导读:本文包含了噬菌体展示抗原论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:噬菌体展示系统,糖尿病,自身抗体,抗原表位
噬菌体展示抗原论文文献综述
刘尧,林骏,梁永羿,山云,王洪涛[1]（2019）在《噬菌体展示系统筛选糖尿病相关抗原蛋白及应用效果评价》一文中研究指出目的用噬菌体展示系统筛选与糖尿病相关的自身抗原新表位,表达新抗原肽段并评价其在糖尿病诊断中的应用效果。方法以Ⅰ型糖尿病血清作为靶分子,对Ph.D.-12噬菌体肽库进行淘选,测序淘选的噬菌体并用ELISA检测噬菌体与靶分子的结合效果,BLAST分析特异性最好的表位与糖尿病的相关性,选择合适的目的基因合成重组质粒,用Expi293细胞表达新抗原肽段并检测该抗原与临床血清的特异结合效果。结果共完成2418个噬菌体单克隆的测序,淘选出93种表位序列,11种具有代表性的表位中测序超过200次的有4种,对特异性最强的表位序列"-GTFLFSLCAAVY"进行分析后选择mTOR相关蛋白mEAK-7作为目的基因,抗原肽段与临床血清的特异性结合效果为:Ⅰ型糖尿病阳性率为17%,Ⅱ型糖尿病阳性率为4%。结论 mEAK-7蛋白对糖尿病血清具有一定的抗原特异性,该基因与糖尿病可能有相关性,具有很好的研究价值。(本文来源于《中国医药生物技术》期刊2019年06期）
田栢会,易乐,王习文,李颂,付世杰[2]（2019）在《噬菌体展示禽流感病毒抗原变异性基因片段文库的构建》一文中研究指出构建T7噬菌体展示禽流感病毒抗原变异性基因片段文库.首先,从Gene Bank中查找筛选禽流感病毒抗原变异性基因,将其截短、修饰、简并后得到禽流感病毒抗原变异性基因微阵列.其次,将合成的禽流感病毒抗原变异性基因片段文库扩增、酶切,链接到双酶切后的T7噬菌体载体基因上,构成重组噬菌体DNA.最后,重组噬菌体DNA经体外包装和扩增,得到T7噬菌体展示文库,并进行T7噬菌体展示文库滴度、重组率和免疫活性测定.实验结果表明,从Gene Bank中查找、筛选、剪切和修饰共获得96 258条序列构建T7噬菌体展示文库,原始文库滴度为3.6×107个菌落/mL,重组率大于90%.用禽流感病毒H5N1抗体进行捕获,经聚合酶链式反应(PCR)鉴定,得到理想目的条带,证明噬菌体表面展示蛋白具有抗原活性,可用于禽流感病毒感染患者的快速检测及抗原表位筛选.(本文来源于《吉林大学学报(理学版)》期刊2019年04期）
何泊宁[3]（2019）在《牛多杀性巴氏杆菌分离鉴定及应用噬菌体展示技术筛选TbpA蛋白抗原表位》一文中研究指出多杀性巴氏杆菌是动物机体上呼吸道和眼部黏膜的常在菌群,当机体受到应激或其他呼吸性病原体感染时,常发生内源性感染。牛巴氏杆菌病多发于运输应激的牛群或者犊牛群中。现有的牛出败灭活疫苗免疫原是荚膜血清型B型的多杀性巴氏杆菌,然而大量的研究表明A型多杀性巴氏杆菌引起的牛呼吸道感染较为普遍,不同荚膜血清型间的交叉保护效果并不理想。本研究从黑龙江省两个规模化奶牛场发生严重呼吸道感染的病死牛肺脏和患病牛鼻拭子中分离鉴定致病菌,筛选多杀性巴氏杆菌转铁蛋白结合蛋白TbpA的抗原表位,对于研制高效疫苗防治该病具有重要的现实意义。首先,无菌采集病死牛的肺脏和患病牛鼻拭子,进行病原分离培养、染色镜检及生化试验、细菌16S rDNA及OmpH基因PCR鉴定,应用PCR方法确定分离株的荚膜血清型和毒力因子。结果表明,两个分离株WC16551、LY01均为荚膜血清型A型多杀性巴氏杆菌,药敏试验显示对恩诺沙星、环丙沙星高度敏感。检测22种毒力因子,两株菌均携带19种毒力因子(oma87、fimA、ompA、tonB、exbD、Fur、hgbA、sodC、PmHAS、TbpA、hsf-2、hsf-1、PfhA、ptfA、sodA、nanH、plpB、exbB和tadD),有叁种未被检出(toxA、hgbB和nanB)。