博州食品药品检验所833400
【摘要】目的：建立复方库木尼片中胡椒主成分胡椒碱的薄层色谱鉴别方法及高效液相色谱含量测定方法。方法：用KromatuniversilC18色谱柱，柱温25℃；以甲醇-水（74：26）为流动相，流速为1.0ml/min；检测波长为343nm.结果：胡椒碱在0.018μg·μl-1～0.54μg·μl-1范围内，r=0.999995（n=7），线性关系良好，平均回收率为98.04%，RSD=1.08%。结论：该定量方法简便、准确，可用于提高复方库木尼片的质量标准
【关键词】高效液相色谱；薄层鉴别，复方库木尼片；胡椒碱
前言
复方库木尼片是由孜然，芸香草，干姜，胡杨泪，黑胡椒5味维药，经特殊工艺制成的维药成方制剂。方中孜然为君药，孜然又名安息茴香，维吾尔族称之为“孜然”，来自于中亚、伊朗一带，在我国只产于新疆。孜然气味甘甜，辛温无毒，具有温中暖脾、开胃下气、消食化积、醒脑通脉、祛寒除湿等功效[1]。胡椒味辛，大温，无毒。入胃、大肠经，有温中，下气，消痰，解毒等功效。主治寒痰食积，脘腹冷痛，反胃，呕吐清水，泄泻，冷痢。[2]。
本品为棕黄色的片剂，主要用于健脾，助消化，散气。用于食欲不振，腹胀等症。此药为医院制剂无定性、定量分析项目，不能有效控制成药质量。本实验研究了胡椒碱的薄层色谱鉴别，同时建立高效液相色谱测定胡椒中胡椒碱的含量。结果表明方法专属性强，能够有效控制复方库木尼片的质量。
1.性状
本品为棕黄色的片剂；气清香，味甜、微苦。
2.薄层鉴别
2.1仪器与试药
复方库木尼片（批号20100904.20100909.2010）；胡椒碱对照品（0775-200203）由中国药品生物制品检定所提供
2.2方法与结果
1.2.1胡椒的鉴别
取本品粉末0.5g.加无水乙醇5ml，超声处理30分钟，滤过，取滤液作为供试品。按处方量自制缺胡椒的成药，同法制备成阴性对照液。取胡椒碱对照品置棕色量瓶中，加无水乙醇制成每1ml含4㎎的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（附录VIB）试验，用定量毛细管分别吸取阴性对照溶液，胡椒碱对照品溶液，供试品，各2μL点于同一硅胶G薄层板上，分别置日光和紫外光灯（365nm）下检视。
结果显示：在供试品色谱中，与胡椒碱对照品色谱相应的位置上显相同颜色的斑点或荧光斑点，阴性则无，如图1
从左至右6个斑点依次为1.2.供试品；3.4对照品5.6.阴性
3.含量测定
3.1仪器与试药
3.1.1仪器
日本岛津高效液相色谱仪（LC-20AT一元泵；SPD-20S紫外检测器）；AS20500A超声波清洗器；METTLERAE240电子分析天平。
3.1.2试药
复方库木尼片（新疆和田维吾尔医院，产品批号20100904、20100909）；胡椒碱的对照品（中国药品生物制品检验所，含量测定用，批号0775-200203）；甲醇：HPLC级，美国FairLawn.NewJersey；水为纯化水；其余试剂为分析纯。
3.2方法与结果
3.2.1色谱条件
KromatuniversilC18柱（250㎜×4.6㎜，5μm），柱温25℃；流动相为甲醇-水（74：：26）；检测波长为343nm；流速为1.0ml·min-1.理论板数按胡椒碱峰计算应不低于1500。
3.2.2溶液的制备
3.2.2.1对照品溶液的制备
精密称取胡椒碱对照品18.0mg，置200ml棕色量瓶中，加无水乙醇适量溶解并定容至刻度，再取2ml至10ml棕色量瓶中，加无水乙醇至刻度，做为对照品溶液一。另精密称取胡椒碱对照品15.92mg，置50ml棕色量瓶中，加无水乙醇适量溶解并定容至刻度，做为对照品溶液二。
3.2.2.2供试品溶液的制备
