导读:本文包含了猪胰腺论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:五指山猪,胰腺,胰岛,组织学
猪胰腺论文文献综述
李雪成,牛云超,吕育芝,刘伟,崔成都[1]（2018）在《不同日龄五指山猪胰腺胰岛的组织学及免疫组织化学研究》一文中研究指出猪胰岛是治疗人类Ⅰ型糖尿病的理想异种供体。为给胰岛的异种移植提供形态学基础资料,分别以出生后1~10、40、120和180d的五指山猪的胰腺为试验材料,对五指山猪出生后不同日龄胰岛的组织学及组织化学特性进行了研究。结果表明:五指山猪胰腺在出生后第1~10d未生成典型胰岛,在第40、120、180d出现典型胰岛,随日龄增长胰高血糖素免疫反应细胞呈逐渐增加的趋势;出生后不同日龄五指山猪胰腺均具有胰岛素免疫反应阳性细胞、胰高血糖素免疫反应阳性细胞和生长抑素免疫反应阳性细胞,这些细胞的分布面积随日龄增加呈增大的趋势。(本文来源于《延边大学农学学报》期刊2018年02期）
徐栓栓[2]（2018）在《SerpinB1在猪胰腺干细胞增殖及向胰岛素分泌细胞分化中的作用及机理》一文中研究指出糖尿病是一种代谢类疾病,又称高血糖症,表现为多食、多尿、多饮、体重减少。长期的高血糖引起机体多个组织器官的损伤,尤其是眼、肾、心脏、血管和神经等的功能障碍。胰岛β细胞损伤是糖尿病的症结所在。猪的胰腺干细胞(Pocine Pancretic Stem Cells,pPSCs)是从胎猪胰腺中分离出来的一种成体干细胞,在细胞中转入大T载体形成永生化细胞系,实验室先前的研究证明该细胞经化学小分子诱导可分化为胰岛素分泌细胞。又因猪的基因组以及胰岛素的结构与人的相似性,所以研究pPSCs对未来糖尿病的临床治疗具有深远的意义。SerpinB1是一种蛋白酶抑制剂,通过抑制蛋白酶活性缓解由炎性反应所引起的组织损伤。有研究表明,肝的胰岛素抵抗促进了SerpinB1的分泌,作用于胰腺促进胰岛β细胞的增殖,并且这一反应与其蛋白酶抑制剂活性相关。干细胞的自我更新和分化受到机体内多种细胞因子的调控,胰腺干细胞作为一种成体干细胞,SerpinB1对成体干细胞-猪胰腺干细胞的影响目前仍不清楚。本实验探究了SerpinB1对pPSCs中影响及作用机理。通过超表达和干扰pPSCs中SerpinB1的表达,一方面证实超表达SerpinB1可以促进pPSCs的增殖,另一方面发现SerpinB1在pPSCs诱导分化后期表达量增加,干扰SerpinB1影响了pPSCs的诱导分化效率,不利于胰岛素分泌细胞的形成。本实验为pPSCs的增殖机制提供了理论依据,另外为体外高效的获得胰岛素分泌细胞提供了新的思路和手段。1.SerpinB1促进pPSCs的增殖首先,通过运用qRT-PCR(实时荧光定量)对pPSCs中的SerpinB1的mRNA水平进行检测发现,SerpinB1在pPSCs中大量表达。随后一方面运用shRNA干扰SerpinB1在细胞中的表达,另一方面使细胞超表达SerpinB1。通过CCK-8检测发现干扰SerpinB1使细胞的活性降低,超表达SerpinB1增强了细胞活性。随后的EdU、流式细胞术周期检测以及qRT-PCR结果显示,与正常的细胞相比,干扰SerpinB1后细胞的EdU阳性率明显降低,处于S期的细胞比率下降,并且细胞中CDK2、PCNA以及CyclinD1的mRNA表达水平显着降低,说明SerpinB1促进pPSCs进入S期而促进pPSCs的增殖。Western blotting检测蛋白水平结果显示,超表达SerpinB1激活了STAT3、CDK2、和CyclinD1蛋白水平的表达,抑制了P53和P21的表达。所以我们推测SerpinB1通过STAT3信号通路促进pPSCs的增殖。2.SerpinB1促进pPSCs诱导分化成胰岛素分泌细胞首先,我们运用两步诱导法诱导pPSCs形成胰岛素分泌细胞,qRT-PCR和Western blotting的检测结果显示胰岛素分泌细胞中SerpinB1的表达水平显着升高。随后分别在诱导1d、3d、9d取样进行Western blotting检测发现,SerpinB1在整个诱导过程中的表达逐渐升高。