LD_(50)分别为:2.3×10~8 CFU/mL和2.08×10~5 CFU/mL。其次,构建pET-32a-TbpA蛋白原核表达质粒,蛋白诱导表达,Western Blot检测;用Ni-NTA对蛋白进行纯化,蛋白复性及浓缩,选用ISA206佐剂制备免疫原,免疫小鼠,制备高免血清,随后进行抗体纯化。结果表明,目的蛋白大小为104 KDa,当IPTG浓度为0.1 mM时37℃诱导5 h表达量较多,以包涵体形式存在,目的蛋白具有较好的抗原性。第叁,构建十五肽库质粒,电转入TG1感受态中,制备噬菌体随机十五肽库,检测肽库多样性及库容量,计算噬菌体滴度,进行叁次淘洗,将筛选出噬菌体进行测序,与TbpA蛋白进行同源性分析,最终获得TbpA蛋白抗原表位。结果表明,成功构建了十五肽库质粒和随机肽库,库容量为1.32×10~9 CFU/mL,经多抗淘洗筛选,确定G_(103)和W_(232)两个模拟结合位点,抗原表位主要分布于95-265、573-765蛋白序列中。综上所述,本研究确定了发病牛的病原为荚膜血清型A型多杀性巴氏杆菌,成功筛选出TbpA蛋白抗原表位,为研制牛多杀性巴氏杆菌病基因工程亚单位疫苗奠定了基础。(本文来源于《黑龙江八一农垦大学》期刊2019-06-01）
王艳梅[4]（2019）在《猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白中和性抗原表位的噬菌体展示及其抗原性研究》一文中研究指出猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome PRRS)是由猪繁殖与呼吸病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus PRRSV)引起的一种高度传染性疾病。该病主要是以预防为主,疫苗接种是预防该病的首要措施。GP5蛋白是PRRSV重要的结构蛋白,存在六个重要的抗原决定簇,可以诱导中和抗体的产生,一直是疫苗研发的重要靶蛋白。中和性B细胞表位已经被确认为该病毒的中和性抗原区域。本研究旨在探究中和性B细胞表位诱导机体产生中和抗体及其作用。首先以合成中和性B细胞表位对7个猪场经不同商品化疫苗免疫的430份猪免疫临床血清进行检测,检测表明不同猪场的血清抗体水平阳性百分比在86.11%~98.15%之间。以中和性B细胞表位为目的展示序列,分别与靶向肽DC3pep、非靶向肽SCRMpep进行融合,通过噬菌体展示技术构建重组噬菌体M13-DC3pep-GP5-B和M13-SCRMpep-GP5-B,以临床PRRSV阳性血清进行western blot分析二者的免疫反应原性。以1.0×10~(13)pfu/mL的重组噬菌体M13-DC3pep-GP5-B、M13-DC3pep-GP5-B混合弗氏佐剂和M13-SCRMpep-GP5-B免疫小鼠,对小鼠血清进行特异性抗体检测,表明重组噬菌体M13-DC3pep-GP5-B和M13-SCRMpep-GP5-B均具有良好的反应原性;M13-DC3pep-GP5-B混合弗氏佐剂免疫组的小鼠血清有特异性抗体产生,抗体水平在第四周达到最高为0.94;免疫组M13-DC3pep-GP5-B小鼠抗体水平在第六周达到最高为0.93,免疫组M13-SCRMpep-GP5-B的抗体水平在第六周达到最高为0.634,免疫组M13-DC3pep-GP5-B的特异性抗体水平均高于免疫组M13-SCRMpep-GP5-B,二者差异显着(p<0.05)。