反馈环路论文-安怡斐

导读:本文包含了反馈环路论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:胃癌,耐药,肿瘤干性,SIRT1

反馈环路论文文献综述

安怡斐^[1]（2019）在《去乙酰化酶SIRT1激活AMPK/FOXO3正反馈环路调控胃癌耐药及肿瘤干性的研究》一文中研究指出研究背景胃癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率在各种癌症中均位列前五位。包括我国在内的东亚地区是胃癌的高发区,发病率高达49.2人/10万人。我国70%-90%的胃癌患者就诊时即已为进展期胃癌,并可能伴有周围侵犯或转移,单纯手术切除无法治愈,因此化疗已成为胃癌综合治疗的重要部分。目前胃癌化疗方案多以铂类、氟尿嘧啶等药物为主,但由于存在胃癌细胞耐药,严重影响了化疗的疗效及患者预后。迫切需要探究化疗耐药机制以改善药物反应。而肿瘤干细胞被视为肿瘤耐药和复发的根本。因此,深入研究肿瘤干细胞有助于减少肿瘤干性进而增强肿瘤化疗敏感性,为胃癌治疗开辟新途径。去乙酰化酶SIRT1属于Ⅲ型组蛋白去乙酰化酶,与Zn2+依赖性去乙酰化酶不同,SIRT1发挥作用需要依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide-Adenine Dinucleotide,NAD)。通过去乙酰化组蛋白或非组蛋白底物,SIRT1在代谢、自噬、免疫及肿瘤等诸多生物学过程中发挥重要作用。然而由于肿瘤的类型以及信号通路不同,SIRT1在肿瘤中的作用还存在争议。我们先前的研究发现SIRT1在胃癌组织中呈低表达。SIRT1通过抑制转录因子NF-κB,降低重要的细胞周期调节蛋白Cyclin D1的表达,诱导胃癌细胞停滞于G1期,从而抑制胃癌的发生。随后发现SIRT1可以通过与转录因子c-JUN结合,使其去乙酰化,失去转录活性,进而抑制ARHGAP5的表达,遏制胃癌的侵袭和转移。然而SIRT1在胃癌耐药和干性中的作用机制尚未阐明。研究发现,缺氧抑制了非小细胞肺癌小细胞(NSCLC)中SIRT1的表达,从而抑制了下游靶分子AMPK的激活过程,阻止线粒体凋亡,增强NSCLC细胞对顺铂和多柔比星耐药,且在体应用SIRT1激动剂能够增强肿瘤细胞的化疗敏感性。Sun等人的研究表明,去乙酰化酶SIRT1在骨髓增生异常综合征恶性增殖的造血干细胞/祖细胞中表达降低,进而抑制TET2的酶活性,促进细胞肿瘤干性的维持,使得患者对传统治疗药物抵抗。在乳腺癌中,SIRT1调控的信号通路能够抑制细胞干性重要转录因子KLF4的活性,诱导肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,遏制肿瘤的复发和转移。据此,我们对SIRT1在胃癌细胞的耐药和肿瘤干性过程中的作用展开初步研究,发现SIRT1参与了胃癌细胞耐药和肿瘤干性的调控过程,接下来将深入探究去乙酰化酶SIRT1在调节胃癌耐药和肿瘤干性中的具体作用机制。研究目的深入研究SIRT1对胃癌化疗耐药和肿瘤干性过程的调控作用及具体机制,为减少胃癌化疗耐药和复发提供理论依据和分子靶点。研究方法和结果1.SIRT1的表达下调与胃癌患者的预后不良相关。组织芯片结果表明SIRT1在胃癌组织中表达下调,Cox回归分析显示SIRT1的表达水平与胃癌患者的存活显着相关,生存分析显示SIRT1表达较高的患者总生存期较长。利用Kaplan-Meier Plotter数据库(218878_s_at)分析胃癌患者的生存期,发现高表达SIRT1的胃癌患者总生存期和首次进展生存期都较长,且在接受5-FU化疗的胃癌患者中SIRT1水平与总体存活或首次进展间隔之间也有相关性。说明SIRT1低表达与胃癌预后不良相关,同时提示SIRT1与胃癌患者的药物反应性有关。2.SIRT1抑制胃癌细胞耐药。我们利用SIRT1过表达或干扰的慢病毒稳转胃癌细胞(SGC-7901、BGC-823、AGS),MTS实验检测顺铂和5-FU的半数抑制浓度(IC50),克隆形成实验检测顺铂作用后细胞的克隆形成能力。发现SIRT1抑制的稳转细胞,顺铂和5-FU的半数抑制浓度(IC50)明显升高,顺铂作用后的细胞的克隆形成能力较对照组增强。流式细胞术和western blot检测细胞的凋亡情况,结果显示顺铂作用后,SIRT1抑制的稳转细胞,细胞凋亡的比例显着降低,凋亡相关分子Caspase-3的活性降低;过表达SIRT1则结果恰恰相反。说明SIRT1抑制胃癌细胞耐药。在裸鼠体内,分别用过表达或干扰SIRT1的稳转胃癌细胞SGC-7901及它们相应的对照稳转细胞进行裸鼠皮下成瘤实验,每种细胞均分为生理盐水对照组和顺铂治疗组,治疗20天后处死裸鼠。发现顺铂治疗能显着抑制肿瘤体积,与对照组相比,SIRT1过表达组肿瘤体积明显减小,对顺铂治疗的敏感性增强,SIRT1低表达组的结果相反。3.SIRT1抑制了胃癌细胞的肿瘤干性。利用构建好的SIRT1过表达或干扰的稳转胃癌细胞株,通过克隆球形成实验,软琼脂克隆球形成实验检测细胞的肿瘤干性,发现过表达SIRT1的胃癌细胞的克隆球形成能力明显降低,干扰SIRT1则结果相反。荧光定量PCR和流式细胞术检测经典胃癌干细胞标记物CD44和重要干性转录因子的表达,发现SIRT1过表达组CD44及干性转录因子的mRNA水平降低,CD44阳性细胞的比例也明显减少。悬浮培养的克隆球和顺铂处理后的胃癌细胞中,CD44和干性转录因子的mRNA水平增加,而SIRT1表达下调。顺铂处理后,SIRT1干扰的稳转胃癌细胞中CD44阳性的肿瘤干细胞更丰富。4.AMPK和FOX03参与了 SIRT1对胃癌细胞化疗耐药和肿瘤干性的调控。为了初步探索SIRT1调控胃癌耐药和肿瘤干性的分子机制,我们对SIRT1下游的信号分子AMPK展开分析。通过对顺铂IC50的测定和顺铂作用后细胞凋亡的检测,发现在SIRT1过表达胃癌细胞中抑制AMPKα只能部分逆转由SIRT1诱导的化疗敏感性。提示除AMPK外,还有其他靶基因参与这个过程。随后我们检测肿瘤抑制性转录因子FOX03是否参与了由SIRT1诱导的药物敏感性。结果显示在SIRT1过表达胃癌细胞中抑制FOX03a也只能部分逆转由SIRT1诱导的化疗敏感性,而双敲除AMPKα和FOX03a则能彻底逆转SIRT1诱导的胃癌细胞的化疗敏感性。我们的结果说明AMPK和FOX03均参与了 SIRT1对胃癌细胞化疗耐药的调控,并且这两种靶分子之间可能存在协同效应。与体外研究结果一致,在体裸鼠成瘤实验结果显示,使用特异性抑制剂抑制AMPK和FOX03的活性能够彻底逆转SIRT1诱导的胃癌细胞对顺铂的化疗敏感性。此外,AMPK和FOXO3参与SIRT1对肿瘤干性的调控得到了克隆球形成实验的证实。5.AMPK与FOXO3之间存在正反馈调节。免疫荧光法检测FOXO3a的亚细胞定位,发现AMPK的激动剂能够促进FOXO3a核转移,而AMPK的抑制剂作用相反。然后我们使用含有3个重复的FOXO结合元件的荧光素酶质粒检测FOXO3a的转录活性。双荧光素酶实验结果显示,AMPK的激动剂能够增强FOXO3a的转录活性,而AMPK的抑制剂则能够抑制FOXO3a的转录活性。为检测FOXO3a能否调节AMPK的表达,我们在胃癌细胞中干扰FOXO3a的表达后,发现AMPKα的mRNA水平显着下降,而AMPK的γ亚基和AMPK的β亚基mRNA水平并没有发生显着变化。此外,敲除FOXO3a后,AMPKα的蛋白和磷酸化水平明显降低,而AMPKy的蛋白水平没有显着变化。利用JASPAR数据库分析AMPKα和AMPKy的启动子序列,在AMPKα的启动子区域中预测到三个FOXO3结合位点,在AMPKγ启动子中预测到一个FOXO3结合位点。染色质免疫沉淀实验(ChIP)结果显示FOXO3在AMPKα启动子的第二个和第三个结合位点检测到明显的结合信号,而在AMPKα启动子第一个结合位点仅检测到微弱信号,在AMPKy启动子上没有检测到结合信号。为了进一步明确FOXO3与AMPKα启动子的结合是否具有功能,我们构建了包含AMPKα启动子序列及FOXO3a结合位点单突变启动子序列的荧光素酶报告载体。双荧光素酶实验显示敲除FOXO3后AMPKα启动子的荧光素酶活性降低。突变FOXO3的第一个结合位点后荧光素酶活性没有变化,突变FOXO3的第二个结合位点可基本回复FOXO3敲除导致的AMPKα启动子荧光素酶活性的降低,突变FOXO3的第叁个结合位点起到部分回复作用。因此,结果表明FOXO3与AMPKα启动子上的第二个和第三个结合位点结合并发挥功能,其中第二个结合位点功能更重要。6.临床样本中SIRT1、AMPK和FOXO3的相关性。为了确定AMPKα和FOXO3a在胃癌中的临床意义,我们使用包括117对石蜡包埋的胃癌组织和匹配的癌旁组织的组织阵列评估p-AMPKα和FOXO3a的表达。免疫组织化学染色显示p-AMPKα和FOXO3a在胃癌组织中低表达。在SIRT1高表达组胃癌组织中的p-AMPKα和FOXO3a表达水平明显高于SIRT1低表达组。利用免疫组化评分,我们发现SIRT1和FOXO3a以及p-AMPKα和FOXO3a都有相关性。生存分析结果表明p-AMPKα或FOXO3a高表达的患者有较长存活时间。与我们的研究结果一致,Kaplan-Meier plotter数据库显示接受5-FU化疗的胃癌患者中,AMPKα或FOXO3a高表达者有较长存活时间和首次进展间隔。Cox回归分析也显示p-AMPKα和FOXO3a的表达水平与胃癌患者的存活显着相关。结论:SIRT1能抑制胃癌细胞的耐药和肿瘤干性。AMPK与FOXO3参与SIRT1对胃癌细胞耐药和肿瘤干性的调控过程,并且二者之间存在正反馈调节。(本文来源于《山东大学》期刊2019-05-24）