其后,分别对干扰和超表达SerpinB1的pPSCs进行诱导,与对照组相比,发现干扰SerpinB1的表达后,诱导形成的胰岛素分泌细胞在悬浮诱导培养基中聚团松散不致密,培养基中存在大量悬浮的零散细胞,聚团后的细胞不易贴壁,细胞迁出率低,DTZ和Insulin染色显色不明显,在mRNA水平低表达Insulin、NeuroD、PDX1、Glut-2、Nkx6.1和MafA,并且ELISA检测发现,高糖刺激反应不灵敏。超表达SerpinB1后,在mRNA水平,Insulin、NeuroD、PDX1、Glut-2、Nkx6.1和MafA的表达明显升高,胰岛素分泌量显着性的增加。据此我们推测,SerpinB1影响了pPSCs向胰岛素分泌细胞的诱导效率。(本文来源于《西北农林科技大学》期刊2018-05-01）
杨泓[3]（2018）在《叶酸对猪胰腺干细胞增殖及向胰岛素分泌细胞分化的影响》一文中研究指出糖尿病(Diabetes mellitus,DM),作为一类慢性代谢性疾病,具有极高的发病率和高致死率,对公众的健康造成了极其严重的威胁。DM病发的主要原因是胰岛β细胞的损伤导致胰岛素分泌不足或机体利用障碍。目前,针对DM治疗的研究主要集中在β细胞再生疗法。猪胰腺干细胞(porcine pancreatic stem cells,pPSCs)是通过收集胎猪胰腺组织分离获得的一类干细胞,我们已证实该细胞可以经体外诱导分化成为具有胰岛素分泌功能的细胞(insulin-producing cells,IPCs)。同时解剖学结构显示猪和人类的胰岛结构、大小又最为相近,所以经pPSCs诱导获得的IPCs有望用于人类DM的临床治疗。叶酸(folic acid,FA),一直被认为是以维生素的角色参与DNA和RNA合成过程,影响细胞的自我更新、增殖与分化。而近期的研究表明,FA可以直接作为一种信号分子促进生殖干细胞的增殖。到目前为止,FA对pPSCs的增殖和分化的作用及机理仍不清楚。本试验针对FA对pPSCs增殖和在pPSCs向IPCs定向分化中的作用,以及FA调控pPSCs增殖和分化的机制展开了研究,得到的结果如下:1.FA通过结合叶酸受体FOLRα同时激活Wnt信号通路和ERK通路,促进pPSCs的增殖通过CCK8和EDU染色评估FA对pPSCs增殖的影响,发现FA处理组细胞EDU阳性率高、增殖速度快,说明FA促进pPSCs的增殖。qRT-PCR及Western blotting结果表明,经FA作用后,pPSCs中的PCNA、CyclinD1、c-Myc在蛋白和RNA的表达水平上均上调,进一步说明FA作用细胞增殖速度加快,而加入FA抑制剂MTX后,这些指标都降低,明确FA对pPSCs的促增殖作用。同时FA对pPSCs产生促增殖作用的同时,刺激叶酸受体FOLRα的表达上调,而干扰FOLRα表达则抑制pPSCs的增殖,说明FA通过结合叶酸受体FOLRα促进pPSCs的增殖。进一步的机制研究中,Western blotting显示,pPSCs在经FA处理后,细胞中经典Wnt信号通路和ERK信号通路中的关键蛋白activeβ-catenin和p-ERK的表达均增高,进一步地分别添加通路抑制剂对两条信号通路造成抑制后,FA对细胞的促增殖作用又明显抑制。以上结果表明FA通过结合叶酸受体FOLRα同时激活Wnt信号通路和ERK通路对pPSCs发挥促增殖的作用。2.FA可以提高pPSCs向IPCs的分化的诱导效率实验室先前的研究已经证实pPSCs可以在体外诱导成为IPCs,在此基础上添加FA来探究其对pPSCs向IPCs诱导分化的影响。检测结果显示:在诱导过程添加FA获得的细胞团中,双硫腙染色DTZ着色加深,β细胞成熟标志基因Insulin、NKX6.1、MafA、NeuroD1在mRNA水平表达升高,功能基因Insulin、C-peptide蛋白表达水平升高,同时对高糖应答分泌胰岛素能力升高。与此同时,与增殖试验类似,Western blotting检测发现诱导过程中添加FA得到的细胞团中Wnt信号通路和ERK通路的关键蛋白activeβ-catenin、p-ERK的表达均有上调;进一步在诱导过程中通过添加通路抑制剂抑制这两条通路,qRT-PCR检测发现β细胞成熟标志基因Insulin、NKX6.1、MafA、NeuroD1的表达下调,表明FA的促分化作用被抑制,说明FA对pPSCs的促分化作用同样的与Wnt信号通路和ERK通路有关。