将重组噬菌体M13-DC3pep-GP5-B、M13-DC3pep-GP5-B混合氢氧化铝佐剂和M13-SCRMpep-GP5-B以1.0×10~(13)pfu/mL的剂量免疫断奶仔猪,对仔猪血清进行特异性抗体检测,以临床分离PRRSV毒株对仔猪血清进行中和试验,表明M13-DC3pep-GP5-B混合氢氧化铝佐剂免疫组的抗体水平在末次免疫后第四周达到最高为0.687,且其抗体水平显着高于免疫M13-DC3pep-GP5-B组和M13-SCRMpep-GP5-B组(p<0.05);免疫组M13-DC3pep-GP5-B的特异性抗体水平高于免疫组M13-SCRMpep-GP5-B,无显着差异(P>0.05);但是诱导机体产生的中和抗体水平较低,免疫血清只在低稀释度时对PRRSV呈现中和活性。为了进一步发现并验证猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)保护性抗原GP5蛋白羧基端新的中和性表位,本研究运用生物信息学软件预测PRRSV GP5蛋白羧基端的抗原性,全基因合成GP5蛋白羧基端168-198位氨基酸的编码序列,构建了重组噬菌体M13-GP5168-198aa,以临床PRRSV阳性血清进行western blot分析重组噬菌体表面展示的GP5 168-198aa多肽的免疫反应原性。以1.0×10~(13)pfu/mL重组噬菌体混合氢氧化铝佐剂制备的免疫抗原,按照灭活疫苗免疫程序肌肉注射免疫PRRSV抗体阴性断乳仔猪,以临床分离PRRSV毒株进行中和试验。结果显示:以临床阳性血清进行Western blot分析表明重组噬菌体表面展示的GP5168-198aa多肽具有免疫反应原性;免疫仔猪诱导仔猪产生的中和性抗体在第六周达到最高,中和滴度为1:10.08。综上,人工合成PRRSV GP5蛋白的中和性B细胞表位可用于临床猪血清PRRSV抗体的检测;运用噬菌体展示技术展示了中和性B细胞表位,免疫断奶仔猪,诱导机体产生的中和抗体水平较低,免疫血清只在低稀释度时对PRRSV呈现中和活性;生物学软件预测GP5蛋白羧基端的抗原表位进行展示,免疫断奶仔猪,可以诱导仔猪产生中和性抗体,仔猪免疫血清在细胞水平上对PRRSV呈现良好的中和作用。为PRRSV GP5新型多表位疫苗的开发奠定了基础。(本文来源于《吉林大学》期刊2019-06-01）
胡云霏[5]（2017）在《通过噬菌体展示技术结合亚细胞定位方法筛选细菌表面保护性抗原》一文中研究指出寻找细菌表面蛋白作为潜在的疫苗或者药物作用靶点研究对象,可以用于预防和治疗相应的细菌性疾病。本论文中,我们以红斑丹毒丝菌(革兰氏阳性菌)和A型猪巴氏杆菌(革兰氏阴性菌)为研究对象,建立一种新的通过噬菌体展示技术结合亚细胞定位筛选细菌表面保护性抗原的方法。该方法最大的优势在于细菌表面保护性抗原筛选的准确性和高效性,最大的创新来自于噬菌体展示与亚细胞定位技术的结合。我们首先改进了模拟抗原表位噬菌体筛选方法:混合噬菌体与抗体,保持两者在溶液状态下的自由结合,提高目的噬菌体与抗体的结合效率,再将抗体-噬菌体复合物快速固定在包被了SPA(Staphylococcal protein A)和SPG(Streptococcal protein G)的酶标孔中;经洗涤和洗脱后,将筛选的噬菌体分装到10块96孔板中扩增(~1000倍稀释),显着降低了噬菌体在扩增中多样性丢失的概率,极大地提高了所获得的模拟抗原表位信息的准确性和丰富性。然后使用改进的噬菌体筛选方法分别对抗红斑丹毒丝菌和A型猪巴氏杆菌表面分子多克隆抗体进行两轮筛选,并从获得各细菌对应的12肽和环7肽噬菌体中,各随机挑取100个噬菌体进行测序、阳性验证等相关分析,最后获得两种细菌各自对应的模拟抗原表位序列。将获得的红斑丹毒丝菌模拟抗原表位序列,与该细菌的全基因组进行序列比对,并将获得的高相似性蛋白做亚细胞定位分析,从中筛选出模拟抗原表位可能对应的表面蛋白。对于猪巴氏杆菌,按以上同样的方式进行分析,同时,为了获得目前流行毒株间有交叉保护性作用的抗原,本文从A型猪巴氏杆菌模拟抗原表位中去筛选A、D型菌株可能共同的保护性抗原。总共获得了18个红斑丹毒丝菌表面蛋白信息,其中有4个为已经报道的表面蛋白(3个为保护性抗原),对另外14个新发现的蛋白作基因原核克隆表达和免疫原性分析,最终从11个成功鉴定的蛋白中发现了9个新的保护性抗原,分别为CwpA、Plp、CbpA、Bga、Bml、Neu、CwpB、Da和Atsp。