朱洁红^[2]（2019）在《MiR-452-Wnt/β-catenin正反馈环路促进结直肠癌增殖转移的机制研究》一文中研究指出研究背景:结直肠癌是我国常见的恶性肿瘤,其发病率和病死率在我国恶性肿瘤中排名第四位,而且近年来在我国的发病率和死亡率均呈明显上升趋势。转移可导致病人术后复发和预后不良,是结直肠癌致死的重要因素,尽管临床上不断出现新型药物和系统性的治疗方案,但转移性结直肠癌患者的预后并没有得到明显的改善。因此,阐明结直肠癌侵袭和转移的分子机制,目前仍然是对其研究的重要方向。MicroRNAs是一类长度约为20-24个核苷酸的非编码小分子RNA。MiRNA通过与特定mRNA的3'非翻译区结合,导致mRNA降解或翻译来调控靶基因的表达,在肿瘤中起到促癌或抑癌作用。MiR-452是miR-224/miR-452族群的成员,在以往研究中,我们证实了miR-224在结直肠癌中可作为致癌基因,而对于已经报道了在几种恶性肿瘤中高表达的miR-452,其在结直肠癌中的作用知之甚少。Wnt/β-catenin信号传导途径的异常激活被认为是结直肠癌进展和转移中的重要途径,而β-catenin在细胞质中积累和核转位是Wnt/β-catenin信号途径激活的重要标志。在激活Wnt信号通路后,β-catenin逃逸降解,定位到细胞核内与TCF/LEF转录因子家族结合,使Wnt通路下游的基因转录。MiR-452可以激活Wnt/β-catenin信号。但机制仍不清楚。因此,本课题旨在揭示miR-452和Wnt/β-catenin通路之间的相互关系在结直肠癌的具体作用。研究方法:1.miR-452在结直肠癌组织中的表达及其临床意义生物信息学预测miR-452在结直肠癌中高表达。实时PCR检测43例结直肠癌组织及其配对的正常黏膜组织中miR-452的表达,其表达水平与肿瘤T分期正相关,与不良预后相关。2.miR-452在体内外结直肠癌细胞中的功能研究利用MTT、平板克隆形成实验、划痕实验、Transwell小室侵袭实验、裸鼠皮下成瘤实验证实,利用质粒转染结直肠癌细胞系SW480和HCT116构建过表达和抑制miR-452的SW480和HCT116细胞株后,miR-452对体内外结直肠癌细胞的增殖、克隆形成能力、迁移和侵袭能力的作用。3.miR-452靶基因的筛选和鉴定生物信息学和细胞荧光素酶功能研究证实了miR-452对靶基因GSK3 β的3'-UTR的调节作用,这导致了miR-452激活Wnt/β-catenin信号通路,并通过一系列体内外实验证实GSK3 β可有效逆转miR-452对结直肠癌的转移、侵袭作用。4.通过Chip实验证实TCF4/LEF1可上调miR-452启动子的活性。研究结果:1.与正常组织相比,miR-452在结直肠癌中表达上调,并与临床意义相关。2.在体外和体内,MiR-452基因的上调增强结直肠癌细胞增殖和侵袭。3.荧光素酶报告系统研究肯定了miR-452抑制GSK3β基因的表达,激活Wnt/β-catenin信号,并且GSK3β基因的表达明显逆转了MiR-452对结直肠癌的转移和增殖作用。4.TCF/LEF转录因子家族是Wnt/β-catenin信号通路的关键下游分子,被证实是miR-452启动子的有效转录因子。结论:研究结果突出了miR-452在miR-452-GSK3β-TCF4/LEF1正反馈环路中的重要作用,发现miR-452可以促进结直肠癌增殖、转移,同时也是结直肠癌患者潜在的预后标志物。(本文来源于《南方医科大学》期刊2019-05-22）

黄姗姗^[3]（2019）在《YAP1-AGK正反馈环路促进胃癌细胞进展的分子机制》一文中研究指出背景:酰基甘油激酶AGK位于人类染色体7q34区域,是一个多功能的脂质激酶,通过催化酰基甘油磷酸化产生溶血磷脂酸(LPA),从而参与到人体众多生物学过程中。最近多项证据表明,AGK表达失调与各种人类癌症的发生、发展有关。本课题研究了AGK对胃癌细胞增殖和癌变的影响,并深入研究了其中的分子作用机制。方法:采用免疫组织化学和蛋白质印迹分析检测了胃癌细胞系和胃癌组织中的AGK表达情况;基于免疫组化的结果分析了AGK表达水平与胃癌患者临床病理特征的关系。通过检测上皮-间充质转变标志物以及CCK-8,集落形成,transwell侵袭和迁移实验以及异种移植模型明确AGK在胃癌中的生物学功能。之后,在胃癌细胞和组织中分析AGK和YAP1之间的相关性,并通过荧光素酶报告基因实验,染色质免疫共沉淀,免疫荧光和qRT-PCR等实验进一步研究两者之间的相互作用机制。结果:免疫组化和western blot实验均显示AGK的表达在胃癌细胞系和组织样品中上调,高表达AGK蛋白与胃癌患者组织分化不佳(P=0.009)并且与胃癌患者预后不良密切相关。过表达AGK能促进胃癌细胞的增殖、侵袭能力和上皮-间充质转变标志物的表达。相反,敲减AGK的表达则抑制胃癌细胞的增殖、侵袭以及裸鼠异种移植模型中的肿瘤形成能力。进一步研究其内在分子机制,我们发现AGK的表达与胃癌细胞和组织中的YAP1的表达呈正相关。转录共激活因子YAP1可通过TEAD与AGK基因启动子区域结合从而转录诱导AGK的表达。此外,AGK通过抑制Hippo信号通路激活进而诱导YAP1核定位增多并增强YAP1/TEAD的转录活性。结论:本研究表明AGK不仅是Hippo-YAP1通路的新靶点,而且它还通过抑制Hippo通路激活从而促进YAP1/TEAD转录活性,形成YAP1-AGK正反馈环路。此外,YAP1-AGK正反馈环路与胃癌的发生、发展密切相关。因此,本研究提示双重靶向AGK和YAP1可能成为未来胃癌治疗的新策略。(本文来源于《南昌大学》期刊2019-05-01）