综上所述:FA结合叶酸受体FOLRα促进pPSCs的增殖;在体外诱导分化过程中FA作用会上调pPSCs向IPCs定向分化的效率;Wnt信号通路和ERK通路参与调控FA对pPSCs的促增殖和促分化作用。本研究为pPSCs治疗糖尿病的研究和临床运用提供了新的方向。(本文来源于《西北农林科技大学》期刊2018-05-01）
许会军,陈晓芳,刘朝兴,刘鹏,马志乾[4]（2017）在《单次大剂量放疗对猪胰腺及胰周组织的损伤作用》一文中研究指出[目的]观察不同单次大剂量外放疗对猪胰腺及胰周组织的损伤作用。[方法]12头家猪分为7Gy、10Gy、13Gy和16Gy共4组,每组3头进行单次大剂量外放疗,取仰卧位,前后对穿照射,射野面积为10cm×10cm方野,照射后7d处死动物后取材,取受照胰腺组织及胰周组织进行常规切片HE染色,光镜下病理观察。[结果]单次大剂量照射后猪胰腺组织的损伤呈明显的剂量依赖性,损伤形式由点状凋亡坏死向大片状坏死转变。[结论]提高单次照射剂量在增加胰腺组织损伤的同时也明显增加了胰周组织的损伤。因此,应采用调强适形放疗技术加强对胰周组织的保护。提高单次剂量后引起的胆道损伤应引起注意。(本文来源于《肿瘤学杂志》期刊2017年12期）
任立鹏[5]（2017）在《自噬在猪胰腺干细胞增殖及向胰岛β样细胞分化中的作用及机理》一文中研究指出糖尿病是目前世界上对公众健康危害最严重的一类慢性疾病,主要由胰岛素分泌不足或机体不能有效利用胰岛素引起,临床表现为高血糖,可引发心脏病、肾功能衰竭、中风、下肢截肢、神经损伤及视力损伤等严重并发症。糖尿病的核心问题在于胰岛β细胞的缺损。猪胰腺干细胞(porcine pancreatic stem cells,pPSCs)是由胎猪胰腺组织中分离出来的成体干细胞,该细胞可以定向诱导分化为胰岛β样细胞。因为猪的胰岛素结构与人相近,所以经pPSCs诱导分化得到的胰岛β样细胞有望用于临床糖尿病的治疗。自噬是真核生物中一种进化上高度保守的细胞机制,是用于降解、回收利用细胞内生物大分子和受损细胞器的过程,对维持细胞及组织器官的稳态有非常重要的作用。有研究表明,自噬在维持胰腺中胰岛β细胞的数量、功能及维持血糖平衡中发挥重要作用。干细胞自我更新和分化的过程需要对细胞内蛋白和细胞器数量进行严格控制,自噬能快速有效地降解细胞内酶和转录因子等物质,因此,自噬在干细胞自我更新和分化中也发挥重要作用。但是到目前为止,自噬对胰腺干细胞的影响仍不清楚。本实验探究了自噬在pPSCs增殖及向胰岛β样细胞分化中的作用及机理。实验一方面用稳定表达EGFP-LC3B的猪胰腺干细胞系(pPSCs-EGFP-LC3B)实时监测细胞内自噬的变化,最终证明饥饿诱导的自噬可以促进pPSCs的增殖。另一方面,发现自噬水平在pPSCs向胰岛β样细胞诱导分化后期升高,抑制自噬会影响pPSCs的诱导分化效率。本实验为进一步揭示pPSCs增殖及分化机理奠定了理论基础。1.自噬能促进pPSCs增殖首先,通过激光共聚焦观察和Western blotting实验,我们对pPSCs-EGFP-LC3B的自噬水平进行了评估,发现血清饥饿4 h可以诱导该细胞发生自噬,添加氯喹可以抑制自噬的发生。接着,BrdU染色、流式细胞术检测细胞周期及Western blotting实验的结果表明,与正常培养的pPSCs相比,无血清诱导的自噬组内pPSCs的Brd U阳性率高,处于S期的细胞比例高,细胞内PCNA的蛋白表达水平较高,说明细胞增殖速度加快,加入氯喹抑制自噬后,这些指标都降低,细胞增殖速度减慢。同时,我们发现血清饥饿诱导自噬发生的同时,活性β-catenin表达量增高、入核明显,经典Wnt信号通路被激活,于是我们推测自噬对pPSCs的促增殖作用可能受经典Wnt信号通路调控。2.自噬是pPSCs诱导分化为胰岛β样细胞的必要条件首先,我们用实验室已经建立的诱导分化体系对pPSCs进行诱导,并成功得到了DTZ染色阳性,在mRNA水平高表达胰岛素、Glut2、NKX6.1、MafA,表达胰岛素和C肽蛋白并且能对高糖应答分泌胰岛素的胰岛β样细胞。