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 数据来源 |
| 1.1.2 DAVID在线分析网络平台 |
| 1.1.3 实验方法和流程 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 GeneOntology功能富集分析 |
| 1.2.2 分子功能(MolecularFunction)分析 |
| 1.2.3 生物学过程(BiologicalProcess)分析 |
| 1.2.4 细胞组分(cellularcomponent)分析 |
| 1.2.5 KEGG信号通路分析 |
| 1.2.6 RIP实验结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、Tudor-SN结合蛋白的质谱分析 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 细胞与质粒 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要溶液、缓冲液、培养基 |
| 2.1.4 主要仪器、设备 |
| 2.1.5 实验方法和流程 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 分子功能(MolecularFunction)分析 |
| 2.2.2 生物学过程(BiologicalProcess)分析 |
| 2.2.3 细胞组分(cellularcomponent)分析 |
| 2.2.4 KEGG信号通路分析 |
| 2.2.5 IP 实验证明 Tudor-SN 与相关蛋白的结合 |
| 2.2.6 GST-pull down 证明 Tudor-SN 蛋白通过相应片段与相关蛋白结合 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 核质转运受体蛋白 |
| 2.3.2 mRNA稳定性相关蛋白 |
| 2.4 小结 |
| 三、Tudor-SN对所结合RNA和蛋白的调控功能 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 细胞与质粒 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要溶液、缓冲液、培养基 |
| 3.1.4 主要仪器、设备 |
| 3.1.5 实验方法和流程 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 Tudor-SN对于所结合的mRNA核质转运的作用 |
| 3.2.2 Tudor-SN对于所结合的mRNA稳定性的作用 |
| 3.2.3 Tudor-SN结合蛋白在应激条件下的核质分布情况 |
| 3.2.4 IPZ在Tudor-SN结合蛋白核质分布中的作用 |
| 3.2.5 IPO5在Tudor-SN结合蛋白核质分布中的作用 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 多功能 RNA 结合蛋白（RBP）Tudor-SN 在 mRNA 定位中的作用 |
| 3.3.2 Tudor-SN蛋白参与维持mRNA稳定性 |
| 3.3.3 Tudor-SN结合蛋白在应激状态下的核质转运 |
| 3.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 mRNA-蛋白质复合物组成和调控的研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）诱导多功能干细胞（iPS）对小鼠下肢缺血再灌注损伤的保护作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 第一章 前 言 |
| 第二章 材料和方法 |
| 1. 主要仪器、材料和试剂 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要材料 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 实验所用试剂的配制 |
| 1.4.1 中性缓冲甲醛固定液的配制 |
| 1.4.2 磷酸盐缓冲液（PBS） |
| 1.4.3 4.5%水合氯醛 |
| 1.4.4 0.5%TTC染色液 |
| 1.4.5 福尔马林固定液 |
| 1.4.6 小鼠实验脱毛液 |
| 1.4.7 DEPC水 |
| 1.4.8 PBST（1L） |
| 1.4.9 10×FA Buffer |
| 1.4.10 5 × 甲醛变性胶加样缓冲液（5×loading buffer） |
| 1.4.11 1×甲醛变性胶电泳缓冲液（1×running buffer） |