刘啸白^[4]（2019）在《PIWIL3/OIP5-AS1/miR-367-3p/CEBPA以及TDP43/SNHG12/miR-195/SOX5反馈环路调控胶质瘤细胞生物学行为的机制研究》一文中研究指出目的:胶质母细胞瘤(Glioblastoma,GBM)是神经上皮源性肿瘤,按照WHO病理分级,GBM是恶性程度最高,侵袭性最强的恶性脑胶质瘤。尽管给予积极的手术治疗,并辅助术后放疗和化疗,GBM患者的5年生存率仍小于5%,预后很差。GBM对化疗的耐药性和放疗的抵抗性是影响疗效的重要因素。目前,研究者们从基因组学、遗传学和表观遗传学等多角度研究胶质母细胞瘤的发病机制,针对胶质母细胞瘤发病机制的研究已成为诊断和靶向治疗的关键。非编码RNAs(non-coding RNAs,ncRNAs)人类基因组中的多数基因的转录产物之一。一般分为短链非编码RNAs和长链非编码RNAs(long non-coding RNAs,lncRNAs)。其中,短链非编码RNAs主要包括microRNAs(miRNAs)、short-interfering RNAs(siRNAs)和PIWI-interacting RNAs(piRNAs)。piRNAs一般通过与Argonaute蛋白家族的亚家族,即PIWIL蛋白亚家族结合,发挥基因沉默及调控和维持种系DNA稳定的功能。LncRNAs的生物学功能主要表现在转录或者转录后水平调控基因的表达。miRNAs在基因表达调控和调节细胞功能中起重要作用。RNA结合蛋白(RBPs)是一类伴随RNA的调控代谢过程,与RNA结合的蛋白质的总称。RBPs的主要作用是介导RNA的成熟、转运、定位和翻译。RBPs普遍表达于各种肿瘤细胞中,RBPs参与对肿瘤细胞生物学行为的调控。以RBPs、多种ncRNA、转录因子和靶基因组成的以ncRNA为中心的分子调控网络参与调节多种肿瘤的发生发展。本研究第一部分首先明确PIWIL3、piR-30188、OIP5-AS1、miR-367-3p、CEBPA和TRAF4的内源性表达以及对GBM生物学行为的影响,进一步探讨上述因子之间可能的作用方式以及它们对GBM的生物学行为调节的分子机制;第二部分首先明确TDP43、SNHG12、miR-195和SOX5在胶质瘤组织和细胞中的表达,以及TDP43、SNHG12、miR-195、SOX5和Gelsolin之间的调控关系和对胶质瘤细胞生物学行为的调控作用。本研究旨在揭示胶质瘤发生发展的新的分子机制,并为GBM的治疗提供新策略。研究方法:培养人源的GBM细胞系—U87、U251细胞,正常人源星型胶质细胞,和人源胚肾细胞HEK293。胶质瘤组织样本来源于中国医科大学附属盛京医院神经外科。应用Real-time PCR和原位杂交检测piR-30188、miR-367-3p、OIP5-AS1以及SNHG12和miR-195的表达。应用Western blot方法检测PIWIL3、TRAF4、CEBPA以及TDP43、SOX5和Gelsolin在人正常脑组织、脑胶质瘤组织、人正常星型胶质细胞、人脑胶质瘤细胞的表达水平。应用CCK-8法检测细胞增殖能力。采用Transwell法检测细胞迁移和侵袭能力的变化。应用流式细胞仪检测细胞凋亡能力。通过细胞转染方法构建PIWIL3、piR-30188、OIP5-AS1、miR-367-3p、TRAF4、CEBPA、TDP43、SNHG12、miR-195和SOX5过表达和/或表达沉默的细胞系。Real-time PCR方法检测PIWIL3、piR-30188、OIP5-AS1、miR-367-3p、TRAF4、CEBPA以及TDP43、SNHG12、miR-195和SOX5的表达变化。放射菌素D作用下检测RNA半衰期的变化。采用RIP方法和RNA pull-down方法检测piR-30188和PIWIL3、SNHG12和TDP43的结合作用。双荧光素酶基因报告分析系统检测piR-30188和OIP5-AS1、OIP5-AS1和miR-367-3p、SNHG12和miR-195的结合作用与结合位点。应用免疫共沉淀法检测CEBPA与TRAF4、CEBPA与PIWIL3启动子的直接结合作用,以及SOX5与Gelsolin、SOX5与SNHG12启动子的直接结合作用。裸鼠移植瘤实验检测PIWIL3、OIP5-AS1、miR-367-3p,以及TDP43、SNHG12和miR-195对裸鼠移植瘤的生长和生存时间的影响。结果:1.PIWIL3和piR-30188在胶质瘤组织和细胞中低表达,过表达PIWIL3以及过表达piR-30188分别显着抑制U87和U251胶质瘤细胞的增殖,迁移和侵袭能力,促进细胞凋亡。2.OIP5-AS1在胶质瘤组织和细胞中高表达,沉默OIP5-AS1的表达显着抑制胶质瘤细胞的增殖,迁移和侵袭能力,促进细胞凋亡。3.与单独应用过表达PIWIL3、过表达piR-30188和沉默OIP5-AS1的表达组相比,叁者联合应用组显着抑制胶质瘤细胞的增殖,迁移和侵袭能力,促进细胞凋亡。4.过表达PIWIL3以及过表达piR-30188分别显着抑制OIP5-AS1的表达,双过表达PIWIL3和piR-30188显着抑制OIP5-AS1的表达。5.PIWIL3与piR-30188存在靶向结合作用。6.OIP5-AS1与piR-30188存在靶向结合作用。7.miR-367-3p在胶质瘤组织和细胞中低表达,上调miR-367-3p的表达显着抑制胶质瘤细胞的增殖,迁移和侵袭能力,促进细胞凋亡;沉默miR-367-3p的表达显着增加胶质瘤细胞的增殖,迁移和侵袭能力,抑制细胞凋亡。8.过表达PIWIL3、过表达piR-30188和沉默OIP5-AS1的表达分别显着增加胶质瘤细胞的miR-367-3p的表达;与单独应用过表达PIWIL3、过表达piR-30188和沉默OIP5-AS1的表达组相比,叁者联合应用显着增加miR-367-3p的表达。9.过表达miR-367-3p显着降低胶质瘤细胞中OIP5-AS1的表达;沉默miR-367-3p的表达显着增加OIP5-AS1的表达。10.OIP5-AS1与miR-367-3p存在靶向结合作用,并存在于RISC复合体中。11.过表达PIWIL3、过表达piR-30188和沉默OIP5-AS1的表达分别显着抑制胶质瘤细胞CEBPA和TRAF4的蛋白表达;与单独应用过表达PIWIL3、过表达piR-30188和沉默OIP5-AS1的表达组相比,叁者联合应用显着抑制CEBPA和TRAF4的蛋白表达。12.过表达miR-367-3p显着降低胶质瘤细胞的CEBPA的mRNA和蛋白的表达,沉默miR-367-3p的表达显着增加CEBPA的mRNA和蛋白的表达。13.过表达miR-367-3p显着降低胶质瘤细胞的TRAF4的蛋白表达,沉默miR-367-3p的表达显着增加TRAF4的蛋白表达。14.miR-367-3p与CEBPA的3,UTR区存在靶向结合作用,miR-367-3p通过作用于CEBPA的3,UTR调节胶质瘤细胞的增殖,凋亡,迁移和侵袭能力。15.CEBPA在人脑胶质瘤组织和细胞中高表达,沉默CEBPA的表达显着抑制胶质瘤细胞的增殖,迁移和侵袭能力,促进细胞凋亡。16.沉默OIP5-AS1的表达联合过表达miR-367-3p显着降低胶质瘤细胞的CEBPA的表达,降低细胞的增殖,迁移和侵袭能力,促进细胞凋亡;而双沉默OIP5-AS1和miR-367-3p的表达,未明显改变胶质瘤细胞中CEBPA的表达,未对胶质瘤细胞的增殖,凋亡,迁移和侵袭能力产生有统计学意义的作用。17.TRAF4在人脑胶质瘤组织和细胞中高表达,沉默TRAF4的表达显着抑制胶质瘤细胞的增殖,迁移和侵袭能力,促进细胞凋亡。18.沉默CEBPA的表达显着降低胶质瘤细胞中TRAF4的mRNA和蛋白表达。19.CEBPA与TRAF4的启动子直接结合。20.沉默CEBPA显着降低PIWIL3的mRNA和蛋白表达,CEBPA与PIWIL3的启动子直接结合。21.单独过表达PIWIL3、沉默OIP5-AS1以及过表达miR-367-3p,均显着抑制了U87和U251裸鼠移植瘤的生长,并延长了裸鼠的生存期。与单独过表达PIWIL3、沉默OIP5-AS1以及过表达miR-367-3p组相比,叁者联合应用组显着抑制了裸鼠移植瘤的生长,并显着延长了裸鼠的生存期。22.TDP43和SNHG12在胶质瘤组织和细胞高表达,SNHG12存在于胶质瘤细胞的细胞核和细胞浆中。沉默TDP43的表达,以及沉默SNHG12的表达分别显着抑制U87和U251胶质瘤细胞的增殖,迁移和侵袭能力,促进细胞凋亡。与单独沉默TDP43或SNHG12的表达组相比,双沉默TDP43和SNHG12的表达显着抑制胶质瘤细胞的增殖,迁移和侵袭能力,促进细胞凋亡。23.TDP43与SNHG12存在靶向结合作用。24.沉默TDP43的表达显着减少了SNHG12的半衰期。25.miR-195在胶质瘤细胞中低表达,miR-195存在于胶质瘤细胞的细胞核和细胞浆中。过表达miR-195显着抑制胶质瘤细胞的增殖,迁移和侵袭能力,促进细胞凋亡;而沉默miR-195的表达显着增加胶质瘤细胞的增殖,迁移和侵袭能力,抑制细胞凋亡。26.沉默TDP43的表达,以及沉默SNHG12的表达显着增加胶质瘤细胞中miR-195的表达,与单独沉默TDP43的表达或沉默SNHG12的表达组相比,双沉默TDP43和SNHG12的表达显着增加胶质瘤细胞中miR-195的表达。27.过表达miR-195显着抑制胶质瘤细胞中SNHG12的表达,沉默miR-195的表达显着增加SNHG12的表达。28.SNHG12与miR-195存在靶向结合作用,二者结合于RISC复合体中。29.沉默SNHG12的表达联合过表达miR-195显着抑制胶质瘤细胞的增殖,迁移和侵袭能力,促进细胞凋亡;而双沉默SNHG12与miR-195未对胶质瘤细胞的增殖,凋亡,迁移和侵袭产生有统计学意义的作用。30.SOX5在胶质瘤组织和细胞中高表达,沉默SOX5的表达显着抑制胶质瘤细胞的增殖,迁移和侵袭能力,促进细胞凋亡。31.单独沉默TDP43或SNHG12的表达显着降低SOX5的蛋白表达;与单独沉默TDP43或SNHG12的表达组相比,双沉默TDP43和SNHG12的表达显着降低SOX5的蛋白表达。32.过表达miR-195显着降低SOX5的蛋白表达;沉默miR-195的表达显着增加SOX5的蛋白表达。沉默SNHG12的表达联合过表达miR-195显着降低SOX5的蛋白表达;而双沉默SNHG12和miR-195则未对SOX5的蛋白表达产生有统计学意义的作用。33.miR-195与SOX5的3,UTR区存在靶向结合作用。miR-195通过结合SOX5的3,UTR区调节胶质瘤细胞的增殖,凋亡,迁移和侵袭能力。34.沉默SNHG12的表达、过表达miR-195分别显着降低胶质瘤细胞中Gelsolin的蛋白表达,沉默miR-195显着增加Gelsolin的蛋白表达;沉默SNHG12的表达联合过表达miR-195显着降低胶质瘤细胞中Gelsolin的蛋白表达,而双沉默SNHG12和miR-195的表达未明显改变胶质瘤细胞中Gelsolin的蛋白表达。35.沉默SOX5的表达显着降低胶质瘤细胞中Gelsolin的蛋白表达;沉默miR-195的表达显着增加胶质瘤细胞中Gelsolin的蛋白表达,双沉默miR-195和SOX5的表达未明显改变胶质瘤细胞中Gelsolin的蛋白表达。36.SOX分别与Gelsolin的启动子区和SNHG12的启动子区结合。37.过表达SOX5显着增加SNHG12的表达,而沉默SOX5的表达则显着降低SNHG12的表达。38.单独沉默TDP43的表达,沉默SNHG12的表达,以及过表达miR-195,均显着抑制了U87和U251裸鼠移植瘤的生长,并延长裸鼠的生存期。与单独沉默TDP43的表达,沉默SNHG12的表达,以及过表达miR-195组相比,叁者联合应用组显着抑制了裸鼠移植瘤的生长,并显着延长了裸鼠的生存期。结论:1.piR-30188通过结合PIWIL3,发挥抑制胶质瘤细胞的恶性生物学行为的作用。piR-30188靶向结合OIP5-AS1,并负性调控其表达,调节胶质瘤细胞的生物学行为。2.OIP5-AS1靶向结合miR-367-3p,并负性调控其表达,发挥促进胶质瘤细胞的恶性生物学行为的作用。3.miR-367-3p靶向结合CEBPA的3,UTR区,发挥抑制胶质瘤细胞的恶性生物学行为的作用。4.CEBPA与TRAF4的启动子区结合,正性调控其转录,发挥促进胶质瘤细胞的恶性生物学行为的作用。5.CEBPA与PIWIL3的启动子区结合。6.PIWIL3/piR-30188/OIP5-AS1/miR-367-3p/CEBPA反馈环路在调节胶质瘤细胞生物学行为中发挥重要作用。7.TDP43靶向结合SNHG12,并增加其稳定性,上调其表达,发挥促进胶质瘤细胞的恶性生物学行为的作用。8.SNHG12靶向结合miR-195,并负性调控其表达,发挥促进胶质瘤细胞的恶性生物学行为的作用。9.miR-195靶向结合SOX5的3,UTR区,发挥抑制胶质瘤细胞的恶性生物学行为的作用。10.SOX5与Gelsolin的启动子区结合,正性调控其转录,发挥促进胶质瘤细胞的恶性生物学行为的作用。11.SOX5与SNHG12的启动子区结合,形成正反馈环路,调节胶质瘤细胞的生物学行为。12.TDP43/SNHG12/miR-195/SOX5反馈环路在调节胶质瘤细胞生物学行为中发挥重要作用。(本文来源于《中国医科大学》期刊2019-03-01）