其后,通过对处于诱导分化第0、1、3、4、6、9天的细胞样进行Western blotting检测,我们发现从诱导的第4天开始细胞内自噬一直维持在较高水平。第4天是由贴壁诱导换为悬浮诱导的时间点,在第4天添加氯喹抑制自噬,细胞不能聚团得到胰岛样细胞团,在第5天添加氯喹抑制自噬,得到的胰岛样细胞团不能对高糖产生应答并分泌胰岛素。与此同时,我们发现诱导过程中,细胞内自噬水平的变化与活性β-catenin的变化呈正相关关系,自噬活性增强时,活性β-catenin的表达显着增加,抑制自噬,活性β-catenin也在一定程度受到抑制。据此,我们推测自噬对pPSCs诱导分化的影响可能与经典Wnt信号通路有关。(本文来源于《西北农林科技大学》期刊2017-05-01）
胡淑娴[6]（2016）在《miR-375通过靶向PDK1抑制胎猪胰腺干细胞的增殖和分化》一文中研究指出胰腺干细胞(pancreatic stem cells,PSCs)是从胰腺中分离得到的,具有自我更新和多种分化能力的干细胞。在体内外特定条件下能够分化成为胰腺中的多种细胞,包括腺泡细胞、内分泌细胞和胰腺导管细胞,其自我更新和分化受到复杂网络调控,近年来有报道表明miRNA(microRNA)在胰腺发育过程中发挥重要的调节功能,对胰腺的形成以及胰腺内外分泌部功能的发挥都起到重要的调控作用。其中miR-375在胰腺发育到限定性内胚层阶段之前表达量激增并达到峰值,此后表达量降低到β细胞中miR-375低表达。因此,我们认为在多种胰腺细胞中miR-375发挥不同甚至完全相反的功能。本研究我们以miR-375为主线,利用本实验室已分离并建系的胎猪PSCs,经形态学、mRNA及蛋白多层面,采用包括qRT-PCR、流式细胞周期、流式细胞凋亡、Western Blotting、免疫荧光染色等多种检测手段探究了miR-375在PSCs中发挥的作用及机制。通过生物信息学手段预测并利用双荧光素酶报告基因系统验证了miR-375在PSCs中发挥功能的一个重要下游靶基因——PDK1。研究发现,miR-375能够直接靶向PDK1抑制PSCs的增殖、存活和向β样细胞的分化成熟,具体结论包括以下两点:1.miR-375对PSCs的增殖、存活和分化发挥抑制作用合成并转染miR-375的模拟物(miR-375m)、抑制物(miR-375i)和无义物(N.C)过表达和抑制PSCs中的mi R-375。通过BrdU、MTT等检测发现miR-375抑制PSCs增殖。通过qRT-PCR、Western Blotting和流式细胞术检测发现mi R-375能够抑制增殖相关基因的表达并诱导PSCs凋亡。后续我们又采用本实验室已建立的PSCs向胰岛样细胞诱导分化方案,并在诱导过程中转染miR-375m和N.C,对诱导过程中的细胞团进行形态学分析,并对诱导2周后的细胞团进行检测。经过双硫腙染色、qRT-PCR、免疫荧光染色和放射免疫法胰岛素分析,我们发现过表达miR-375能抑制PSCs向胰岛素分泌细胞的分化。2.miR-375通过直接靶向PDK1发挥功能通过生物信息学手段,我们预测了miR-375的下游靶基因,结合关于胰腺发育信号调控的相关报道,我们把研究目标锁定于PDK1。经qRT-PCR和Western Blotting检测发现,mi R-375能够在蛋白水平下调PDK1,但不能改变其mRNA表达量。通过双荧光素酶报告基因系统检测发现,miR-375能够与PDK1靶向结合发挥调控作用。通过Ki67和PDK1的免疫荧光共染实验,我们发现过表达miR-375能够导致Ki67和PDK1阳性细胞数的减少。此后我们检测了PDK1的一个下游原件AKT的磷酸化水平,过表达miR-375能导致AKT磷酸化水平下调,检测结果表明,miR-375靶向PDK1,并通过PDK1-AKT通路调控PSCs。3.PDK1能够促进PSCs增殖和分化用PDK1抑制剂OSU-03012处理细胞,抑制PDK1的功能通过流式细胞术检测发现,OSU-03012会引起PSCs周期阻滞和凋亡的增加。qRT-PCR、免疫荧光染色、Western Blotting检测增殖和凋亡相关基因发现,OSU-03012会引起细胞增殖基因和抗凋亡基因的下调,同时上调凋亡基因的表达。同时我们还在诱导分化体系中添加了OSU-03012,发现分化后的胰岛素样细胞团数减少、体积缩小、结构松散。诱导2w后收集细胞团进行qRT-PCR检测发现,胰岛细胞团分化成熟相关的基因表达下调。这些结果表明,OSU-03012会抑制PSCs的增殖及分化,因此我们推断PDK1能促进PSCs的增殖和分化。(本文来源于《西北农林科技大学》期刊2016-05-01）