| 1.4.12 1.2%的甲醛变性胶 |
| 1.4.13 配制DNA粗提裂解液 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 MEF细胞的制备 |
| 2.2 iPS细胞的培养 |
| 2.3 细胞的转染 |
| 2.3.1 使用Lipofectamine 2000转染，步骤如下 |
| 2.3.2 使用Lipofectamine 2000将mi RNA‐217转染到Ips细胞中、经过 |
| 2.4 Cell tracker CM Di I标记细胞 |
| 2.5 细胞的粘附迁移 |
| 2.5.1 细胞粘附 |
| 2.5.2 iPS细胞对内皮细胞的粘附 |
| 2.5.3 细胞迁移 |
| 2.5.4 iPS细胞跨内皮细胞的迁移 |
| 2.6 成功构建小鼠急性下肢缺血再灌注损伤模型 |
| 2.6.1 实验分组 |
| 2.6.2 模型建立 |
| 2.7 根据下肢活动功能进行评分，激光多普勒测血流 |
| 2.8 组织的提取 |
| 2.9 石蜡切片制作 |
| 2.10 冰冻切片制作 |
| 2.10.1 包埋 |
| 2.10.2 切片 |
| 2.11冰冻切片组织的荧光观察 |
| 2.12苏木素‐伊红（HE）染色 |
| 2.13免疫荧光技术 |
| 2.13.1 原理 |
| 2.13.2 使用方法 |
| 2.13.3 免疫荧光步骤 |
| 2.13.4 制作冰冻切片（同上） |
| 2.13.5 染色 |
| 2.13.6 对照设计 |
| 2.14 组织总RNA提取及PCR方法 |
| 2.14.1 组织总RNA提取 |
| 2.14.2 去除RNA样品中的DNA |
| 2.14.3 实时定量PCR(Real‐time PCR) |
| 2.14.3.1 引物设计： |
| 2.14.3.2 PCR反应体系（20μl） |
| 3.14.3.3 Real‐time PCR循环参数 |
| 2.14.4 Real‐time PCR数据分析 |
| 2.15细胞及肌肉组织中总DNA的提取、普通PCR。跑胶tetol定量 |
| 2.15.1 细胞总RNA的抽提 |
| 2.15.2 RNA定量（同上面的组织RNA的定量） |
| 2.15.3 质量鉴定（同上面的组织RNA的定量） |
| 2.15.3.1 实验步骤 |
| 2.15.4 mRNA逆转录为c DNA |
| 2.15.5 反应体系 |
| 2.15.6 SYBR Green Real‐time PCR |
| 2.15.6.1 引物序列 |
| 2.15.6.2 反应体系及条件 |
| 2.16 提取细胞总RNA和DNA及PCR扩增tet O |
| 2.16.1 细胞总RNA的提取及逆转录（同前） |
| 2.16.2 细胞总DNA的提取 |
| 2.16.3 细胞RNA逆转录产物c DNA和细胞粗提DNA进行tet O的PCR扩增 |
| 2.16.4 普通PCR反应体系及条件 |
| 2.17 统计学分析 |
| 第三章 实验结果 |
| 1.成功制备出诱导多动能干细胞 |
| 2. 体外转染mi RNA‐217对iPS细胞跨内皮细胞的粘附、迁移能力的影响 |
| 3.IPs在急性小鼠缺血再灌注损伤模型中的去向 |
| 4.缺血再灌注损伤小鼠尾静脉注射ips或MEF成瘤情况 |
| 5.尾静脉注射细胞后各组模型小鼠的肢体运动功能及血流情况 |
| 6.3天后缺血再灌注部位组织的HE染色情况 |
| 7.红色荧光（Di I）处理的细胞进入急性缺血再灌注损伤的动物体内的定位 |
| 8.免疫荧光化学染色检测缺血再灌注损伤处边缘组织血管情况 |
| 9.实时PCR检测iPS和mi RNA‐217对下肢缺血再灌注损伤后肌组织炎症因子的表达 |
| 10.Teto定量 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 综述 |
| 参考文献 |
（5）探讨调控人SND1蛋白表达的分子机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的和方法 |
| 一、人SNDl基因的生物信息学分析 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 对象 |
| 1.1.2 方法和流程 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 人SND1基因基本信息 |
| 1.2.2 不同种属的SND1启动子信息 |
| 1.2.3 人SND1启动子特点及其顺式作用元件与转录因子的预测 |