卢凤飞^[5]（2018）在《miR-497/Wnt3a/c-jun反馈环路调控神经胶质瘤细胞生长和上皮—间质转化的分子机制研究》一文中研究指出研究背景:胶质瘤是常见的神经系统恶性肿瘤,虽然神经外科手术,化学治疗和放射治疗相结合的治疗策略成为临床治疗胶质瘤的重要手段,但神经胶质瘤患者的预后和生存率仍然较差,其5年生存率低于5%。因此,阐明神经胶质瘤发生发展的分子机制以及进一步探究胶质瘤的治疗的新策略是对临床胶质瘤的治疗意义重大。在过去的十年中,针对miRNA的研究一直是癌生物学领域热门研究内容之一。miRNA是长度为19-25个核苷酸的一类内源性非编码RNA。miRNA是细胞内信号通路重要的调控分子,主要通过与靶基因mRNA的3'非翻译区碱基互补配对并相互作用,从而影响靶mRNA分子的稳定性及翻译。这种mRNA干扰导致编码蛋白水平降低,从而影响一系列细胞过程,例如增殖,迁移和凋亡。有研究发现与相应的非肿瘤脑组织相比,部分miRNAs在恶性脑肿瘤中差异表达,这些miRNA发挥着靶向调控癌基因和抑制基因的功能,参与细胞迁移、细胞骨架重排、细胞侵袭侵袭性和血管生成的调控,从而阻断/促进肿瘤的发生发展。因此,miRNA可能在未来的肿瘤治疗中发挥巨大的作用,例如通过递送治疗性基因或微小RNA(miRNA)阻断肿瘤细胞增殖侵袭信号通路的重要靶标从而达到抑癌的目的。miR-497是位于17号染色体短臂13.1(17p13.1)的miRNA,属于miR-15/16/195/424/497家族miRNA中的一员,该家族成员的成熟miRNAs5'端均包含了 AGCAGC序列,并在人组织中均有中-高丰度的表达,是一簇高度保守的miRNA。有文献报道,抑癌基因P53等蛋白能够上调该家族miRNAs的表达,相反,应激和创伤下调它们的表达,另外其启动子甲基化和MYC也可引起它们的低表达,它们在细胞分裂、血管生成、代谢和应激反应等方面具有非常重要的作用。最近很多研究表明miR-497和miR-195所在染色体17p13.1的删除或拷贝数减少、等位基因缺失、启动子上游CpG岛区域发生异常高甲基化均可引起miR-497和miR-195表达下调,这两个miRNA与乳腺癌、原发性腹膜癌、黑色素瘤、结肠直肠癌等多种肿瘤、缺血性疾病和神经退行性疾病的发生密切相关。miR-497在各种肿瘤中表达下调,如肝癌、非小细胞肺癌,原发性腹膜癌,胃癌和乳腺癌等,同时,miR-497在恶性肿瘤中发挥重要的抑癌基因的作用,miR-497的低表达可能促进了肿瘤的发生发展。在男性乳腺癌中,miR-497是表达下调最显的miRNA之一。DanLi等人的研究结果显示miR-195/497在乳腺癌组织中的表达水平与其恶性程度呈负相关。在乳腺癌中miR-497启动子区发生了异常CpG岛的高甲基化导致其表达下调。在乳腺癌细胞株MCF7以及ZR-75-30中通过过表达miR-497抑制其增殖和侵袭。miR-497通过靶向调控Raf-1和Ccnd1的表达抑制乳腺癌细胞的增殖和侵袭。研究发现miR-497在非小细胞肺癌组织和细胞株中表达下调,在肺癌细胞株中过表达miR-497显着抑制细胞增殖和集落形成,miR-497通过靶向调控HDGF的表达抑制非小细胞肺癌细胞的增殖。在神经系统中,miR-497同样发挥着重要的功能。例如,miR-497能够通过靶向负调控抗凋亡蛋白bcl-2和bcl-w促进缺血性神经元的死亡。大鼠局灶性脑缺血后,敲除大鼠miR-497可有效增强缺血区bcl-2/-w蛋白水平,减弱缺血性脑梗塞。然而,miR-497在胶质瘤中的表达、对胶质瘤生物学行为的影响以及其潜在的分子机制仍有待进一步研究,阐明miR-497在胶质瘤发病机理中的作用具有较大的应用价值以及重要的科学意义。在本研究中,我们探讨了 miR-497在胶质瘤细胞株及胶质瘤组织中的表达,miR-497在胶质瘤细胞株增殖及侵袭转移过程中发挥的作用,并探讨了其潜在的作用机制。我们的研究发现在胶质瘤组织和细胞系中miR-497的表达显着下调。Wnt3a蛋白被鉴定为miR-497的下游靶标,并介导了 miR-497在细胞生长和侵袭中所发挥的功能。此外,本研究还表明Wnt3a促进c-jun表达,从而负调控miR-497表达,总之,miR-497/Wnt3a/c-jun反馈环调控的失调是神经胶质瘤细胞异常生长增殖和发生上皮-间质转化的重要分子机制之一。结果1.miR-497在胶质瘤组织和胶质瘤细胞株中表达下调我们使用荧光实时定量PCR方法测定胶质瘤组织和正常脑组织中miR-497的表达情况。检测结果显示与正常脑组织相比,胶质瘤组织中miR-497的表达显着下调。同时,与正常脑细胞株NBC相比,胶质瘤细胞株中miR-497的表达显着下调。统计学分析发现miR-497表达高的胶质瘤患者无病生存率和总生存率显着高于miR-497低表达的患者。2.Wnt3a是miR-497在胶质瘤中的直接靶点来自miRNA数据库TargetScan和miRanda的生物信息学分析结果提示Wnt3a是miR-497重要靶标之一。为了检测miR-497能否通过直接靶向Wnt3a 3'-UTR调控其表达,我们将Wnt3a的3'-UTR克隆到荧光素酶报告质粒中,其中包括预测的miR-497与Wnt3a的3'-UTR野生型结合位点(WT)荧光素酶报告质粒以及突变序列(MUT)荧光素酶报告质粒。与突变型miR-497质粒转染的U251细胞相比,用野生型质粒转染的细胞的荧光素酶活性显着降低。随后,通过RT-PCR和Western Blot检测,我们发现miR-497能够在mRNA和蛋白水平抑制Wnt3a的表达。进一步研究表明,胶质瘤组织中miR-497和Wnt3a之间表达呈负相关关系。3.miR-497靶向Wnt3a在胶质瘤细胞中的作用我们使用慢病毒作为载体过表达miR-497建立稳定表达miR-497的U251细胞株。用对照慢病毒载体(LV-ctrl)转导的细胞作为阴性对照。我们使用RT-PCR检测细胞的转染效率。正如预期的那样,MTT检测结果提示过表达miR-497能够抑制胶质瘤细胞的生长。类似地,用LV-miR-497处理的U251细胞比用LV-ctrl处理的细胞形成更小和更少的集落。接下来我们检测miR-497是否可以控制细胞周期进程。我们观察到过表达miR-497能够明显降低S期细胞的比例并增加G1期细胞的比例。我们还检测了转染LV-miR-497细胞后细胞周期调控相关蛋白CyclinD1,CDK4和E2F1的表达情况,发现过表达miR-497能够明显下调这些蛋白的表达。总之,上述实验结果提示miR-497能够通过调节细胞周期进程来减少神经胶质瘤细胞的生长。随后,我们通过实验检测miR-497对胶质瘤细胞迁移的影响。Transwell检测结果提示过表达miR-497后能够明显抑制胶质瘤细胞的迁移。大量研究表明上皮-间质转化(EMT)在参与促进癌细胞迁移中发挥的重要作用,我们检测了miR-497对胶质瘤细胞株EMT的影响。在LV-miR-497细胞中E-cadherin表达升高,而N-cadherin和Vimentin表达下调。上述实验结果提示恢复miR-497的表达可能逆转EMT并下调胶质瘤细胞的迁移能力。接下来我们通过进一步实验以确定miR-497是否主要通过靶向Wnt3a发挥其抑制胶质瘤细胞株迁移的功能。实验结果表明当Wnt3a过表达时,通过过表达miR-497抑制Wnt3a对胶质瘤细胞株侵袭转移的抑制作用被消除。此外,我们的研究结果还揭示了 Wnt3a的过表达逆转了 miR-497对细胞生长,细胞周期分布,侵袭和EMT表型变化的影响。总之,上述实验结果表明miR-497通过靶向Wnt3a抑制神经胶质瘤细胞生长和迁移。4.Wnt3a通过c-jun负调控miR-497的表达我们进一步探究了 miR-497在胶质瘤中下调的潜在分子机制。首先,我们使用UCSC和PROMO生物信息学软件寻找到了 miR-497转录起始位点上游1000个碱基的区域。进一步生物信息学分析结果提示miR-497转录起始位点上游-978至-972和-952至-946启动子区域存在两个潜在的c-jun转录因子结合位点。上述转录因子结合位点被命名为A和B。染色质免疫沉淀(ChIP)检测结果提示c-jun蛋白能够结合上miR-497启动子中上述两个转录因子结合位点。启动子区荧光素酶报告基因检测结果发现下调c-jun蛋白表达能够提高miR-497转录活性并上调miR-497表达。有文献报导肿瘤细胞中Wnt3a能够上调c-jun的表达。我们通过进一步试验验证在胶质瘤细胞中Wnt3a能否通过c-jun调节miR-497的表达。首先,我们通过si-RNA下调Wnt3a表达,发现通过干扰Wnt3a的表达后能够下调c-jun同时增加miR-497表达。然而,当c-jun过表达时,在转染了 si-Wnt3a的胶质瘤细胞株中发现miR-497表达升高。用质粒pcDNA-3.1-Wnt3a转染U251细胞后,发现过表达Wnt3a能够增加c-jun的表达水平,同时下调了 miR-497的表达。然而,当c-jun表达被抑制时,在转染了 pcDNA-3.1-Wnt3a的胶质瘤细胞中miR-497表达下调。总之,上述实验数据数据表明Wnt3a可能通过c-jun负调控miR-497的表达。5.miR-497在体内抑制细胞生长为了进一步确认miR-497能否在体内实验中抑制肿瘤的生长,我们分别将转染了 LV-miR-497及LV-ctrl的胶质瘤细胞株U251注射到裸鼠的背部。与接种LV-ctrl细胞的异种移植肿瘤相比,接种LV-miR-497细胞株的裸鼠肿瘤生长得更缓慢。此外,接种LV-miR-497细胞的裸鼠体内异种移植肿瘤的平均重量显着低于接种LV-ctrl细胞的裸鼠。我们取下裸鼠体内的移植瘤进行固定脱水后石蜡包埋并进行切片,对肿瘤切片进行免疫组化增殖标记物Ki-67染色,结果表明miR-497在体内下调了胶质瘤细胞株的增殖速度。结论与讨论研究表明一部分miRNAs有助于胶质瘤的发生发展和侵袭转移,并被认为是治疗胶质瘤的潜在新型治疗靶点。有研究报导了 miR-497在癌症发生发展过程中所发挥的作用。在非小细胞肺癌中,miR-497表达下调,而过表达miR-497能够通过其靶向VEGF和YAP1抑制肿瘤细胞的生长和侵袭。在一系列的研究中发现了类似的结果,miR-497作为一种肿瘤抑癌基因发挥作用。研究表明microRNA-497的表达下调与胶质瘤患者的预后不良有关。然而,miR-497在神经胶质瘤中的生物学功能和潜在的分子机制目前尚不清楚。在本研究中,与之前文献所报道的结果一致,我们发现miR-497在胶质瘤组织和细胞系中表达下调。在本研究中,Wnt3a被鉴定为miR-497下游的靶基因。我们提出miR-497可能通过靶向Wnt3a发挥其抑制胶质瘤细胞株增殖及侵袭转移的功能。为了进一步证实这一观点,我们在稳定转染miR-497的胶质瘤细胞株中过表达Wnt3a,观察到Wnt3a过表达逆转了 miR-497对胶质瘤细胞株增殖及侵袭转移的抑制作用。在胶质瘤组织中我们也发现miR-497和Wnt3a的表达呈负相关。随后,我们进行了细胞功能实验以探索miR-497在胶质瘤细胞中的作用。通过MTT和集落形成实验证实了 miR-497能够抑制胶质瘤细胞的生长。随后我们检测了 miR-497对胶质瘤细胞周期分布的影响,我们观察到过表达miR-497后胶质瘤细胞周期分布从G1期阻滞到S期。该数据表明miR-497可能通过影响细胞周期来下调胶质瘤细胞的生长能力。与体外研究一致,体内研究结果显示miR-497能够抑制裸鼠皮下移植瘤细胞的生长。肿瘤侵袭转移是癌症发展进程的关键步骤之一。Boyden检测结果提示过表达miR-497能够下调胶质瘤细胞的侵袭转移能力。EMT与细胞侵袭能力密切相关,因此我们验证了 miR-497对胶质瘤细胞株EMT表型的影响。如本研究Western Blot检测结果所示,在胶质瘤细胞株中过表达miR-497能够增加E-钙粘着蛋白表达,同时降低N-钙粘着蛋白和波形蛋白表达。上述实验结果提示miR-497可能通过抑制胶质瘤细胞株的上皮-间充质转化,最终下调神经胶质瘤细胞的侵袭转移能力。最后,我们探究了导致胶质瘤miR-497失调的潜在分子机制。转录因子的异常调控通常会导致miRNA在遗传或表观遗传水平上的表达异常。在这些转录因子中,c-jun在肿瘤细胞生长和转移过程中发挥关键作用。通过生物信息学分析发现,在miR-497转录起始位点上游区域发现了 c-jun的两个转录因子结合位点。ChIP-PCR和荧光素酶报告基因检测结果证实c-jun能够直接结合于miR-497启动子上并抑制其转录活性。实时荧光定量PCR检测结果显示c-jun能够负调控miR-497的表达。我们还证实了 Wnt3a能够通过调节c-jun表达,从而控制miR-497的表达。我们的研究结果提示Wnt3a能够通过调控c-jun/miR-497轴促进胶质瘤细胞株的生长及侵袭转移。总之,我们的研究结果提示Wrnt3a/c-jun/miR-497反馈环调控神经胶质瘤细胞的生长和侵袭。miR-497的下调与胶质瘤患者的预后不良密切相关,并且恢复miR-497的表达降低了胶质瘤细胞株的生长和侵袭转移,所以靶向miR-497可能是神经胶质瘤的潜在治疗手段之一。(本文来源于《南方医科大学》期刊2018-05-25）