在猪巴氏杆菌中,总共获得14个A、D型菌株共同表面蛋白信息,其中有7个为已经报道的蛋白(5个为保护性抗原),对另外7个新的蛋白进行基因原核克隆表达和免疫原性分析,最终从6个成功鉴定的蛋白中发现了5个新的A、D型猪巴氏杆菌共同保护性抗原,分别为LppC、TonB-d、pTonB、Omabp和Tp。两个细菌保护性抗原筛选准确性高,且筛选效率均超过80%,相比于反向疫苗学和蛋白组学方法(筛选效率均<30%)显示了极高的筛选效率。为评价筛选蛋白的相关特性,以新发现的红斑丹毒丝菌表面蛋白为研究对象,分别进行全细胞ELISA检测和免疫印迹分析,再结合已报道表面蛋白的信息,发现各模拟抗原表位出现的概率与其对应蛋白在细菌表面表达量的高低,或是该蛋白免疫原性高低成较好的正相关性。在9个新发现的红斑丹毒丝菌保护性抗原和已知的3个保护性抗原中,有10个的模拟抗原表位信息均出现在两个不同的噬菌体筛选肽库中,并且有3对序列分别筛选自不同的肽库(ADKPRVDTTTYN与NADKPTE、LQASAKTMHGTI与GAKWMSQ、AHRYIDAQIDRR与LALDRRD),它们分别对应Bml、Plp、CwpB叁个蛋白的同一氨基酸区域,显示了本实验获得模拟抗原表位信息的准确性。对红斑丹毒丝菌新鉴定的蛋白作进一步分析,意外发现两种蛋白酶(Bga和Da)显示了较好的保护性抗原特性,但它们的功能可能并不只是参与细菌新陈代谢,可能还与细菌在宿主体内生存和致病有关。Bga(β半乳糖苷酶)可能还与细菌的致病机理有关;Da属于氨肽酶家族,其体内外表达存在差异,功能则还可能与细菌在宿主体内的感染和生存有关;另外还发现Hya在细菌表面表达量很高,但却不是保护性抗原。这些信息为相应蛋白的功能分析、细菌致病机理研究提供了新的线索。因此,本论文成功建立了一种新的通过噬菌体展示技术结合亚细胞定位筛选细菌表面保护性抗原的策略,相比于反向疫苗学和蛋白组学,显示了极高的准确性和筛选效率,具有操作简便、适用性更强的特点,一方面成功将噬菌体展示技术与细菌表面保护性抗原的筛选连接起来,另一方面也为深入的表面蛋白功能分析、细菌致病机理的研究提供了切入点。(本文来源于《湖南农业大学》期刊2017-06-01）
刘园园[6]（2016）在《1 特异性结合DON抗原—抗体免疫复合物纳米抗体的淘选、鉴定及表达 2 基于噬菌体展示纳米抗体的定量免疫PCR检测Bt蛋白Cry1Ac方法的建立》一文中研究指出第一部分相对于竞争型免疫分析体系,非竞争型免疫分析方法具有操作简单、灵敏度高以及检测范围广等优点。然而,对于小分子物质而言,由于小分子物质的分子量及结合表位较小,难以直接被两个常规抗体同时结合,因此目前小分子物质的免疫分析体系大多以竞争型为主。本研究以食品中常见的真菌毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)为小分子物质的研究模型,在形成DON抗原-抗体免疫复合物的基础上,投入天然噬菌体展示纳米抗体库,亲和淘选可特异性结合DON抗原-抗体复合物的噬菌体展示纳米抗体,经Phage-ELISA验证后,开展纳米抗体的可溶性原核表达,为建立基于纳米抗体的DON非竞争型免疫分析体系提供了一种新的途径和有效探索。本研究取得的主要实验结果如下:1.可特异性结合DON抗原-抗体免疫复合物纳米抗体的亲和淘选及鉴定以DON为研究对象,DON抗原-抗体免疫复合物作为靶标,经过四轮亲和淘选,从驼源天然噬菌体展示纳米抗体库中首次获得4种可特异性结合DON抗原-抗体免疫复合物的纳米抗体,经DNA测序分析后,分别命名为P-1、P-19、P-26、P-46,Phage-ELISA结果显示,上述纳米抗体对DON抗原-抗体复合物具有良好的结合特异性;建立了基于噬菌体展示纳米抗体(P-26)的非竞争型免疫分析DON曲线,结果显示:当DON标准品的浓度在0~500 ng/mL区间时,投入了所获噬菌体展示纳米抗体的对应板孔,其OD值随着加入的DON浓度增加而相应地提高,表明所获得的噬菌体展示纳米抗体对DON抗原-抗体复合物具有较好的结合响应度,但未呈现典型的线性曲线。