| 1.2.4 人SND1基因CpG岛的预测 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、探讨调控人SND1基因转录的分子机制 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 细胞、质粒与菌种 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要溶液及配方 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.1.5 实验方法和流程 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 人类SND1基因不同启动子区域虫荧光素酶表达质粒的构建 |
| 2.2.2 转录因子对人SND1基因启动子的调控作用 |
| 2.2.3 转录因子与人SND1基因相互作用的体内验证 |
| 2.2.4 信号传导通路与人SND1的转录调控 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 三、初步探讨转录之后人SND1蛋白表达的分子机制 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 细胞、质粒与菌种 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要溶液及配方 |
| 3.1.4 主要仪器设备 |
| 3.1.5 实验方法和流程 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 人SND1的mRNA转录本检测 |
| 3.2.2 人SND1蛋白自身在体外的结合情况 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
（6）重组大鼠肾上腺髓质素质粒对力竭运动大鼠心脏缺氧的保护作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 目录 |
| 引言 |
| 技术路线图 |
| 第一章 重组肾上腺髓质素真核表达载体的构建 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 质量控制 |
| 2. 结果 |
| 2.1 大鼠肾上腺髓质素基因(ADM)的鉴定结果 |
| 2.2 ADM与克隆载体pMD-18T连接的鉴定结果 |
| 2.3 肾上腺髓质素重组质粒pVAX1-ADM的鉴定结果 |
| 2.4 肾上腺髓质素重组质粒pVAX1-ADM的浓度及纯度 |
| 2.5 大鼠肾上腺髓质素重组质粒pVAX1-ADM在大鼠腓肠肌中的表达情况 |
| 3. 讨论 |
| 3.1 获取目的基因 |
| 3.2 真核克隆载体与表达载体的选择 |
| 3.3 目的基因与载体的连接与转化 |
| 3.4 重组质粒的大量提取与纯化 |
| 3.5 机体对重组质粒(pVAX1-ADM)的摄取 |
| 4. 结论 |
| 第二章 重组大鼠肾上腺髓质素基因对力竭运动大鼠心 #26肌缺氧的保护作用及剂量效应的研究 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学分析 |
| 1.4 质量控制 |
| 2. 结果 |
| 2.1 大鼠一般情况 |
| 2.2 大鼠心肌组织MDA含量测定 |
| 2.3 大鼠心肌组织总超氧化物歧化酶活力值(T-SOD) |
| 2.4 大鼠心肌组织内肌酸激酶(CK)含量 |
| 2.5 大鼠心肌组织内乳酸脱氢酶(LDH)的活性 |
| 2.6 大鼠血液流变学指标 |
| 2.7 大鼠心肌组织形态学检查 |
| 3. 讨论 |
| 3.1 力竭性运动与心肌缺氧及损伤 |
| 3.2 各项检测指标的意义 |
| 3.3 ADM与心肌缺氧损伤 |
| 3.4 还原型谷胱甘肽(GSH)与心肌缺氧损伤 |
| 3.5 重组肾上腺髓质素(pVAX1-ADM)对力竭性心肌缺氧大鼠心脏保护作用的剂量效应 |
| 4. 结论 |
| 5. 总结论 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词表 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（7）人核糖核苷酸还原酶的质子电子偶联传递通路研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 主要缩略语 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 结果和讨论 |
| 3.1 hRRM2蛋白结晶及X-射线衍射晶体结构解析 |
| 3.1.1 hRRM1和hRRM2表达质粒的构建 |
| 3.1.2 hRRM1和hRRM2的表达与纯化 |
| 3.1.3 hRRM2截断体蛋白结晶以及X-射线衍射晶体结构 |
| 3.1.4 hRRM1和hRRM2全酶模型建立 |
| 3.2 Elu106在RR酶催化活性中起着关键作用 |
| 3.2.1 Trp102被周围的氨基酸包埋在蛋白的内部 |