罗雨豪^[6]（2018）在《MiR-577在胃癌中通过SDPR/ERK/NF-κB正反馈环路调控TGFβ诱导的EMT和干性》一文中研究指出研究背景和目的胃癌是严重威胁全人类生存和健康的恶性肿瘤,亚洲是胃癌的高发地域之一,而我国的发病人数则居亚洲之首,在我国胃癌无论发病率还是死亡率均高居所有恶性肿瘤前叁位。由于早期症状不明显和缺乏规范体检,临床上大部分患者胃癌确诊时已发生转移,导致患者不良预后。因此,探讨胃癌转移的分子机制,寻找有效的分子标志物,有望为胃癌转移的预测、诊断和治疗提供新的方向。上皮间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT)是肿瘤转移的重要机制之一,肿瘤细胞通过发生EMT,失去上皮极性而获得间质特性,伴随着上皮标志物如E-钙粘蛋白(E-cadherin)、紧密连接蛋白ZO-1等的缺失和间质标志物如波形蛋白(Vimentin)、N-钙粘蛋白(N-cadherin)等的升高。肿瘤干细胞(Cancer stem cell,CSC)是指肿瘤中少部分具有自我更新、肿瘤起始和化疗抵抗特性的细胞群体,肿瘤干性(Stemness)即指的是这部分肿瘤细胞所拥有的特性,常见的干性标志物包括CD133、CD44、Sox2等。研究发现,EMT是驱动肿瘤细胞获得肿瘤干性的重要过程。通过发生EMT,肿瘤细胞可以获得更好运动、侵袭、转移能力和肿瘤干性潜能。EMT发生的机制错综复杂,肿瘤微环境与EMT的发生紧密相关,肿瘤微环境中的转化生长因子β(TGFβ)是最为重要的EMT促进因子,可通过经典的Smad通路形成转录复合体调控EMT，也可调控非Smad依赖的信号通路如PI3K/AKT通路、MAPK通路、NF-kB通路等,介导EMT。因此,深入阐明TGFβ介导EMT的分子机制,有望为阻断EMT、治疗肿瘤转移提供新策略。MicroRNA(miRNA)是非编码RNA家族成员,长度介于19~25核苷酸,研究发现人类基因组中有一半以上的编码基因受microRNA调控,在增殖、侵袭、血管生成、凋亡等多种生物行为中扮演重要角色。前期研究结果证实microRNA可以调控EMT，并且可以作为TGFβ的下游效应分子,参与其生物学行为的发生。MiR-577是近年发现的肿瘤相关基因,在胶质瘤、骨肉瘤、结直肠癌等多种肿瘤中异常表达,但迄今为止,miR-577在胃癌的表达水平、生物学功能和调控的分子机制仍不清楚。通过TCGA(The Cancer Genome Atlas)数据库分析,我们发现miR-577在胃癌中明显上调,体内体外的实验研究证实miR-577促进胃癌侵袭、转移、EMT和肿瘤干性,但不影响胃癌增殖。通过多种细胞因子筛选,我们发现TGFβ显著诱导miR-577的表达,通过转录组学分析证实NF-kB P65是miR-577的转录因子,TGFβ通过活化NF-kB,磷酸化P65,入核转录调控miR-577的表达。通过生物信息分析和实验验证,我们证实SDPR蛋白为miR-577的下游靶基因,SDPR通过直接与ERK结合,抑制ERK磷酸化,影响ERK-IKKα/β-IKBα-P65通路,从而抑制P65磷酸化,正反馈抑制miR-577的转录。结合生物信息分析和实验验证,我们发现miR-577及其靶基因SDPR是TGFβ介导EMT的重要机制,通过正反馈环路促进胃癌转移,本研究拟探讨miR-577及其靶基因如何参与TGFβ介导的EMT，为未来针对miR-577和SDPR为靶点实现精准治疗提供实验依据。研究方法1.miR-577在胃癌细胞、组织和临床标本的表达水平(1)通过对 TCGA STAD(The Cancer Genome Atlas Stomach Adenocarcinoma)数据库microRNA芯片进行分析,筛选胃癌差异microRNAs，miR-577是差异基因之一并在胃癌中高表达。(2)采用荧光定量RT-PCR检测36例新鲜胃癌组织标本及其配对的癌旁正常黏膜组织,7 株胃癌细胞株(AGS、SGC7901、MGC803、MGC823、BGC823、BGC803、MKN45)和正常永生化胃粘膜上皮细胞GSE-1中miR-577的表达。(3)通过对153例有完整随访资料的胃癌石蜡标本进行原位杂交,分析miR-577的表达与临床病理学参数以及患者预后的关系。2.miR-577对胃癌细胞体内外生物学特性的影响(1)通过转染miR-577 AgomiR/AntagomiR用于miR-577的过表达和干扰,通过MTT实验、Edu细胞增殖实验、平板克隆实验等检测miR-577在体外对胃癌细胞增殖能力的影响;通过构建带Luciferase信号的LV-miR-577稳定过表达细胞及其对照细胞,裸鼠皮下瘤注射实验检测miR-577在体内对胃癌细胞增殖的影响。(2)瞬时转染miR-577 AgomiR/AntagomiR后,Transwell细胞迁移实验检测miR-577体外对胃癌细胞迁移和侵袭能力的影响;通过构建带Luciferase信号的LV-miR-577稳定过表达细胞及其对照细胞,裸鼠尾静脉瘤细胞注射实验检测体内miR-577对胃癌细胞肺定殖能力的影响以及分析与裸鼠生存预后的关系。(3)瞬时转染miR-577 AgomiR/AntagomiR后,干性成球实验检测miR-577对胃癌细胞成球能力的改变;MTT实验检测miR-577对奥沙利铂化疗敏感性的影响;将细胞分为NC组、miR-577组、NC+奥沙利铂组、miR-577+奥沙利铂组,通过流式细胞技术检测miR-577对凋亡的影响,并通过Western Blot检测凋亡相关指标的改变。3.miR-577参与TGFβ介导EMT的机制研究(1)倒置显微镜观察瞬时转染miR-577 AgomiR/AntagomiR后胃癌细胞形态的变化,利用Western Blot、免疫组化和免疫荧光检测EMT和肿瘤干性相关标志物的变化。(2)使用TGFβ刺激胃癌细胞OH、24H、48H,倒置显微镜观察细胞形态学变化,Transwell实验检测胃癌细胞迁移能力的变化,Western Blot检测EMT标志物的改变,荧光定量RT-PCR检测miR-577的表达变化。(3)将细胞分为TGFβ对照组、TGFβ处理组、TGFβ+ AntagomiR处理组,倒置显微镜观察细胞形态学变化,Transwell实验检测胃癌细胞迁移能力的变化,Western Blot检测EMT标志物的改变。(4)使用基因组学网站UCSC和转录因子数据库PROMO分析发现NF-κBP65是miR-577的转录因子,存在A、B、C3个结合位点,TGFβ刺激胃癌细胞OH和24H，Western blot检测NF-κB P65磷酸化改变,免疫荧光观察NF-κB P65定位的改变。(5)使用 NF-κB 通路抑制剂 QNZ 和 BAY 11-7082,Western Blot 检测 P-P65 和P65的表达,荧光定量RT-PCR检测miR-577的表达变化;设计特异性siRNA干扰NF-κB P65,Western Blot检测P65变化,荧光定量RT-PCR检miR-577的表达变化。(6)构建启动子荧光素酶报告基因载体,分组为PGL4+P65组、WT+P65组、MUTAB+ P65 组、MUTAC+ P65 组、MUTBC+ P65 组、MUTABC+ P65 组,检测荧光素酶活性变化;根据A、B、C 3个位点设计特异性探针,CHIP实验验证NF-κB P65与启动子区位点直接结合。4.miR-577靶基因的筛选和鉴定(1)通过靶基因数据库miRDB、PITA、RNA22和Targetscan分析miR-577潜在调控的靶基因,TCGA分析靶基因在胃癌中的表达水平及其相应的表达丰度;荧光定量RT-PCR分析过表达miR-577后靶基因的变化;构建靶基因3'UTR区域双荧光素酶载体,验证miR-577与靶基因3'UTR区直接结合。(2)荧光定量RT-PCR分析选定的靶基因SDPR在30例胃癌新鲜临床组织标本及其癌旁配对正常胃粘膜组织中的表达,并分析SDPR与miR-577表达在新鲜组织水平的相关性。(3)对153例有完整随访资料的石蜡包埋胃癌组织进行SDPR免疫组化染色,分析SDPR与临床病理参数和患者预后的关系。(4)设计特异性siRNA干扰SDPR,构建SDPR过表达载体,倒置显微镜观察形态学变化,Transwell实验检测胃癌细胞迁移能力的变化,Western Blot检测EMT标志物的改变;(5)免疫荧光共染SDPR和ERK，CO-IP验证SDPR与ERK相互作用,Western Blot检测ERK/NF-κB通路指标的改变。(6)过表达和干扰SDPR,荧光定量RT-PCR检测miR-577的表达变化。(7)具体分组为 Mock 组、NC 组、miR-577 组、miR-577+SDPR 组,Transwell实验检测胃癌细胞迁移能力的变化，Western Blot检测EMT标志物和ERK/NF-κB通路指标的改变;5.统计学分析采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析。MiR-577在新鲜配对胃癌组织中的表达采用配对样本Wilcoxon符号秩检验(Wilcoxon rank-sum test),Ⅰ+Ⅱ分期与Ⅲ+Ⅴ分期中miR-577的表达以及转移组(M1)与非转移组(MO)中miR-577的表达采用独立样本 Kruskal-Wallis 检验(Kruskal-Wallis test);MiR-577 和SDPR的表达与临床病理参数之间的相关性采用卡方检验(Pearson's chi-squared(x2)test);miR-577和SDPR与患者预后分析采用Kaplan-Meier法绘制并进行Log-Rank检验比较生存曲线之间的统计学差异;Transwell细胞迁移实验、Edu细胞增殖实验、平板克隆实验、裸鼠皮下成瘤实验等进行两组间的均数比较时,采用两独立样本的t检验,进行多组间的均数比较时采用单因素方差分析(One-WayANOVA),方差分析前先进行Levene法检测方差齐性,方差齐时多重比较使用LSD法(Least-significant Difference，最小方差法),方差不齐时使用 Dunnett's T3 法。研究结果:1.miR-577在胃癌组织水平和细胞水平高表达(1)TCGA芯片分析提示miR-577在胃癌高表达通过对TCGA胃癌microRNA芯片进行分析,在42对胃癌及其配对的癌旁正常组织中,有29对癌组织中miR-577表达上调。(2)miR-577在胃癌组织水平和细胞水平高表达通过对36对胃癌及其癌旁配对正常组织进行荧光定量RT-PCR检测,发现与癌旁正常组织相比,miR-577在胃癌组织中表达上调,并且肿瘤分期为Ⅲ+Ⅳ胃癌患者组织较Ⅰ+Ⅱ期中的miR-577表达更高,转移组(M1)较非转移组(MO)的miR-577表达也更高。细胞水平上,较永生化胃粘膜上皮细胞GSE-1,miR-577在6株胃癌细胞中的表达均上调。(3)miR-577在胃癌临床标本高表达并与不良预后相关通过原位杂交检测153例有完整随访资料的胃癌石蜡包埋组织,也证实miR-577在胃癌中高表达,与TNM分期、肿瘤浸润深度、淋巴结转移数、远处转移等病理参数相关,并且与Ⅰ-Ⅲ期患者的DFS以及IV期患者的OS相关。以上实验说明,miR-577在胃癌中高表达,并与患者转移和不良预后相关,可能是评估胃癌患者转移和预后的作为独立预测指标。2.miR-577不影响增殖但促进转移和化疗耐药(1)miR-577体内体外均不影响胃癌增殖过表达和干扰miR-577后,MTT实验、Edu细胞增殖实验、平板克隆实验均证实miR-577体外不影响肿瘤细胞增殖;构建稳定过表达miR-577细胞系,体内研究证实miR-577也与肿瘤细胞增殖无关。(2)miR-577体内体外促进胃癌转移体外过表达miR-577后,Transwell细胞迁移实验证实miR-577促进迁移和侵袭能力;干扰miR-577后,胃癌细胞的迁移和侵袭能力则明显下降。裸鼠尾静脉注射实验发现稳定过表达miR-577后,肿瘤的肺定殖能力增加,裸鼠的预后更差。(3)miR-577促进胃癌干性和奥沙利铂耐药过表达或干扰miR-577后,干性成球实验证实过表达miR-577后成球数目更多,干扰则减少。MTT结果证实过表达miR-577增加胃癌细胞MGC803对奥沙利铂的耐受性,干扰则提高MKN45细胞的化疗敏感性。流式细胞技术提示过表达miR-577可以显着抑制奥沙利铂诱导的凋亡,Western Blot结果提示过表达miR-577 后凋亡标志物 Cleaved-caspase3 和 Cleaved-caspase7 均减少。以上实验说明,miR-577不影响胃癌细胞增殖能力,但促进胃癌细胞体内外迁移、侵袭、肺定殖能力、成球能力和化疗抵抗能力。3.miR-577参与TGFβ诱导的EMT和肿瘤干性(1)miR-577促进胃癌EMT和肿瘤干性在MGC803细胞中过表达miR-577后,细胞变得更为长梭,在MKN45细胞中干扰miR-577,细胞则向椭圆形转化。Western Blot结果显示过表达miR-577后,上皮标志物E-cadherin下调,间质标志物Vimentin、N-cadherin、MMP9上调,肿瘤干性标志物CD44、SOX2上调,而干扰miR-577后则得到相反的结果。免疫荧光结果提示,过表达miR-577上皮标志物E-cadherin下调,间质标志物Vimentin上调,干扰则为相反的效应。(2)miR-577能被TGFβ诱导表达使用TGFβ刺激胃癌细胞OH、24H、48H后,细胞形态由椭圆形逐渐向长梭形转变,生出细胞伪足,同时细胞迁移能力升高,Western Blot结果显示上皮标志物E-cadherin下调,间质标志物Vimentin、N-cadherin、MMP9上调,肿瘤干性标志物CD44、SOX2上调,提示TGFβ诱导胃癌EMT和肿瘤干性,荧光定量RT-PCR结果发现TGFβ刺激明显升高miR-577,并呈现时间依赖性。(3)干扰miR-577逆转TGFβ诱导的EMT和肿瘤干性TGFβ刺激后再干扰miR-577,倒置显微镜观察发现TGFβ诱导的长梭形又重新向椭圆形转变,细胞的迁移能力也得到恢复,TGFβ抑制的上皮标志物E-cadherin 被干扰 miR-577 回复,TGFβ 促进的间质标志物 Vimentin、N-cadherin、MMP9和肿瘤干性标志物CD44、SOX2被干扰miR-577逆转。(4)TGFβ诱导的NF-kB P65入核通过转录组学分析发现NF-kB P65可能是miR-577的转录因子,存在3个潜在结合位点。文献报道TGFβ可以诱导NF-kB P65入核,通过Western Blot发现TGFβ刺激时间依赖性的磷酸化P65,免疫荧光观察NF-kB P65的定位,发现TGFβ刺激后,NF-kB P65核定位比例明显提高。(5)抑制和干扰NF-kB P65抑制miR-577表达使用NF-kB通路抑制剂QNZ和BAY 11-7082刺激细胞后,P65磷酸化水平降低,荧光定量RT-PCR检测发现miR-577表达下降;设计特异性siRNA干扰NF-kB P65后,miR-577的表达也显着下调。(6)NF-kB P65直接转录调节miR-577根据A、B、C 3个结合位点,设计荧光素酶报告基因载体,启动子荧光素酶报告基因实验发现A、B、C 3个结合位点均能提高荧光素酶活性,CHIP实验也证实MGC803和MKN45细胞中,NF-kB P65均能与A、B、C 3个结合位点结合。该部分研究结果说明miR-577是TGFβ的新靶点,TGFβ通过调控NF-kB P65核转位,转录水平调控miR-577的表达,介导肿瘤EMT和肿瘤干性。4.SDPR是miR-577的下游靶基因(1)SDPR是miR-577的候选靶基因通过miRDB、PITA、RNA22和Targetscan 4个数据库结合,筛选出104个候选靶基因,再通过TCGA寻找胃癌下调的基因,并限定表达丰度不低于2,最终选定 7 个候选基因:LM07、CCDC68、KLF9、Smad4、KLF4、KAT6B 和SDPR,过表达miR-577后荧光定量RT-PCR发现SDPR下调最为明显。双荧光素酶报告基因实验证实miR-577与SDPR的3'UTR区域的2个位点均有直接结合。(2)SDPR在胃癌组织中低表达并且与miR-577负相关通过30对胃癌及其配对的癌旁正常组织进行荧光定量RT-PCR检测发现SDPR在胃癌中低表达(P<0.05)，且Ⅲ+Ⅳ期患者中SDPR表达比Ⅰ+Ⅱ期患者更低(P<0.01),统计分析发现miR-577和SDPR在新鲜胃癌组织中的表达水平呈负相关(R=-0.442,P=0.015)。(3)SDPR在临床标本中低表达并与良性预后相关对153例有完整随访资料的石蜡包埋胃癌组织进行SDPR免疫组化染色,也发现较正常胃粘膜组织,SDPR在肿瘤中表达更低,并且随着肿瘤分期增加,表达更低。统计分析也发现miR-577高表达的胃癌组织,SDPR表达更低。Ⅰ-Ⅲ期患者DFS分析和Ⅳ期患者OS分析发现SDPR高表达与患者良性预后相关。协同分析发现miR-577高表达+SDPR低表达组预后最差,miR-577低表达+SDPR高表达预后最好。(4)SDPR抑制EMT、肿瘤干性和肿瘤转移在MGC803细胞中干扰SDPR后,细胞形态变为长梭的针刺状,细胞的迁移和侵袭能力增加,成球能力变强,Western Blot结果显示上皮标志物E-cadherin下调,间质标志物Vimentin、N-cadherin、MMP9上调,肿瘤干性标志物CD44、SOX2上调,提示干扰SDPR促进EMT、肿瘤干性和肿瘤转移。而通过载体介导的SDPR过表达则得到相反的趋势。(5)SDPR 抑制 ERK/NF-κB 通路。免疫荧光共染SDPR和ERK,发现二者存在明显的共定位,CO-IP实验证实二者存在直接结合作用,干扰SDPR后ERK磷酸化升高,IKKα/β磷酸化增加、IKBα磷酸化增加、P65磷酸化增加,提示SDPR抑制ERK/NF-κB通路。(6)SDPR调控ERK/NF-κB通路正反馈环路抑制miR-577表达前面证实NF-κB P65是miR-577的直接转录因子,而SDPR又抑制ERK/NF-κB通路,提示可能存在正反馈环路。荧光定量RT-PCR结果显示干扰SDPR促进miR-577的表达,过表达SDPR则抑制miR-577的表达。(7)恢复SDPR表达逆转miR-577诱导的EMTTranswell实验显示过表达miR-577促进胃癌细胞迁移能力,而过表达miR-577后恢复SDPR的表达则逆转miR-577上调的细胞迁移力;Western Blot结果显示过表达miR-577后间质标志物Vimentin、N-cadherin、MMP9上调,肿瘤干性标志物CD44、SOX2上调,恢复SDPR表达则逆转miR-577对间质标志物和干性标志物的促进。同样,通过Western Blot检测ERK/NF-kB通路也得到同样的结论。该部分实验说明SDPR作为miR-577的靶基因,在胃癌细胞中通过与ERK直接结合,抑制ERK磷酸化,抑制ERK/NF-kB通路,一方面抑制EMT和干性,另一方面则抑制miR-577的转录,通过正反馈环路调节miR-577的表达。结论1、miR-577在胃癌中高表达,与肿瘤转移和不良预后相关,可能扮演癌基因角色;2、miR-577不影响胃癌增殖但促进胃癌细胞体内体外的迁移、侵袭和肺定殖能力;3、TGFβ通过NF-kB转录调节miR-577,介导EMT和胃癌干性;4、SDPR是miR-577的下游靶基因,调控ERK/NF-kB通路,一方面抑制EMT和肿瘤干性,另一方面正反馈调节miR-577的表达。(本文来源于《南方医科大学》期刊2018-05-10）