齐子珺,崔长艳,于晶,姜楠,王先哲[7]（2016）在《五指山猪胰腺胚后发育的解剖学观察》一文中研究指出动物的胰腺是重要的消化腺,具有外分泌和内分泌两种功能。本试验为异种间器官移植提供形态学的基础资料,以出生1d、10d、40d、120d及180d五指山猪的胰腺为试验材料,采用大体解剖学方法系统观察了不同日龄五指山猪胰腺的解剖学特点。结果表明:1d、10d、40d、120d及180d五指山猪胰腺均分为胰体、左叶(脾叶)、右叶(十二肠叶)、连接叶及连接桥,中间相互连接形成胰环;胚后发育过程中其重量和体重比随日龄的增大而增加,五指山猪胰腺1日龄时重量仅有0.52±0.07g,6月龄时重量达到32.19±5.72g;五指山猪胰腺指数1日龄时为1.55×10-3,6月龄时为5.04×10-3。(本文来源于《黑龙江科技信息》期刊2016年11期）
肖靖[8]（2015）在《猪胰腺磷脂酶A_2在无孢黑曲霉SH-2中表达研究》一文中研究指出磷脂酶A2(Phospholipase A2,PLA2,EC 3.1.1.4)是一大类特异性催化磷脂sn-2位酰基水解,生成花生四烯酸(arachidonic acid)、油酸(oleic acid)等游离脂肪酸(free fatty acids)和溶血性磷脂(lysophospholipids)的酶族。PLA2除了与人体炎症反应等生理功能相关外,还广泛用于油脂脱胶和卵黄改性等工业生产、食品加工行业。黑曲霉为生产菌生产的猪胰腺磷脂酶A2更是被国家卫生部于2008年列入允许的食品添加剂。国内猪胰腺PLA2,主要是从猪胰腺中提取得到,产量低,无法大规模生产,尚未发现利用微生物表达的商业化猪胰腺来源PLA2。黑曲霉作为美国食品药品监督局FDA认证的GRAS(Generally Regarded As Safe)菌株之一,在表达外源蛋白时,具有安全、高分泌能力、能够进行翻译后修饰等特点。表达宿主无孢黑曲霉SH-2更具有蛋白表达量高、液体培养表型易于控制等优点。因此以黑曲霉为宿主表达猪胰腺磷脂酶A2有着广泛应用前景。本文构建PLA2表达质粒,转化到无孢黑曲霉SH-2中。表达的重组蛋白通过SDS-PAGE和蛋白质谱鉴定表明确实为猪胰腺PLA2。蛋白纯化脱盐后比活力达165.60U/mg。在此基础上通过构建PLA2多拷贝质粒,将异源表达的PLA2酶活提高到原来的2倍。通过荧光定量PCR检测糖化酶基因gla A、非折迭蛋白响应(unfold protein response,UPR)机制信号通路关键转录因子hac Ai、PLA2等叁个基因的m RNA转录情况,发现在gla A与PLA2基因处于高转录水平的情况下,hac Ai基因转录水平也较高。将筛选到的转化子,进行5L罐发酵,初步摸索无孢黑曲霉发酵工艺,通过控制发酵液中还原糖含量来促进菌丝表型变化,最终测到发酵液酶活17.10U/m L,比摇瓶发酵提高3倍,高于从动物胰脏中直接提取透析后的酶活14.70 U/m L,总蛋白27.80 mg/m L,为之后的发酵工艺研究奠定了基础。(本文来源于《华南理工大学》期刊2015-06-01）