2.可特异性结合DON抗原-抗体免疫复合物纳米抗体的原核表达通过分子克隆技术,提取P-1、P-19、P-26、P-46的VHH编码基因,将编码基因克隆至pET25b(+)原核表达载体上,经DNA测序验证,成功构建了重组表达载体pET25b-VHH-P-1、pET25b-VHH-P-19、pET25b-VHH-P-26和pET25b-VHH-P-46,并转化至E.coli Rosetta细胞;在1%葡萄糖,0.05 mM IPTG下诱导表达8 h,经镍柱纯化,并用50 Mm咪唑洗脱后,获得4种可溶性的纳米抗体N-1、N-19、N-26、N-46。建立了基于可溶性纳米抗体(N-26)的DON非竞争型免疫分析反应曲线,当DON标准品的浓度在8~100 ng/mL区间时,投入了纳米抗体的对应板孔,其OD值随着加入的DON浓度增加而相应地提高,表明所获得的可溶性纳米抗体对DON抗原-抗体复合物具有较好的结合响应度,为下一步开展DON的非竞争型免疫分析体系的建立提供了重要研究材料及有效地探索。第二部分Cry1Ac是一种常见的Bt(Bacillus thuringiensis,Bt)蛋白,现已广泛应用于抗虫转基因作物,比如大豆、棉花、水稻、小麦等。随着众多转基因农作物的逐渐商业化,市场上的转基因食品日益增多,同时转基因食品的安全性也逐渐受到大众的关注及重视,因此对食品中的转基因成分进行检测就显得十分重要。目前转基因成分(Genetically modified ingredients,GMO)的检测主要包括基于蛋白质检测的免疫分析以及基于核酸检测的PCR(Polymerase chain reaction,PCR)分析两大类。免疫分析具有特异性高、操作简单以及可高通量筛选等优点,然而由于其自身信号扩增体系的局限性,也存在着灵敏度不高、假阳性较多等缺陷。本研究在获得可特异性结合Cry1Ac蛋白的噬菌体展示纳米抗体的基础上,将免疫分析与核酸分析的技术优势进行综合,建立基于噬菌体DNA信号扩增体系的免疫PCR分析Cry1Ac蛋白方式,主要实验结果如下:1.针对抗Cry1Ac噬菌体展示纳米抗体编码基因的CDR3区设计了特异性的PCR扩增引物,成功地扩增了纳米抗体的CDR3区(98 bp),为噬菌体展示纳米抗体的特异性信号扩增奠定了基础。2.将抗Cry1Ac单克隆抗体(8A8)作为捕获抗体,抗Cry1Ac噬菌体展示纳米抗体(P-72)作为检测抗体,建立了转基因蛋白Bt-Cry1Ac的免疫PCR检测方法。该方法的拟合标准曲线结果显示,其线性相关系数为0.9968,线性范围为0.001~100 ng/mL,最低检测限为0.094 pg/mL;该方法对于Cry1Ac的同源蛋白Cry1Ab的交叉反应率为3.4%,对其它杂类蛋白质无交叉反应,具备良好的检测特异性;加标回收实验结果显示,该方法用于检测Bt-Cry1Ac的加标回收率为78.81~146%,变异系数CV(%)范围6.13~21.92,表明该方法具有较好的准确性及重现性。(本文来源于《南昌大学》期刊2016-05-26）