叶勇义^[7]（2018）在《LincRNA-p21/miR-181/PKC-δ正反馈环路调控帕金森病炎症机制的研究》一文中研究指出研究背景帕金森病(Parkinson's Disease,PD)是最常见的慢性神经退行性运动障碍疾病之一,给家庭和社会带来沉重的负担。现有的研究表明,环境与遗传致病因素之间复杂的相互作用,共同引起多种细胞分子生理功能紊乱的级联反应,如线粒体功能障碍、氧化应激、蛋白质调控系统异常等,促进PD的发生发展。而近年来多项研究指出,小胶质细胞介导的中枢炎性机制是导致这些级联反应形成的重要始发因素。因此阐述PD中枢炎症反应的分子机制,对实现PD的早期发现、诊断、治疗均具有重要科学意义。研究目的小胶质细胞介导的中枢炎症反应在帕金森病(PD)进展中起关键作用,然而小胶质细胞的活化机制尚不明确。LncRNA与miRNA是神经退行性病变和免疫炎症反应的重要调控因子,基于我们的前期研究结果及文献检索论证,lincRNA-p21作为p53的下游效应分子,与miR-181家族/PKC-δ相互作用,促进小胶质细胞的活化。因此,根据竞争性内源性RNA(ceRNA)理论,本课题拟从分子、细胞、动物模型水平证明lincRNA-p21作为ceRNA,竞争性“吸附”miR-181家族,间接上调PKC-δ,同时PKC-δ又可促进p53/lincRNA-p21的表达,彼此形成一正反馈环路协同促进小胶质细胞的活化,加剧PD进展。该研究进一步丰富现有对PD分子生物学机制的认识,为后续展开基于lincRNA-p21信号通路的PD靶基因药物治疗提供新的靶点。研究方法及内容1、分子水平:通过下调/过表达p53/lincRNA-p21、PKC-δ、miR-181家族,利用实时荧光定量PCR及蛋白免疫印迹技术,分析其在小胶质细胞静息及活化状态中的表达及其中相互调控关系;进一步利用双荧光素酶报告实验、RIP及RNA pull down,确定lincRNA-p21作为ceRNA,竞争性吸附并下调miR-181家族,调控PKC-δ的表达。2、细胞水平:下调/过表达p53/lincRNA-p21、PKC-δ、miR-181家族,利用蛋白免疫印迹技术及流式细胞技术检测小胶质细胞表型相关分子的变化,明确p53/lincRNA-p21/miR-181家族/PKC-δ环路在小胶质细胞活化中的作用;进一步利用流式细胞术研究lincRNA-p21对小胶质细胞神经毒性的影响。3、动物水平:构建LPS制备PD炎症模型、MPTP制备PD急性模型,利用实时荧光定量PCR、蛋白免疫印迹检测p53/lincRNA-p21/miR-181家族/PKC-δ表达;立体定向注射下调/上调小鼠中脑黑质lincRNA-p21表达,利用实时荧光定量PCR、蛋白免疫印迹、免疫荧光以及流式细胞术,检测lincRNA-p21对PD中小胶质细胞的激活效应以及神经毒性作用。研究结果①p53诱导lincRNA-p21表达,促进小胶质细胞活化,加剧其神经毒性作用。②miR-181家族(miR-181a/b/c/d)靶向抑制PKC-δ,抑制小胶质细胞活化。③lincRNA-p21作为ceRNA,竞争性“吸附”miR-181家族,间接上调PKC-δ,同时PKC-δ又促进p53/l]incRNA-p21的表达,彼此形成一正反馈环路协同促进小胶质细胞的活化。结论p53/lincRNA-p21/miR-181家族/PKC-δ环路协同促进小胶质细胞持续活化,加剧PD进展。(本文来源于《南方医科大学》期刊2018-03-25）