吕育芝[9]（2015）在《五指山猪胰腺胚后发育的形态学观察》一文中研究指出胰腺是重要消化腺,具有外分泌和内分泌两种功能。胰岛移植目前已经成为治疗依赖性糖尿病的较理想途径,猪胰岛被认为是目前适宜的供体来源。本试验,以出生1日龄、10日龄、40日龄、4月龄及6月龄五指山猪的胰腺为试验材料,采用大体解剖学、组织学及免疫组织化学技术,从形态学角度出发系统研究五指山猪胰腺胚后发育规律。结果表明：1.1日龄、10日龄、40日龄、4月龄及6月龄五指山猪胰腺均可分为胰体、左叶(脾叶)、右叶(十二肠叶)、连接叶及连接桥,中间相互连接形成胰环。胚后发育过程中其重量和体重比随日龄的增大而增加。2.1日龄、10日龄、40日龄、4月龄及6月龄五指山猪胰腺胰岛素免疫反应细胞分布面积分别为66.25±18.191μm2、 72.13±14.45μm2、 942.87±15.59μm2、1467.55±23.46μm2、3313.04±41.74μm2；五指山猪胰腺胰高血糖素免疫反应细胞分布面积分别为227.91±7.51μm2、271.94±14.76μm2、3624.02±28.91μm2、6531.8±48.98μm2、12510.09±65.25μm2；五指山猪胰腺生长抑素免疫反应细胞分布面积分别为15.69±3.61μm2、21.58±2.13μm2、198.28±16.62μm2、384.53±35.46μm2、873±25.02μm2。由此可知,胚后五指山猪胰腺胰岛构成细胞数量随日龄增大而增多,且6月龄以前各主要构成细胞具有分化增殖能力。综上所述,胚后五指山猪胰腺的形态学特点随着日龄的变化而改变,胰腺胰岛构成细胞数量随日龄增大而增多,且6月龄以前各主要构成细胞具有分化增殖能力。本研究结果将为五指山猪胰腺发生学研究及糖尿病和胰腺其他疾病的治疗提供形态学的试验资料。(本文来源于《延边大学》期刊2015-06-01）
韩伟[10]（2015）在《Wnt3a调控猪胰腺干细胞增殖的分子机理》一文中研究指出糖尿病是以胰岛素分泌不足或外周组织对胰岛素抵抗引起葡萄糖代谢紊乱血糖升高为主要特征的一类代谢性疾病,然而胰岛素依赖型糖尿病是目前一种无法完全治愈的慢性疾病。糖尿病及并发症需体外注射胰岛素药物治疗。目前,研究发现通过胰腺组织或胰岛细胞移植是一种很有前景的治疗方案。然而人类胰腺供体组织来源匮乏,人们将移植替代物转向异种动物-猪。猪胰岛素结构与人胰岛素结构高度同源并且能够调节胰岛细胞生理活性干预血糖。研究表明胰腺干细胞具有较强的自我更新能力及多向分化潜能,可能是获得大量胰岛β细胞的最佳种子细胞。因此,近年来人们将研究重点转移到猪胰腺干细胞。然而在机体成熟胰腺组织内,胰腺干细胞数量相对较少且大多数增殖缓慢。经典Wnt信号通路中的Wnt3a分子,其在胚胎发育、氧化应激、线粒体形态膜电位及干细胞增殖分化过程中发挥着重要的调控作用,参与基因转录、细胞迁移粘附、细胞衰老凋亡、细胞极化和自噬等重要生理过程。然而Wnt3a分子是否参与胰腺干细胞的增殖与分化一直未见可靠报道。本研究在实验室已有基础上,探讨稳定表达Wnt3a和Dox诱导Wnt3a表达对猪胰腺干细胞生物学特性影响及其可能的分子机制。研究结果表明,稳定表达Wnt3a猪胰腺干细胞具有胰腺干细胞相关生物学特性,激活β-catenin介导的经典Wnt信号通路,过表达Wnt3a引起猪胰腺干细胞氧化应激水平降低、调节线粒体膜电位转换,继而保护线粒体生理功能,β-catenin靶向降低活性氧水平、抑制猪胰腺干细胞凋亡。建立Dox诱导Wnt3a表达调控猪胰腺干细胞系统,Wnt3a表达受Dox时间和剂量依赖性调控,Dox诱导Wnt3a表达促进猪胰腺干细胞增殖。构建稳定表达自噬标记LC3猪胰腺干细胞,建立体外评估自噬活性猪胰腺干细胞模型,一定程度诱导自噬促进猪胰腺干细胞增殖。在糖尿病发生和胰腺干细胞发育分化过程中,氧化应激和胰岛β细胞凋亡及自噬都起到至关重要的作用,该研究发现Wnt3a可能通过激活Wnt/β-catenin通路调控猪胰腺干细胞的自我更新和抗凋亡。1.稳定表达Wnt3a促进猪胰腺干细胞增殖并抑制其凋亡将重组真核表达载体p IRES2-Ac GFP-Wnt3a转染猪胰腺干细胞,在经G418抗生素压力筛选、纯化得到稳定表达Wnt3a猪胰腺干细胞株。经检测,该细胞稳定携带Wnt3a基因且呈绿色荧光蛋白阳性表达。通过细胞群体倍增生长曲线测定、细胞周期、Brd U标记、QRT-PCR、Western blotting等方法分析显示,稳定表达Wnt3a猪胰腺干细胞具有典型间充质干细胞和胚胎干细胞的部分生物学特性并促进细胞增殖,同时表达胰腺干细胞相关标记。