王小虎:Tfcp211诱导Esrrb表达促进小鼠胚胎干细胞自我更新的机制研究论文

王小虎:Tfcp211诱导Esrrb表达促进小鼠胚胎干细胞自我更新的机制研究论文

本文主要研究内容

作者王小虎(2019)在《Tfcp211诱导Esrrb表达促进小鼠胚胎干细胞自我更新的机制研究》一文中研究指出:着床前胚胎的发育和由早期囊胚衍生而来的干细胞系受到高度调节。从小鼠的囊胚期,可以分离出三种不同的干细胞类型并且可以在体外进行培养。这些干细胞类型包括来自滋养外胚层的滋养层干细胞(Trophoblast Stem,TS);来自原始内胚层的干细胞样胚外内胚层(Stem-cell-like Extraembryonic Endoderm,XEN)细胞以及分离自着床前的囊胚内细胞团细胞(Inner cell mass,ICM),即胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells,ESCs);其中研究最热的是小鼠胚胎干细胞(mESCs)。在体外合适的培养条件下,ESCs只保持无限增值的能力而不发生分化,简称“自我更新”,同时保留分化成三个胚层的能力,简称“多能性”。到目前为止,虽然已经建立了多个物种的类似胚胎干细胞的细胞系,但是只有来源于小鼠和大鼠的胚胎干细胞可以产生嵌合体后代,称为naive多能性状态。有趣的是,在自我更新的特性和形态方面,人胚胎干细胞(human Embryonic Stem Cells,hESCs)更类似于小鼠外胚层干细胞(mouse Epiblast Stem Cells,mEpiSCs)而不是mESCs,我们称这个状态为primed多能性状态。值得注意的是,通过过表达单个基因,例如Stat3,Tfcp211和Klf4,可以将primed多能性状态的ESCs重编程回到naive多能性状态。mESCs和mEpiSCs需要不同的培养条件来维持多能性。mEpiSCs主要依赖成纤维细胞生长因子(Basic Fibroblast Growth Factor,bFGF)和重组人激活素-A(Recombinant Human Activin-A,ActivinA)来维持自我更新。而mESCs可以通过两种不同的培养体系来维持自我更新:添加白血病抑制因子(Leukaemia inhibitory factor,LIF)的血清培养基,以及添加两个小分子抑制剂(2i)的无血清培养基N2B27,2i指CHIR99021和PD0325901,它们维持自我更新分别是通过抑制糖原合成酶激酶-3(Glycogen synthase kinase 3 beta,GSK3β)和分裂原活化蛋白激酶的激酶(Mitogen-activated protein kinase kinase,MEK),而LIF维持自我更新是通过激活信号转导与激活因子3(STAT3),从而进一步激活STAT3下游的一些多能性基因,比如:Tfcp211,Kl4,和Piml等,其中的每一个过表达都可以替代STAT3来维持自我更新。但是,只有下调Tfcp211的表达才能够削弱LIF/STAT3信号通路介导的自我更新和mEpiSCs的重编程。先前的文献报道,作为LIF/STAT3下游的靶基因,转录因子Tfcp211(Transcription factor CP2-like protein 1),在建立和维持mESC naive多能性状态中扮演着很重要的角色。Tfcp211的过表达不仅可以取代LIF和2i中的任何一个因子的作用来促进mESCs的自我更新能力,还可以提高mEpiSCs重编程为naive多能性状态的效率。但是,Tfcp211是通过下游的哪些靶基因的作用来维持自我更新还不清楚。为了研究这个问题,我们首先鉴定出Tfcp211下游的靶基因,再对其进行一系列的验证。根据2014年Dunn S J在Science杂志上发表的一篇文献[Doi:10.1126/science.1248882],Estrogen related receptor beta(Esrrb)和Salian-like gene(Sa114)可能是Tfcp211下游的靶基因。为了验证这一预测,我们首先在小鼠胚胎干细胞中过表达Tfcp211,并通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析Esrrb和Sa114的表达情况。结果显示,过表达Tfcp211只有Esrrb的表达量较高,我们初步确定了Esrrb是Tfcp211的下游靶基因。接着,为了进一步确定Esrrb是Tfcp211的下游靶基因,我们实施了以下4个实验。第一,我们构建了一个Tfcp211可诱导表达的细胞株,并分时间段加入四环素(DOX)来诱导Tfcp211的表达,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析Esrrb的表达情况。结果显示,诱导时间越长,Esrrb的表达量越高。第二,在mESCs中下调Tfcp211的表达,qRT-PCR结果显示,Esrrb的表达量也随之降低。第三,我们从JASPAR数据库中分析了Tfcp211在Esrrb启动子上的结合位点,并进行了染色质免疫共沉淀实验(ChIP)。结果显示,Tfcp211在Esrrb启动子上具有很高的结合能力。最后,为了进一步验证Tfcp211与Esrrb的相互作用,我们在Esrrb启动子上突变了Tfcp211结合位点,并做了荧光素酶报告实验。结果显示,野生型的荧光强度是突变型的荧光强度的2.7倍。以上数据说明,Esrrb是Tfcp211下游的直接靶基因。以上数据说明,Esrrb是Tfcp211的直接靶基因,那么Esrrb是否可以调控Tfcp211的功能呢?因此,我们设计了以下两个实验。第一,在过表达Tfcp211的mESCs中下调Esrrb,经过形态学观察、碱性磷酸酶染色以及免疫荧光实验,表明干扰Esrrb的表达会导致过表达Tfcp211的小鼠胚胎干细胞分化;第二,在mEpiSCs中过表达Tfcp211,同时下调Esrrb的表达,结果显示Esrrb能够削弱Tfcp211重编程mEpiSCs回到mESCs的能力。综上所述,我们的研究结果证明Tfcp211主要通过诱导Esrrb的表达来维持小鼠胚胎干细胞的自我更新。该研究结果不仅丰富和完善了干细胞多能性调控网络,而且为干细胞以后的临床应用打下了理论基础。