罗米·阿契托夫^[8]（2018）在《作为结构隐喻的算法——关于数字文化反馈环路的反思》一文中研究指出笔者认为,将数字算法结构应用到模拟媒体,也许会揭示出数字技术本身的隐藏价值和内在认知。本文阐述了当代认知语言学对隐喻的理解,即隐喻被认为是一个通过跨领域映射——一个概念领域到另一个领域的部分映射(投射)——创造意义的概念工具。虽然被投射的领域意在阐明目标领域,但笔者认为,隐喻本身就具有自我反射性——将注意力引到被投射领域的特征上来。(本文来源于《装饰》期刊2018年03期）

黎瀚^[9]（2018）在《SNHG1/miR-154-5p/miR-376b-3p/FOXP2/KDM5B反馈环路调节胶质瘤细胞恶性生物学行为的分子机制研究》一文中研究指出目的:脑胶质瘤是成人最常见的原发性脑肿瘤,尽管手术、放疗、化疗等治疗方式在不断改善,胶质瘤患者的预后依旧很差。研究表明编码基因仅占基因组序列长度的2%以下,编码基因尚不足以阐明胶质瘤形成及恶变的分子机制,占基因组序列绝大多数的非编码RNA的失调也会影响肿瘤的发生发展。长链非编码RNAs(Long non-coding RNAs,lncRNAs)和miRNAs均为经典的非编码RNA。LncRNAs是一类无蛋白编码能力的RNA,它与其他分子的相互作用在多个调控水平产生了复杂的基因调节功能。在胶质瘤研究中,lncRNA小核仁RNA宿主基因1(small nucleolar RNA host gene 1,SNHG1)可作为多形性胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme,GBM)疾病诊断和预后的风险因子。有学者研究发现下调SNHG1的表达可降低胶质瘤细胞增殖和侵袭能力,增加细胞凋亡,胶质瘤组织中SNHG1的上调表达与不良预后正相关,但是并未对SNHG1产生生物学效应潜在的分子机制进行深入的研究。短链非编码RNA中最具代表性的为miRNAs,miRNAs可以通过与靶信使RNA(mRNA)的3’UTR完全或不完全互补配对结合,导致靶基因降解或抑制其蛋白质翻译,参与基因的表达调控,在发育、细胞增殖、凋亡、分化等基本的细胞生物学过程中起重要作用。生物信息学软件预测发现了两个miRNAs与SNHG1相关联。其一为miR-154-5p,近期研究表明其可作为抑癌因子,通过结合抑制PIWIL1调节胶质母细胞的增殖和转移行为并预测胶质瘤患者预后。其二为miR-376b-3p,研究表明miR-376b-3p参与了肝癌等其他组织恶性肿瘤的发生过程,然而在人类胶质瘤中,miR-376b-3p的功能尚不十分清楚.我们实验小组发现上述两个miRNAs在胶质瘤组织中低表达。通过生物信息学软件分析发现上述miRNAs作用的共同靶向基因为叉头框蛋白P2(FOXP2)基因,FOXP2属于叉头框转录因子家族,其表达于多种组织中,尤其在脑发育和成熟过程中起重要作用。FOXP2与胶质瘤的关系尚未见报道。FOXP2作为转录因子可作用于组蛋白赖氨酸特异性去甲基化酶5B(lysine(K)-specific demethylase 5B,KDM5B)启动子区域,现有很多研究已经证实KDM5B作为促癌因子参与多种组织的肿瘤发生过程。在神经系统疾病中,KDM5B的过表达能增强神经细胞瘤的致瘤性及药物抵抗。本研究为明确SNHG1、miR-154-5p、miR-376b-3p、FOXP2与KDM5B在胶质瘤中的内源性表达,以及对胶质瘤细胞生物学行为的作用,进一步探讨SNHG1是否能够通过调节miR-154-5p和miR-376b-3p的表达,进而调控FOXP2及KDM5B的表达,影响胶质瘤细胞的生物学行为及其机制,旨在为人脑胶质瘤的靶向精准治疗提供依据。研究方法:1.U87及U25细胞的培养。2.Real-time PCR方法分别检测SNHG1、miR-154-5p、miR-376b-3p和FOXP2及KDM5B的内源性表达。3.构建SNHG1沉默质粒及miR-154-5p、miR-376b-3p和FOXP2的过表达和沉默的质粒。4.双荧光素酶报告基因验证结合位点。5.RNA免疫共沉淀实验验证SNHG1与miR-154-5p、miR-376b-3p的特异性结合。6.CCK-8实验检测细胞增殖能力。7.Transwell实验检测细胞迁移及侵袭能力。8.流式细胞仪检测细胞凋亡率。9.Western Blot方法检测FOXP2、KDM5B和PI3K/Akt通路相关蛋白的表达变化。10.荧光素酶实验验证FOXP2调控KDM5B启动子区活性。11.染色质免疫共沉淀验证FOXP2与KDM5B启动子区的特异性结合。12.RNA免疫共沉淀及pull-down实验验证KDM5B与SNHG1的特异性结合。13.裸鼠移植瘤模型检测肿瘤生长及裸鼠生存期的变化。结果:1.TCGA数据库分析与正常脑组织相比,SNHG1在胶质瘤样本中表达显着升高(P<0.01)。通过qRT-PCR检测SNHG1在胶质瘤组织和细胞中高表达(P<0.01),随病理级别的升高表达增加,沉默SNHG1的表达抑制恶性胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭,促进细胞凋亡(P<0.01)。2.TCGA数据库分析与正常脑组织相比,miR-154-5p与miR-376b-3p的表达显着减低(P<0.01)。通过qRT-PCR检测miR-154-5p和miR-376b-3p在胶质瘤组织和恶性胶质瘤细胞中低表达,随病理级别的升高表达降低(P<0.01),过表达miR-154-5p或miR-376b-3p抑制恶性胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭,促进细胞凋亡(P<0.01)。3.TCGA数据库通过Pearson相关性分析验证miR-154-5p和miR-376b-3p表达量分别与SNHG1呈显着反向相关(P<0.01)。沉默SNHG1的表达增加了miR-154-5p和miR-376b-3p的表达(P<0.01),RNA免疫共沉淀实验证实SNHG1与miR-154-5p、SNHG1与miR-376b-3p之间存在靶向结合发挥miRNAs海绵作用。4.双荧光素酶报告基因实验验证miR-154-5p或miR-376b-3p可通过与FOXP2mRNA的3’UTR区域直接结合而降低FOXP2的表达水平(P<0.01),从而抑制恶性胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭,促进细胞凋亡(P<0.01)。5.Western Blot方法检测FOXP2在胶质瘤组织和细胞中高表达,随病理级别的升高表达增加(P<0.01)。沉默转录因子FOXP2的表达可降低其下游KDM5B的转录表达(P<0.01),抑制恶性胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭,促进细胞凋亡(P<0.01)。6.Western Blot方法检测KDM5B在胶质瘤组织和细胞中高表达,随病理级别的升高表达增加(P<0.01)。沉默恶性胶质瘤细胞中KDM5B的表达通过抑制PI3K/Akt信号通路,抑制恶性胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭,促进细胞凋亡(P<0.01)。7.通过qRT-PCR检测发现沉默KDM5B也能够降低SNHG1的表达水平(P<0.01),RNA免疫共沉淀及pull-down实验验证KDM5B与SNHG1的特异性结合形成正反馈调节环路,其机制为KDM5B发挥RNA结合蛋白的作用与lncRNA SNHG1之间结合并维持其稳定性。8.沉默SNHG1的同时过表达miR-154-5p、miR-376b-3p能够显着抑制胶质瘤的生长,延长裸鼠生存时间。结论:1.SNHG1作为促癌基因可促进胶质瘤细胞恶性生物学行为。2.miR-154-5p和miR-376b-3p可抑制胶质瘤细胞恶性生物学行为。3.SNHG1结合下调miR-154-5p与miR-376b-3p的表达发挥调控作用。4.FOXP2作为促癌基因可促进胶质瘤细胞恶性生物学行为,miR-154-5p和miR-376b-3p可作用于FOXP2发挥生物学效应。5.KDM5B作为促癌基因可促进胶质瘤细胞恶性生物学行为,FOXP2可直接作用于KDM5B启动子区增强其表达。6.SNHG1通过抑制miR-154-5p和miR-376b-3p调节FOXP2的表达水平,进一步调控KDM5B的表达水平,KDM5B可结合SNHG1维持其稳定性形成正反馈环路。(本文来源于《中国医科大学》期刊2018-02-01）

