本文主要研究内容
作者吴映彤（2019）在《非洲猪瘟病毒免疫抑制基因的筛选及RPA检测方法的初步建立》一文中研究指出：非洲猪瘟(Africa swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(Africa swine fever virus,ASFV)引起家猪和野猪的一种急性、热性和高传染性的疾病。自1921年首次发现非洲猪瘟疫情,该病已在全球数十个国家流行。2018年8月1日,我国辽宁省沈阳市首次报道ASF疫情,经基因进化树分析发现该毒株属于基因II型,与Georgia 2007/1毒株属于一个进化分支。当前疫情已在河南、江苏、浙江、安徽、黑龙江、内蒙古、吉林、天津、香港等32个省/直辖市/特别行政区蔓延流行,造成极大经济损失,我国生猪业也面临严峻考验。非洲猪瘟病毒基因组中约30%开放阅读框存在多个拷贝,即多基因家族(Multigene families,MGFs)。实验室前期研究表明,MGF360家族成员12L、13L、14L可能抑制IFN所介导的天然免疫应答,是基因缺失疫苗研制的主要靶标之一,因此针对抑制基因建立快速准确的检测方法非常重要。研究首先根据ASFV Georgia 2007/1分离株参考序列合成MGF360-12L、-13L、-14L基因,并克隆至pcDNA3.1真核载体,将重组质粒转染至PK15及293T细胞,通过荧光定量PCR检测基因对IFN-β(Interferon-β)表达的抑制作用,发现12L、13L的抑制作用较强。随后以pcDNA3.1-12L、-13L重组载体为模板,分别设计4组引物,选取特异性引物进行重组酶聚合酶(RPA)检测方法的初步建立。结果表明,所建立的12L基础RPA方法可在35℃、30 min时实现对目的片段的稳定扩增,而13L-RPA可在39℃恒温反应20 min完成扩增;该方法的敏感性可分别达到10~3和10~2个拷贝,同普通PCR方法检测限一致;此外,该RPA方法仅特异性扩增ASFV MGF360的12L或13L基因,对PEDV、FMDV、CSFV、PRRSV、PRV和PCV-2基因组没有扩增。使用ASFV基因组为阳性样品进行扩增发现,将基因组稀释后,12L-RPA、13L-RPA仍能检测到目的基因的存在,表明该检测方法具有一定的临床价值。分别选择pGEX6p-1、pET-21a、pET-28a、pET-32a大肠杆菌原核表达载体进行免疫抑制蛋白12L和13L的表达。表达条件经优化后,表达产物均为包涵体形式,实验发现以pET-21a为载体表达的包涵体蛋白溶解效果最好,纯化后的蛋白浓度可达200-500μg/mL。综上,研究基于ASFV MGF360-12L、-13L基因序列,初步建立了RPA检测方法,可对病毒MGF360-12L、-13L基因实现快速、特异性扩增,为后续12L、13L基因缺失疫苗的鉴别诊断提供一定的技术支持。同时克隆表达并成功纯化12L、13L蛋白,为后续多克隆抗体的制备、间接ELISA检测方法的建立及相关蛋白的功能研究进行了前期储备。
Abstract
fei zhou zhu wen (Africa swine fever,ASF)shi you fei zhou zhu wen bing du (Africa swine fever virus,ASFV)yin qi jia zhu he ye zhu de yi chong ji xing 、re xing he gao chuan ran xing de ji bing 。zi 1921nian shou ci fa xian fei zhou zhu wen yi qing ,gai bing yi zai quan qiu shu shi ge guo jia liu hang 。2018nian 8yue 1ri ,wo guo liao ning sheng shen yang shi shou ci bao dao ASFyi qing ,jing ji yin jin hua shu fen xi fa xian gai du zhu shu yu ji yin IIxing ,yu Georgia 2007/1du zhu shu yu yi ge jin hua fen zhi 。dang qian yi qing yi zai he na 、jiang su 、zhe jiang 、an hui 、hei long jiang 、nei meng gu 、ji lin 、tian jin 、xiang gang deng 32ge sheng /zhi he shi /te bie hang zheng ou man yan liu hang ,zao cheng ji da jing ji sun shi ,wo guo sheng zhu ye ye mian lin yan jun kao yan 。fei zhou zhu wen bing du ji yin zu zhong yao 30%kai fang yue dou kuang cun zai duo ge kao bei ,ji duo ji yin jia zu (Multigene families,MGFs)。shi yan shi qian ji yan jiu biao ming ,MGF360jia zu cheng yuan 12L、13L、14Lke neng yi zhi IFNsuo jie dao de tian ran mian yi ying da ,shi ji yin que shi yi miao yan zhi de zhu yao ba biao zhi yi ,yin ci zhen dui yi zhi ji yin jian li kuai su zhun que de jian ce fang fa fei chang chong yao 。