王吕,熊斯诚,邹旭强,陈超超,邵辉锋[7]（2015）在《赭曲霉毒素A模拟抗原表位及噬菌体展示酶联免疫吸附分析法的建立》一文中研究指出以驴抗鼠二抗包被微孔板,以捕获方式包被抗赭曲霉毒素A(OTA)单克隆抗体,利用噬菌体随机七肽库筛选OTA模拟抗原表位,并以其替代检测抗原,建立了基于噬菌体展示技术的酶联免疫吸附分析(Phage ELISA)检测OTA的方法。结果表明,筛选获得的模拟OTA抗原表位七肽氨基酸序列为GMSWMMA。基于模拟表位噬菌体建立的Phage ELISA方法半数抑制浓度(IC50值)为(0.15±0.02)ng/m L,检测OTA的线性范围为0.03~0.50 ng/m L,OTA的检出限为0.03 ng/m L,且Phage ELISA与其它4种常见真菌毒素(黄曲霉毒素B1、伏马毒素B1、脱氧雪腐镰刀菌烯醇及玉米赤霉烯酮)无交叉反应。大米样品OTA加标实验表明,批内加标回收率为97.0%~115.2%,批间加标回收率为107.2%~123.1%,与ELISA试剂盒检测结果比较,无显着性差异。(本文来源于《分析化学》期刊2015年06期）
贺雪姣[8]（2015）在《噬菌体展示技术筛选表皮生长因子受体抗原模拟表位》一文中研究指出结直肠癌已成为我国继肺癌、胃癌、肝癌后的第四大最常见癌症。既往研究发现,表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)在结直肠癌中常出现过表达,并进一步通过其信号转导引起肿瘤细胞增殖、血管生成、肿瘤侵袭和转移能力增强,细胞凋亡抑制,因此,EGFR已成为抗肿瘤药物的一个理想靶点。经FDA批准上市,针对EGFR抗原表位研制的单克隆抗体药物有尼妥珠单抗和西妥昔单抗。这两株单抗在治疗EGFR高表达的结直肠癌及其他肿瘤中,能专一的针对肿瘤细胞,减少对正常组织的损害,显着提高患者的生存状态。但其存在一定的不足,首先,分子量相对较大,降低了单抗药物的治疗效果,导致临床使用效果不理想。其次,价格昂贵,且在治疗过程中需长期使用,给病人及家属带来了较大的经济负担。如果能将单抗药物与其靶点结合的位点模拟出来,制成多肽疫苗,就可以避免单克隆抗体药物的不足,大大提高治疗效果,减轻患者的经济负担。模拟抗原表位的方法有两种,通过将噬菌体展示技术与传统的抗原表位分析方法相比,我认为噬菌体展示技术具有独特的优势。噬菌体展示技术是将外源蛋白基因序列插入至噬菌体外壳蛋白,随着噬菌体的重新组装将外源蛋白融合在噬菌体的表面,其在抗原表位筛选中的优点是既可识别并结合肿瘤抗原,又能感染宿主菌进行扩增。噬菌体随机肽库包含大量不同序列结构的多肽,其可以作为任何靶抗原表位的模拟肽,通过肽库对靶抗原进行筛选时,不需要空间构象,只需靶抗原就可获得具有抗原性和免疫原性的蛋白多肽,且反映了抗原结合位点的空间构像。目前该技术在肿瘤的基础研究以及治疗新技术的开发中得到广泛应用。本实验拟用尼妥珠单抗及西妥昔单抗分别作为抗EGFR的靶标蛋白,应用噬菌体随机十二肽库对其抗原表位进行探讨分析。用两株单克隆抗体药物对同一靶点抗原表位进行筛选分析,目前尚未有文献报道。拟经过叁轮噬菌体的“吸附-洗脱-扩增”的亲和筛选实验,获得与单抗特异性结合的单克隆噬菌体,进而对噬菌体提取单链DNA并测序,获得抗EGFR抗体对应抗原表位的氨基酸序列,对两株单抗获得的氨基酸序列进行分析比较。采用竞争ELISA检测方法,将筛选出高频的单克隆噬菌体与EGFR高表达的caco2细胞膜蛋白提取液竞争结合西妥昔单抗及尼妥珠单抗,进一步检测所获得的短肽与西妥昔单抗及尼妥珠单抗的亲和活性,并对两株单抗获得短肽的亲和性进行分析比较,以寻找最具亲和活性的短肽。目的1.利用噬菌体十二肽库进行生物淘洗,筛选表皮生长因子受体抗原模拟表位。2.筛选出的模拟短肽的生物活性检测。方法以尼妥珠单抗及西妥昔单抗作为抗EGFR抗原的靶分子,在噬菌体十二肽库中淘选表皮生长因子受体的抗原模拟表位,经过3轮生物淘洗后,挑选单克隆噬菌斑进行扩增,用ELISA方法检测,选择与西妥昔单抗或尼妥珠单抗亲和性较高的阳性单克隆噬菌体,对其进行扩增及测序。采用竞争ELISA的方法,对筛选出的高频噬菌体单克隆与EGFR高表达的caco2细胞膜蛋白提取液竞争结合西妥昔单抗及尼妥珠单抗。结果1.