取不同批号的复方库木尼片20片，精密称重，研匀后，再精密称取约2片量，放入50ml棕色容量瓶中，加无水乙醇适量，经超声处理（功率250W，频率20kHz）30分钟，放冷，加无水乙醇至刻度，摇匀，精密量取续滤液10ml，置25ml棕色量瓶中，加无水乙醇之刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
3.2.2.3阴性对照溶液的制备
取按处方比例制成的除去胡椒的阴性样品，按供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液
3.3线性关系的考察
精密吸取上述胡椒碱对照品一1，5，10，15，20，25，30μl分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图，按上述色谱条件测定胡椒碱的吸收峰面积，以进样量为横坐标（X），以峰面积分值为纵坐标（Y），进行回归处理，得回归方程Y=127884X-2406.66（R=0.999995），表明胡椒碱在0.018μg·μl-1～0.54μg·μl-1范围内，进样量与峰面积线性关系良好。
3.4阴性对照试验
精密吸取对照品溶液一、供试品、阴性对照液各10μl进样测定，结果阴性对照液在于胡椒碱对照品相对应的保留时间位置上未见有吸收峰，说明本品中除胡椒碱以外的其他药物成分对含量测定无干扰，图2是有关对照品、供试品和胡椒碱提取物阴性对照品的HPLC图。
3.5系统适用性试验及专属性考察
3.5.1系统适用性试验
理论塔板数n=5.54（tR/Wh/2）2=3416。
分离度R=2（tR2-tR1）/（W1+W2）=4.1
拖尾因子fs=W0.05h/2d1=1.2。按中国药典规定，分离度应大于1.5，拖尾因子应在0.95～1.05之间，本项测定和结果符合要求。
3.5.2稳定性试验
取同一批号的复方库木尼片（新疆和田地区维吾尔医院，产品批号20100904.）供试品溶液，分别在0，4，8，12，24h，考察各共有峰的相对保留时间及相对峰面积比值的一致性，各共有峰相对保留时间的RSD为0.67%，相对峰面积比值的RSD为2.2%。结果显示，供试品溶液在24h内稳定性良好。
3.5.3精密度试验
精密吸取胡椒碱对照品溶液10μl，连续进样5次，测定胡椒碱的峰面积分别为1272917，1272053，1273547，1273532，1274054，1273221。结果其相对标准偏差RSD为0.05%，表明仪器精密度良好。
3.5.4重复性试验
取同一批号的复方库木尼片精密称取5份，按供试品溶液的制备方法制成供试品溶液，测定胡椒碱含量，计算其RSD=0.92%，表明本方法重现性良好。
3.5.5回收率测定
另精密称取已知含量的样品细粉6份（批号20010909），每份约0.1g，再分别精密量取对照品溶液二1ml加入到上述6份样品中，制成供试品溶液，测定胡椒碱含量，计算回收率，平均回收率为98.04%，RSD为1.08%，本法准确度较好。
3.6样品含量测定
取3.2.2.2中3种批号的供试品溶液各两份，分别进样2次，测得色谱峰面积，测定样品的含量，结果分别为3.107、2.820、3.064mg·g-1
4讨论
色谱条件的选择
关于胡椒碱的色谱条件，文献报道较多，我们曾借鉴以下方法进行试验，如无水乙醇-水（77：23）[15]，无水乙醇-水（76：24）[14]等均未取得良好的效果，通过系统探索的反复试验，用无水乙醇-水（74：26）[16]组成的流动相得到的峰分离度好、分离时间适宜，而且该系统溶剂也适合胡椒碱药材及其各种炮制品的质量分析。
5结论
实验结果表明，用高效液相色谱法测定复方库木尼片中胡椒碱的含量，重显性好，适用范围广，分离效率高，分离分析速度快，灵敏度高，可有效的控制本品的质量。
参考文献：
[1]中国药典2010年版一部[S].2010：227.
[2]中国药典2015年版一部[S].2015：243