| 3.2.2 Trp102周围氨基酸突变提示Elu106在酶催化中起着关键作用 |
| 3.2.3 Elu106系列突变分析提示其参与自由基传递通路 |
| 3.3 Elu106作用机制研究 |
| 3.3.1 Elu106的空间位置分析 |
| 3.3.2 SPR检测Elu106突变体对hRRM2蛋白与hRRM1相互作用的影响 |
| 3.3.3 Elu106突变体的光谱扫描 |
| 3.3.4 EPR检测Elu106突变体的酪氨酰自由基信号 |
| 3.3.5 E106A、E106D和E106Q的晶体结构分析 |
| 3.3.6 CzDP抑制试验-间接证实Elu106参与hRRM2的PCET通路 |
| 3.3.7 Elu106参与PCET的可能机制 |
| 3.4 小结与讨论 |
| 4. 结论和展望 |
| 4.1 主要结论 |
| 4.2 展望 |
| 参考文献 |
| 综述一 |
| 参考文献 |
| 综述二 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在学期间取得的科研成果 |
（8）寡肽（OGP、HIV-1 tat～[47-57]）的合成、聚合及功能研究以及NRSF/REST在转录调控方面的研究（论文提纲范文）
| 第一部分 ：寡肽（OGP、HIV-1tat[47-57]）的合成、聚合及功能研究 |
| 第一章 ：OGP的合成及其与rhG-CSF在造血方面的协同作用 |
| 第二章 ：多聚分支OGP的制备及其在免疫分析方面的研究 |
| 第三章 ：多聚分支HIV-1tat[47-57]的制备及其在转基因方面的研究 |
| 第二部分 ：NRSF/REST在转录调控方面的研究一 个基因决定细胞的命运？—NRSF/REST被下调后细胞的基因表达变化以及细胞分化 |
| 在读期间完成的论文及专利 |
| 致谢 |
（9）复方鳖甲软肝方药物血清对大鼠离体肝星形细胞作用机理研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写词表 |
| 第一部分 ：文献综述 |
| 1. 肝纤维化的研究现状及HSC与肝纤维化的研究进展 |
| 2. 目前研究的技术手段和常用的实验观测指标 |
| 3. 免疫组织化学中抗原修复的研究进展 |
| 4. 核转录因子与肝星形细胞活化的关系 |
| 5. 现代医学和中医药对肝纤维化治疗的概况 |
| 第二部分 ：实验研究 |
| 1. 复方鳖甲软肝方药物血清对HSC增殖影响的实验研究 |
| 2. 复方鳖甲软肝方药物血清对HSC活化影响的实验研究 |
| 3. 复方鳖甲软肝方药物血清对HSC胶原表达及降解影响的实验研究 |
| 4. 复方鳖甲软肝方药物血清对HSC活化中细胞因子影响的实验研究 |
| 5. 复方鳖甲软肝方药物血清对HSC中NF-KB活化影响的实验研究 |
| 6. 小结 |
| 第三部分 ：参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 图版与图版说明 |
（10）肾腺苷脱氨酶及其结合蛋白的分离纯化和性质研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 鸣谢 |
| 参考文献 |
四、肾腺苷脱氨酶及其结合蛋白的纯化和性质研究（论文参考文献）
- [1]RFTS区域突变诱导的DNMT1蛋白酶裂解驱动神经退行性疾病的产生[D]. 王文偲. 华东师范大学, 2021
- [2]环状RNA CircCDH13对microRNA的调控在骨性关节炎中的作用及其机制研究[D]. 周志斌. 中国人民解放军海军军医大学, 2020(02)
- [3]与Tudor-SN蛋白结合的RNA潜在功能分析及调控方式探讨[D]. 曹晓娜. 天津医科大学, 2018(01)
- [4]诱导多功能干细胞（iPS）对小鼠下肢缺血再灌注损伤的保护作用研究[D]. 王荣. 宁夏医科大学, 2013(11)
- [5]探讨调控人SND1蛋白表达的分子机制[D]. 赵虹. 天津医科大学, 2012(03)
- [6]重组大鼠肾上腺髓质素质粒对力竭运动大鼠心脏缺氧的保护作用的研究[D]. 廖青. 湖南师范大学, 2012(01)
- [7]人核糖核苷酸还原酶的质子电子偶联传递通路研究[D]. 陈新焕. 浙江大学, 2011(10)
- [8]寡肽（OGP、HIV-1 tat～[47-57]）的合成、聚合及功能研究以及NRSF/REST在转录调控方面的研究[D]. 刘智慧. 中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）, 2004(01)
- [9]复方鳖甲软肝方药物血清对大鼠离体肝星形细胞作用机理研究[D]. 张玮. 北京中医药大学, 2003(02)
- [10]肾腺苷脱氨酶及其结合蛋白的分离纯化和性质研究[D]. 龚文华. 江西医学院, 2001(01)