Abstract

zhao chuang qian pei tai de fa yo he you zao ji nang pei yan sheng er lai de gan xi bao ji shou dao gao du diao jie 。cong xiao shu de nang pei ji ,ke yi fen li chu san chong bu tong de gan xi bao lei xing bing ju ke yi zai ti wai jin hang pei yang 。zhe xie gan xi bao lei xing bao gua lai zi zi yang wai pei ceng de zi yang ceng gan xi bao (Trophoblast Stem,TS);lai zi yuan shi nei pei ceng de gan xi bao yang pei wai nei pei ceng (Stem-cell-like Extraembryonic Endoderm,XEN)xi bao yi ji fen li zi zhao chuang qian de nang pei nei xi bao tuan xi bao (Inner cell mass,ICM),ji pei tai gan xi bao (Embryonic Stem Cells,ESCs);ji zhong yan jiu zui re de shi xiao shu pei tai gan xi bao (mESCs)。zai ti wai ge kuo de pei yang tiao jian xia ,ESCszhi bao chi mo xian zeng zhi de neng li er bu fa sheng fen hua ,jian chen “zi wo geng xin ”,tong shi bao liu fen hua cheng san ge pei ceng de neng li ,jian chen “duo neng xing ”。dao mu qian wei zhi ,sui ran yi jing jian li le duo ge wu chong de lei shi pei tai gan xi bao de xi bao ji ,dan shi zhi you lai yuan yu xiao shu he da shu de pei tai gan xi bao ke yi chan sheng qian ge ti hou dai ,chen wei naiveduo neng xing zhuang tai 。you qu de shi ,zai zi wo geng xin de te xing he xing tai fang mian ,ren pei tai gan xi bao (human Embryonic Stem Cells,hESCs)geng lei shi yu xiao shu wai pei ceng gan xi bao (mouse Epiblast Stem Cells,mEpiSCs)er bu shi mESCs,wo men chen zhe ge zhuang tai wei primedduo neng xing zhuang tai 。zhi de zhu yi de shi ,tong guo guo biao da chan ge ji yin ,li ru Stat3,Tfcp211he Klf4,ke yi jiang primedduo neng xing zhuang tai de ESCschong bian cheng hui dao naiveduo neng xing zhuang tai 。mESCshe mEpiSCsxu yao bu tong de pei yang tiao jian lai wei chi duo neng xing 。mEpiSCszhu yao yi lai cheng qian wei xi bao sheng chang yin zi (Basic Fibroblast Growth Factor,bFGF)he chong zu ren ji huo su -A(Recombinant Human Activin-A,ActivinA)lai wei chi zi wo geng xin 。er mESCske yi tong guo liang chong bu tong de pei yang ti ji lai wei chi zi wo geng xin :tian jia bai xie bing yi zhi yin zi (Leukaemia inhibitory factor,LIF)de xie qing pei yang ji ,yi ji tian jia liang ge xiao fen zi yi zhi ji (2i)de mo xie qing pei yang ji N2B27,2izhi CHIR99021he PD0325901,ta men wei chi zi wo geng xin fen bie shi tong guo yi zhi tang yuan ge cheng mei ji mei -3(Glycogen synthase kinase 3 beta,GSK3β)he fen lie yuan huo hua dan bai ji mei de ji mei (Mitogen-activated protein kinase kinase,MEK),er LIFwei chi zi wo geng xin shi tong guo ji huo xin hao zhuai dao yu ji huo yin zi 3(STAT3),cong er jin yi bu ji huo STAT3xia you de yi xie duo neng xing ji yin ,bi ru :Tfcp211,Kl4,he Pimldeng ,ji zhong de mei yi ge guo biao da dou ke yi ti dai STAT3lai wei chi zi wo geng xin 。dan shi ,zhi you xia diao Tfcp211de biao da cai neng gou xiao ruo LIF/STAT3xin hao tong lu jie dao de zi wo geng xin he mEpiSCsde chong bian cheng 。xian qian de wen suo bao dao ,zuo wei LIF/STAT3xia you de ba ji yin ,zhuai lu yin zi Tfcp211(Transcription factor CP2-like protein 1),zai jian li he wei chi mESC naiveduo neng xing zhuang tai zhong ban yan zhao hen chong yao de jiao se 。