以抗EGFR的单克隆抗体药物西妥昔单抗作为靶标蛋白,利用噬菌体随机十二肽库对靶蛋白进行叁轮生物淘洗,对每轮淘洗出来的噬菌体均进行噬菌体滴度测定,测定结果可以看出,西妥昔单抗淘筛出来的噬菌体总体回收率从第一轮的(6.67×10-6)%增加到了第叁轮的(2.80×10-3)%,可见通过叁轮“吸附-洗脱-扩增”的生物淘洗,噬菌体回收率得到了富集,富集率达到了420倍。用同样的方法对尼妥珠单抗进行淘洗,对淘洗结果进行滴度测定,测定结果可以看出,尼妥珠单抗淘选出来的噬菌体总体回收率从第一轮的(8.67×10-6)%增加到了第叁轮的(1.80×10-3)%,可见尼妥珠单抗通过叁轮“吸附-洗脱-扩增”的生物淘洗,噬菌体的回收率也得到富集,富集度为208倍。2.在第叁轮测噬菌体滴度的平板中,分别随机挑选30个分隔良好的单克隆蓝斑进行扩增,扩增后行滴度测定,以扩增的单克隆噬菌体作为检测组,以噬菌体原库扩增液作阴性对照组,进行ELISA检测。在阳性结果的评价中,以单克隆噬菌体扩增液(检测组)的OD值为噬菌体原库扩增液(阴性对照)的OD值的2倍以上视为阳性。以此标准对ELISA结果进行分析,确定西妥昔单抗的阳性结果有17个,而尼妥珠单抗的阳性结果有21个,阳性率分别为56.67%和70%。这表明西妥昔单抗及尼妥珠单抗均淘筛出来了特异性结合的噬菌体。随机挑选阳性噬菌体克隆进行依赖性分析,可见随着阳性噬菌体投入量的增加,其OD值也增大,说明其存在剂量依赖性。3.对检测出来的阳性噬菌体克隆提取单链DNA,并进行DNA序列测定,找出插入噬菌体的36个碱基,并将其翻译成氨基酸,此即为噬菌体递呈的12肽序列。对17个阳性的西妥昔单抗噬菌体进行测序,有叁段短肽频率出现较高,分别为HSFKWLDSPRLR出现6次,HTSSLWHLFRST出现4次,HLFNHNKNLPKR出现3次。对21个阳性的尼妥珠单抗噬菌体进行测序,出现两段频率较高的短肽,分别为HSFKWLDSPRLR出现8次,HWKSSYVKWHNV出现5次。其中西妥昔单抗和尼妥珠单抗有一共有序列HSFKWLDSPRLR。4.在竞争ELISA实验中,EGFR高表达的caco2细胞膜蛋白提取液可以与噬菌体单克隆HSFKWLDSPRLR,HTSSLWHLFRST,HLFNHNKNLPKR竞争性结合西妥昔单抗,叁条短肽均出现不同程度的抑制。EGFR高表达的caco2细胞膜蛋白提取液与噬菌体单克隆HSFKWLDSPRLR,HWKSSYVKWHNV竞争性结合尼妥珠单抗,两条短肽均出现不同程度的抑制,且共有序列HSFKWLDSPRLR的抑制率最高。结论初步利用西妥昔单抗及尼妥珠单抗可从噬菌体随机肽库中筛选到表皮生长因子受体相关抗原表位。EGFR高表达的caco2细胞膜蛋白提取液与筛选出的抗原模拟短肽可以竞争性结合西妥昔单抗及尼妥珠单抗。短肽HSFKWLDSPRLR可作为表皮生长因子受体的抗原模拟表位,为进一步研制肿瘤疫苗奠定了基础。(本文来源于《第四军医大学》期刊2015-05-01）
贺雪姣,师建国,陈果,李晓霞[9]（2014）在《噬菌体展示技术筛选表皮生长因子受体抗原模拟表位》一文中研究指出目的利用噬菌体12肽库进行生物淘洗,筛选表皮生长因子受体(EGFR)抗原模拟表位。方法以抗EGFR的单克隆抗体药物西妥昔单抗及尼妥珠单抗为靶分子,在噬菌体12肽库中淘选表皮生长因子受体抗原模拟表位,经过3轮淘选后,选择可与西妥昔单抗及尼妥珠单抗有不同程度结合的噬菌体,对阳性产物进行克隆及测序。结果发现17个和21个阳性噬菌体分别与西妥昔单抗及尼妥珠单抗不同程度地结合;阳性克隆测序结果分别获得了3种不同的氨基酸序列。结论初步利用西妥昔单抗及尼妥珠单抗可从噬菌体展示的随机肽库中筛选到表皮生长因子受体相关抗原表位。(本文来源于《山西医科大学学报》期刊2014年11期）