马芳^[10]（2017）在《MALAT1-SP1转录反馈环路在肺癌中的作用机制研究》一文中研究指出目的:肺腺癌转移相关转录本(metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1,MALAT1)是细胞核核斑区的一种长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA),全长约8kb,不编码蛋白质。MALAT1在多种肿瘤中过表达,是一种被广泛认可的肿瘤诊断、分期、预后的生物标志物。到目前为止,很多文献均报道了 MALAT1对很多肿瘤细胞的迁移和侵袭能力有着非常重要的作用。但MALAT1在肿瘤中的具体作用途径仍然不详。本实验室在前期的MALAT1基因的转录调控工作中,首次发现SP1(Specific protein 1)在肺癌中是调控MALAT1基因转录的重要转录因子(Transcription factor,TF),并且下调SP1会抑制MALAT1的表达,进而抑制肿瘤。在实验室前期的研究基础上,通过PCR和western bolt实验发现过表达MALAT1,SP1的表达量升高。因此,在肺癌细胞中,SP1蛋白与MALAT1之间形成了一个转录反馈环路。为了阐明MALAT1-SP1转录反馈环路在肺癌中的作用机制。本论文将以两种肺癌细胞系为模型展开实验,对以下3个问题进行更进一步研究:1.MALAT1如何促进SP1表达量升高?2.反馈环路是如何影响肺癌的生长转移?3.反馈环路对临床治疗有何意义?方法:(1)研究肺癌细胞中上调或下调MALAT1的表达量对SP1表达量的影响:在肺癌细胞中过表达或干扰MALAT1,并提取细胞总RNA和总蛋白,通过RT-PCR和western blot从RNA水平和蛋白水平直接检测SP1的表达量,并运用同样的方法检测过表达或者干扰MALAT1的肺癌细胞中SP1下游靶基因的表达量。SP1下游靶基因表达量的检测可以间接地反映MALAT1的表达量对SP1表达量的影响。(2)研究肺癌细胞中MALAT1转录产物RNA调节SP1表达量的作用方式:由于SP1是自身的转录因子,通过细胞免疫荧光实验探究MALAT1是否可以促进SP1蛋白入核,从而影响SP1自身的转录;通过免疫共沉淀和紫外交联实验探究MALAT1-RNA是否通过结合SP1蛋白对SP1蛋白起到了保护作用,通过半衰期实验进一步探究MALAT1的表达量对SP1蛋白稳定性的影响。(3)研究MALAT1的表达对肺癌细胞体外转移能力以及对体内肿瘤生长速率的影响:siRNA干扰肺癌细胞中MALAT1的表达,通过wound healing实验和transwell实验探究MALAT1的表达量对肺癌细胞体外迁移和侵袭能力的影响。在裸鼠皮下注射肺癌细胞,在长出的肿瘤中通过siRNA干扰MALAT1的表达,并测量肿瘤的大小,作出肿瘤生长曲线,探究MALAT1的表达量对体内肿瘤生长速率的影响。(4)研究临床肺组织中MALAT1与SP1的相关性:从正常人和肺癌病人的肺组织临床标本中提取RNA和蛋白,通过RT-PCR和western blot验证MALAT1和SP1的相关性。结果:通过RT-PCR和western blot实验发现在肺癌细胞中过表达MALAT1的1905-3235区域的RNA片段能够促进SP1以及SP1下游靶基因的表达。通过免疫荧光实验,发现在肺癌细胞中过表达MALAT1,细胞质和细胞核中的SP1均升高。随后通过检测SP1半衰期实验,发现过表达MALAT1可以延长SP1的半衰期。免疫共沉淀和紫外交联实验,发现在肺癌细胞中MALAT1的转录产物RNA与其关键调控转录因子SP1蛋白之间存在直接的相互结合作用。wound-healing实验与transwell实验的结果表明MALAT1表达水平的上调会促进肿瘤细胞系在体外的迁移与侵袭;MALAT1表达水平的下调对肿瘤细胞系在体外的迁移与侵袭能力都有很好的抑制作用。随后在裸鼠皮下注射肿瘤细胞,待长出肿瘤后对肿瘤的大小进行测量,结果显示下调MALAT1会抑制肿瘤的生长。此外,临床组织标本的研究显示,肺癌病人切除的肿瘤标本中MALAT1与SP1的表达量相比于普通正常人的肺组织都是升高的。结论:(1)在肺癌细胞中MALAT1的转录产物与其关键转录因子SP1蛋白之间存在直接的相互结合作用,这种结合稳定了 SP1蛋白的结构,并延长了 SP1蛋白的半衰期。SP1蛋白又是自身SP1基因转录的关键转录因子。因此,SP1表达量受到MALAT1表达量的调控,SP1与MALAT1之间就形成了一个正反馈转录环路。(2)干扰MALAT1的转录,可以下调SP1蛋白水平并抑制相关下游基因的转录,对肿瘤的生长与转移能力都有显着地抑制作用。(3)在临床标本中MALAT1转录水平与SP1的表达水平也存在相关性。因此,这一环路的阐明为肺癌的临床治疗提供了靶标。(本文来源于《东南大学》期刊2017-06-01）

反馈环路论文开题报告

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

研究背景:结直肠癌是我国常见的恶性肿瘤,其发病率和病死率在我国恶性肿瘤中排名第四位,而且近年来在我国的发病率和死亡率均呈明显上升趋势。转移可导致病人术后复发和预后不良,是结直肠癌致死的重要因素,尽管临床上不断出现新型药物和系统性的治疗方案,但转移性结直肠癌患者的预后并没有得到明显的改善。因此,阐明结直肠癌侵袭和转移的分子机制,目前仍然是对其研究的重要方向。MicroRNAs是一类长度约为20-24个核苷酸的非编码小分子RNA。MiRNA通过与特定mRNA的3'非翻译区结合,导致mRNA降解或翻译来调控靶基因的表达,在肿瘤中起到促癌或抑癌作用。MiR-452是miR-224/miR-452族群的成员,在以往研究中,我们证实了miR-224在结直肠癌中可作为致癌基因,而对于已经报道了在几种恶性肿瘤中高表达的miR-452,其在结直肠癌中的作用知之甚少。Wnt/β-catenin信号传导途径的异常激活被认为是结直肠癌进展和转移中的重要途径,而β-catenin在细胞质中积累和核转位是Wnt/β-catenin信号途径激活的重要标志。在激活Wnt信号通路后,β-catenin逃逸降解,定位到细胞核内与TCF/LEF转录因子家族结合,使Wnt通路下游的基因转录。MiR-452可以激活Wnt/β-catenin信号。但机制仍不清楚。因此,本课题旨在揭示miR-452和Wnt/β-catenin通路之间的相互关系在结直肠癌的具体作用。研究方法:1.miR-452在结直肠癌组织中的表达及其临床意义生物信息学预测miR-452在结直肠癌中高表达。实时PCR检测43例结直肠癌组织及其配对的正常黏膜组织中miR-452的表达,其表达水平与肿瘤T分期正相关,与不良预后相关。2.miR-452在体内外结直肠癌细胞中的功能研究利用MTT、平板克隆形成实验、划痕实验、Transwell小室侵袭实验、裸鼠皮下成瘤实验证实,利用质粒转染结直肠癌细胞系SW480和HCT116构建过表达和抑制miR-452的SW480和HCT116细胞株后,miR-452对体内外结直肠癌细胞的增殖、克隆形成能力、迁移和侵袭能力的作用。3.miR-452靶基因的筛选和鉴定生物信息学和细胞荧光素酶功能研究证实了miR-452对靶基因GSK3 β的3'-UTR的调节作用,这导致了miR-452激活Wnt/β-catenin信号通路,并通过一系列体内外实验证实GSK3 β可有效逆转miR-452对结直肠癌的转移、侵袭作用。4.通过Chip实验证实TCF4/LEF1可上调miR-452启动子的活性。研究结果:1.与正常组织相比,miR-452在结直肠癌中表达上调,并与临床意义相关。2.在体外和体内,MiR-452基因的上调增强结直肠癌细胞增殖和侵袭。3.荧光素酶报告系统研究肯定了miR-452抑制GSK3β基因的表达,激活Wnt/β-catenin信号,并且GSK3β基因的表达明显逆转了MiR-452对结直肠癌的转移和增殖作用。4.TCF/LEF转录因子家族是Wnt/β-catenin信号通路的关键下游分子,被证实是miR-452启动子的有效转录因子。结论:研究结果突出了miR-452在miR-452-GSK3β-TCF4/LEF1正反馈环路中的重要作用,发现miR-452可以促进结直肠癌增殖、转移,同时也是结直肠癌患者潜在的预后标志物。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

反馈环路论文参考文献

[1].安怡斐.去乙酰化酶SIRT1激活AMPK/FOXO3正反馈环路调控胃癌耐药及肿瘤干性的研究[D].山东大学.2019

[2].朱洁红.MiR-452-Wnt/β-catenin正反馈环路促进结直肠癌增殖转移的机制研究[D].南方医科大学.2019

[3].黄姗姗.YAP1-AGK正反馈环路促进胃癌细胞进展的分子机制[D].南昌大学.2019

[4].刘啸白.PIWIL3/OIP5-AS1/miR-367-3p/CEBPA以及TDP43/SNHG12/miR-195/SOX5反馈环路调控胶质瘤细胞生物学行为的机制研究[D].中国医科大学.2019

[5].卢凤飞.miR-497/Wnt3a/c-jun反馈环路调控神经胶质瘤细胞生长和上皮—间质转化的分子机制研究[D].南方医科大学.2018

[6].罗雨豪.MiR-577在胃癌中通过SDPR/ERK/NF-κB正反馈环路调控TGFβ诱导的EMT和干性[D].南方医科大学.2018

[7].叶勇义.LincRNA-p21/miR-181/PKC-δ正反馈环路调控帕金森病炎症机制的研究[D].南方医科大学.2018

[8].罗米·阿契托夫.作为结构隐喻的算法——关于数字文化反馈环路的反思[J].装饰.2018

[9].黎瀚.SNHG1/miR-154-5p/miR-376b-3p/FOXP2/KDM5B反馈环路调节胶质瘤细胞恶性生物学行为的分子机制研究[D].中国医科大学.2018

[10].马芳.MALAT1-SP1转录反馈环路在肺癌中的作用机制研究[D].东南大学.2017

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