利用双荧光素酶报告系统和蛋白免疫印迹方法,发现Wnt3a激活经典Wnt信号通路的β-catenin表达水平。利用流式细胞术和线粒体膜电位检测,发现经典Wnt信号通路具有保护线粒体膜电位的功能、引起氧化应激水平降低;而当加入Dkk1抑制Wnt通路后,其结果与Wnt3a超表达正好相反。通过流式细胞仪检测细胞凋亡发现,抑制Wnt通路引起细胞凋亡率上升,而稳定表达Wnt3a猪胰腺干细胞的凋亡率明显降低(前者凋亡率是后者的4倍)。该结果揭示稳定表达Wnt3a猪胰腺干细胞通过激活β-catenin抑制猪胰腺干细胞凋亡。2.Dox诱导Wnt3a表达促进猪胰腺干细胞增殖将Wnt3a基因克隆至p CDNA4T/O成功构建诱导表达载体p CDNA4T/O-Wnt3a。将质粒p CDNA6T/R和p CDNA4T/O-Wnt3a共同转染猪胰腺干细胞,经博莱霉素和杀稻瘟菌素抗生素筛选得到Dox诱导Wnt3a表达猪胰腺干细胞,且Dox诱导绿色荧光蛋白表达。应用免疫荧光、QRT-PCR、流式细胞术、Western blotting等方法分析显示,Dox诱导Wnt3a表达的猪胰腺干细胞受Dox时间和剂量调控,并在细胞上清液中检测到有分泌蛋白-Wnt3a。Dox诱导Wnt3a表达猪胰腺干细胞增殖和分化相关标记:c-Myc、PCNA、PDX1和Glut2。通过细胞周期、Brd U标记和蛋白免疫印迹等方法分析显示,Dox诱导Wnt3a表达,通过c-Myc和PCNA蛋白表达水平升高促进细胞增殖;而当加入Dkk1后通过下调β-catenin蛋白表达水平抑制细胞增殖。该结果揭示Dox诱导Wnt3a表达,激活β-catenin靶向c-Myc和PCNA蛋白表达水平升高促进细胞增殖。该系统为研究Wnt3a调控胰腺干细胞的自我更新分子机制提供了理想细胞模型和技术平台。3.诱导自噬促进猪胰腺干细胞增殖将慢病毒载体p CAG-GFP-LC3和辅助质粒p VSV-G及p SPAX2转导293T细胞,获取目的基因(GFP-LC3)慢病毒病毒液。将目的基因病毒液转导猪胰腺干细胞,经嘌呤霉素抗生素压力筛选得到稳定表达自噬标记LC3的猪胰腺干细胞株。经PCR、Western blotting和流式细胞术检测,该细胞稳定携带LC3基因且呈绿色荧光蛋白表达阳性。经免疫荧光染色分析,该细胞表达间充质干细胞标记CD90、Vimentin,表达细胞增殖标记PCNA、c-Myc,同时表达胰腺干细胞分化标记PDX1和自噬溶酶体底物标记p62。应用血清饥饿、氯喹、血清饥饿+氯喹和正常对照分别刺激表达自噬标记LC3的猪胰腺干细胞,激光共聚焦技术分析评价其对自噬小体的影响,结果发现血清饥饿诱导猪胰腺干细胞自噬,而氯喹显着抑制自噬。进一步利用流式细胞仪分析细胞周期和Brd U标记细胞分析发现,诱导自噬引起猪胰腺干细胞细胞周期S期细胞比例升高、促进细胞增殖,而抑制自噬则引起猪胰腺干细胞增殖减缓。该结果揭示一定程度诱导自噬促进猪胰腺干细胞增殖,自噬发生可能决定猪胰腺干细胞的自我更新与分化的命运。该研究为进一步阐明Wnt3a如何通过调节自噬、调控胰腺干细胞自我更新的分子机制等研究提供了理想的细胞模型平台。(本文来源于《西北农林科技大学》期刊2015-05-01）
猪胰腺论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
糖尿病是一种代谢类疾病,又称高血糖症,表现为多食、多尿、多饮、体重减少。长期的高血糖引起机体多个组织器官的损伤,尤其是眼、肾、心脏、血管和神经等的功能障碍。胰岛β细胞损伤是糖尿病的症结所在。猪的胰腺干细胞(Pocine Pancretic Stem Cells,pPSCs)是从胎猪胰腺中分离出来的一种成体干细胞,在细胞中转入大T载体形成永生化细胞系,实验室先前的研究证明该细胞经化学小分子诱导可分化为胰岛素分泌细胞。又因猪的基因组以及胰岛素的结构与人的相似性,所以研究pPSCs对未来糖尿病的临床治疗具有深远的意义。SerpinB1是一种蛋白酶抑制剂,通过抑制蛋白酶活性缓解由炎性反应所引起的组织损伤。有研究表明,肝的胰岛素抵抗促进了SerpinB1的分泌,作用于胰腺促进胰岛β细胞的增殖,并且这一反应与其蛋白酶抑制剂活性相关。