yan jiu shou xian gen ju ASFV Georgia 2007/1fen li zhu can kao xu lie ge cheng MGF360-12L、-13L、-14Lji yin ,bing ke long zhi pcDNA3.1zhen he zai ti ,jiang chong zu zhi li zhuai ran zhi PK15ji 293Txi bao ,tong guo ying guang ding liang PCRjian ce ji yin dui IFN-β(Interferon-β)biao da de yi zhi zuo yong ,fa xian 12L、13Lde yi zhi zuo yong jiao jiang 。sui hou yi pcDNA3.1-12L、-13Lchong zu zai ti wei mo ban ,fen bie she ji 4zu yin wu ,shua qu te yi xing yin wu jin hang chong zu mei ju ge mei (RPA)jian ce fang fa de chu bu jian li 。jie guo biao ming ,suo jian li de 12Lji chu RPAfang fa ke zai 35℃、30 minshi shi xian dui mu de pian duan de wen ding kuo zeng ,er 13L-RPAke zai 39℃heng wen fan ying 20 minwan cheng kuo zeng ;gai fang fa de min gan xing ke fen bie da dao 10~3he 10~2ge kao bei ,tong pu tong PCRfang fa jian ce xian yi zhi ;ci wai ,gai RPAfang fa jin te yi xing kuo zeng ASFV MGF360de 12Lhuo 13Lji yin ,dui PEDV、FMDV、CSFV、PRRSV、PRVhe PCV-2ji yin zu mei you kuo zeng 。shi yong ASFVji yin zu wei yang xing yang pin jin hang kuo zeng fa xian ,jiang ji yin zu xi shi hou ,12L-RPA、13L-RPAreng neng jian ce dao mu de ji yin de cun zai ,biao ming gai jian ce fang fa ju you yi ding de lin chuang jia zhi 。fen bie shua ze pGEX6p-1、pET-21a、pET-28a、pET-32ada chang gan jun yuan he biao da zai ti jin hang mian yi yi zhi dan bai 12Lhe 13Lde biao da 。biao da tiao jian jing you hua hou ,biao da chan wu jun wei bao han ti xing shi ,shi yan fa xian yi pET-21awei zai ti biao da de bao han ti dan bai rong jie xiao guo zui hao ,chun hua hou de dan bai nong du ke da 200-500μg/mL。zeng shang ,yan jiu ji yu ASFV MGF360-12L、-13Lji yin xu lie ,chu bu jian li le RPAjian ce fang fa ,ke dui bing du MGF360-12L、-13Lji yin shi xian kuai su 、te yi xing kuo zeng ,wei hou xu 12L、13Lji yin que shi yi miao de jian bie zhen duan di gong yi ding de ji shu zhi chi 。tong shi ke long biao da bing cheng gong chun hua 12L、13Ldan bai ,wei hou xu duo ke long kang ti de zhi bei 、jian jie ELISAjian ce fang fa de jian li ji xiang guan dan bai de gong neng yan jiu jin hang le qian ji chu bei 。
论文参考文献
论文详细介绍
论文作者分别是来自中国农业科学院的吴映彤，发表于刊物中国农业科学院2019-07-05论文，是一篇关于非洲猪瘟病毒论文,基因论文,基因论文,重组酶聚合酶扩增论文,原核表达论文,中国农业科学院2019-07-05论文的文章。本文可供学术参考使用，各位学者可以免费参考阅读下载，文章观点不代表本站观点，资料来自中国农业科学院2019-07-05论文网站，若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权，请联系我们删除。
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