袁娜,辛国宏,左笑笑,黄尚科,王莹[10]（2014）在《联合应用噬菌体展示技术与重组cDNA表达文库血清学分析技术筛选肺癌早期诊断相关抗原》一文中研究指出目的:筛选有效的人肺癌早期诊断相关抗原,以提高肺癌的早期诊断水平。方法:构建人早期肺癌cDNA T7噬菌体展示文库;筛选出差异性噬菌体克隆,测序后进行生物信息学分析;最后利用重组cDNA表达文库血清学分析(SEREX)技术对8个差异性噬菌体克隆构建肺癌相关抗原微阵列,分别与肺癌患者和正常人的血清反应,评价各个抗原单独应用与联合应用诊断肺癌的价值。结果:构建的肺癌T7噬菌体展示文库的滴度为3.71×10~6 pfu/ml,噬菌体数为1.11×10~6 pfu。cDNA文库的重组率超过90%。筛选出9个差异性噬菌体克隆,测序后发现A42与A83抗原的基因序列相同。生物信息学分析发现8个抗原的基因均为已知基因,除了A64以外,其余与肿瘤均有明确的关系。8个抗原与肺癌患者血清的阳性反应率均高于与正常人血清的阳性反应率,差异均具有统计学意义(均P<0.05)。在特异性不低于60%的情况下,各个抗原单独用于肺癌诊断时的灵敏性均低于70%。各个抗原的曲线下面积均低于0.8。而复合抗原诊断肺癌的灵敏性为90.8%,特异性为94.1%,曲线下面积高达0.969。结论:本研究成功构建了库容量大、重组率高、代表性好的人肺癌T7噬菌体展示文库,并筛选到8个肺癌相关抗原。由这8个抗原组成的复合抗原诊断肺癌的灵敏性与特异性均在90%以上,诊断价值较高。(本文来源于《浙江大学学报(医学版)》期刊2014年04期）
噬菌体展示抗原论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
构建T7噬菌体展示禽流感病毒抗原变异性基因片段文库.首先,从Gene Bank中查找筛选禽流感病毒抗原变异性基因,将其截短、修饰、简并后得到禽流感病毒抗原变异性基因微阵列.其次,将合成的禽流感病毒抗原变异性基因片段文库扩增、酶切,链接到双酶切后的T7噬菌体载体基因上,构成重组噬菌体DNA.最后,重组噬菌体DNA经体外包装和扩增,得到T7噬菌体展示文库,并进行T7噬菌体展示文库滴度、重组率和免疫活性测定.实验结果表明,从Gene Bank中查找、筛选、剪切和修饰共获得96 258条序列构建T7噬菌体展示文库,原始文库滴度为3.6×107个菌落/mL,重组率大于90%.用禽流感病毒H5N1抗体进行捕获,经聚合酶链式反应(PCR)鉴定,得到理想目的条带,证明噬菌体表面展示蛋白具有抗原活性,可用于禽流感病毒感染患者的快速检测及抗原表位筛选.
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
噬菌体展示抗原论文参考文献
[1].刘尧,林骏,梁永羿,山云,王洪涛.噬菌体展示系统筛选糖尿病相关抗原蛋白及应用效果评价[J].中国医药生物技术.2019
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[4].王艳梅.猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白中和性抗原表位的噬菌体展示及其抗原性研究[D].吉林大学.2019
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[6].刘园园.1特异性结合DON抗原—抗体免疫复合物纳米抗体的淘选、鉴定及表达2基于噬菌体展示纳米抗体的定量免疫PCR检测Bt蛋白Cry1Ac方法的建立[D].南昌大学.2016
[7].王吕,熊斯诚,邹旭强,陈超超,邵辉锋.赭曲霉毒素A模拟抗原表位及噬菌体展示酶联免疫吸附分析法的建立[J].分析化学.2015
[8].贺雪姣.噬菌体展示技术筛选表皮生长因子受体抗原模拟表位[D].第四军医大学.2015
[9].贺雪姣,师建国,陈果,李晓霞.噬菌体展示技术筛选表皮生长因子受体抗原模拟表位[J].山西医科大学学报.2014
[10].袁娜,辛国宏,左笑笑,黄尚科,王莹.联合应用噬菌体展示技术与重组cDNA表达文库血清学分析技术筛选肺癌早期诊断相关抗原[J].浙江大学学报(医学版).2014