干细胞的自我更新和分化受到机体内多种细胞因子的调控,胰腺干细胞作为一种成体干细胞,SerpinB1对成体干细胞-猪胰腺干细胞的影响目前仍不清楚。本实验探究了SerpinB1对pPSCs中影响及作用机理。通过超表达和干扰pPSCs中SerpinB1的表达,一方面证实超表达SerpinB1可以促进pPSCs的增殖,另一方面发现SerpinB1在pPSCs诱导分化后期表达量增加,干扰SerpinB1影响了pPSCs的诱导分化效率,不利于胰岛素分泌细胞的形成。本实验为pPSCs的增殖机制提供了理论依据,另外为体外高效的获得胰岛素分泌细胞提供了新的思路和手段。1.SerpinB1促进pPSCs的增殖首先,通过运用qRT-PCR(实时荧光定量)对pPSCs中的SerpinB1的mRNA水平进行检测发现,SerpinB1在pPSCs中大量表达。随后一方面运用shRNA干扰SerpinB1在细胞中的表达,另一方面使细胞超表达SerpinB1。通过CCK-8检测发现干扰SerpinB1使细胞的活性降低,超表达SerpinB1增强了细胞活性。随后的EdU、流式细胞术周期检测以及qRT-PCR结果显示,与正常的细胞相比,干扰SerpinB1后细胞的EdU阳性率明显降低,处于S期的细胞比率下降,并且细胞中CDK2、PCNA以及CyclinD1的mRNA表达水平显着降低,说明SerpinB1促进pPSCs进入S期而促进pPSCs的增殖。Western blotting检测蛋白水平结果显示,超表达SerpinB1激活了STAT3、CDK2、和CyclinD1蛋白水平的表达,抑制了P53和P21的表达。所以我们推测SerpinB1通过STAT3信号通路促进pPSCs的增殖。2.SerpinB1促进pPSCs诱导分化成胰岛素分泌细胞首先,我们运用两步诱导法诱导pPSCs形成胰岛素分泌细胞,qRT-PCR和Western blotting的检测结果显示胰岛素分泌细胞中SerpinB1的表达水平显着升高。随后分别在诱导1d、3d、9d取样进行Western blotting检测发现,SerpinB1在整个诱导过程中的表达逐渐升高。其后,分别对干扰和超表达SerpinB1的pPSCs进行诱导,与对照组相比,发现干扰SerpinB1的表达后,诱导形成的胰岛素分泌细胞在悬浮诱导培养基中聚团松散不致密,培养基中存在大量悬浮的零散细胞,聚团后的细胞不易贴壁,细胞迁出率低,DTZ和Insulin染色显色不明显,在mRNA水平低表达Insulin、NeuroD、PDX1、Glut-2、Nkx6.1和MafA,并且ELISA检测发现,高糖刺激反应不灵敏。超表达SerpinB1后,在mRNA水平,Insulin、NeuroD、PDX1、Glut-2、Nkx6.1和MafA的表达明显升高,胰岛素分泌量显着性的增加。据此我们推测,SerpinB1影响了pPSCs向胰岛素分泌细胞的诱导效率。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
猪胰腺论文参考文献
[1].李雪成,牛云超,吕育芝,刘伟,崔成都.不同日龄五指山猪胰腺胰岛的组织学及免疫组织化学研究[J].延边大学农学学报.2018
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[3].杨泓.叶酸对猪胰腺干细胞增殖及向胰岛素分泌细胞分化的影响[D].西北农林科技大学.2018
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[6].胡淑娴.miR-375通过靶向PDK1抑制胎猪胰腺干细胞的增殖和分化[D].西北农林科技大学.2016
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[8].肖靖.猪胰腺磷脂酶A_2在无孢黑曲霉SH-2中表达研究[D].华南理工大学.2015
[9].吕育芝.五指山猪胰腺胚后发育的形态学观察[D].延边大学.2015
[10].韩伟.Wnt3a调控猪胰腺干细胞增殖的分子机理[D].西北农林科技大学.2015