Tfcp211de guo biao da bu jin ke yi qu dai LIFhe 2izhong de ren he yi ge yin zi de zuo yong lai cu jin mESCsde zi wo geng xin neng li ,hai ke yi di gao mEpiSCschong bian cheng wei naiveduo neng xing zhuang tai de xiao lv 。dan shi ,Tfcp211shi tong guo xia you de na xie ba ji yin de zuo yong lai wei chi zi wo geng xin hai bu qing chu 。wei le yan jiu zhe ge wen ti ,wo men shou xian jian ding chu Tfcp211xia you de ba ji yin ,zai dui ji jin hang yi ji lie de yan zheng 。gen ju 2014nian Dunn S Jzai Scienceza zhi shang fa biao de yi pian wen suo [Doi:10.1126/science.1248882],Estrogen related receptor beta(Esrrb)he Salian-like gene(Sa114)ke neng shi Tfcp211xia you de ba ji yin 。wei le yan zheng zhe yi yu ce ,wo men shou xian zai xiao shu pei tai gan xi bao zhong guo biao da Tfcp211,bing tong guo shi shi ying guang ding liang PCR(qRT-PCR)fen xi Esrrbhe Sa114de biao da qing kuang 。jie guo xian shi ,guo biao da Tfcp211zhi you Esrrbde biao da liang jiao gao ,wo men chu bu que ding le Esrrbshi Tfcp211de xia you ba ji yin 。jie zhao ,wei le jin yi bu que ding Esrrbshi Tfcp211de xia you ba ji yin ,wo men shi shi le yi xia 4ge shi yan 。di yi ,wo men gou jian le yi ge Tfcp211ke you dao biao da de xi bao zhu ,bing fen shi jian duan jia ru si huan su (DOX)lai you dao Tfcp211de biao da ,tong guo shi shi ying guang ding liang PCR(qRT-PCR)fen xi Esrrbde biao da qing kuang 。jie guo xian shi ,you dao shi jian yue chang ,Esrrbde biao da liang yue gao 。di er ,zai mESCszhong xia diao Tfcp211de biao da ,qRT-PCRjie guo xian shi ,Esrrbde biao da liang ye sui zhi jiang di 。di san ,wo men cong JASPARshu ju ku zhong fen xi le Tfcp211zai Esrrbqi dong zi shang de jie ge wei dian ,bing jin hang le ran se zhi mian yi gong chen dian shi yan (ChIP)。jie guo xian shi ,Tfcp211zai Esrrbqi dong zi shang ju you hen gao de jie ge neng li 。zui hou ,wei le jin yi bu yan zheng Tfcp211yu Esrrbde xiang hu zuo yong ,wo men zai Esrrbqi dong zi shang tu bian le Tfcp211jie ge wei dian ,bing zuo le ying guang su mei bao gao shi yan 。jie guo xian shi ,ye sheng xing de ying guang jiang du shi tu bian xing de ying guang jiang du de 2.7bei 。yi shang shu ju shui ming ,Esrrbshi Tfcp211xia you de zhi jie ba ji yin 。yi shang shu ju shui ming ,Esrrbshi Tfcp211de zhi jie ba ji yin ,na me Esrrbshi fou ke yi diao kong Tfcp211de gong neng ne ?yin ci ,wo men she ji le yi xia liang ge shi yan 。di yi ,zai guo biao da Tfcp211de mESCszhong xia diao Esrrb,jing guo xing tai xue guan cha 、jian xing lin suan mei ran se yi ji mian yi ying guang shi yan ,biao ming gan rao Esrrbde biao da hui dao zhi guo biao da Tfcp211de xiao shu pei tai gan xi bao fen hua ;di er ,zai mEpiSCszhong guo biao da Tfcp211,tong shi xia diao Esrrbde biao da ,jie guo xian shi Esrrbneng gou xiao ruo Tfcp211chong bian cheng mEpiSCshui dao mESCsde neng li 。zeng shang suo shu ,wo men de yan jiu jie guo zheng ming Tfcp211zhu yao tong guo you dao Esrrbde biao da lai wei chi xiao shu pei tai gan xi bao de zi wo geng xin 。gai yan jiu jie guo bu jin feng fu he wan shan le gan xi bao duo neng xing diao kong wang lao ,er ju wei gan xi bao yi hou de lin chuang ying yong da xia le li lun ji chu 。

论文参考文献

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  • 论文详细介绍

    论文作者分别是来自安徽大学的王小虎,发表于刊物安徽大学2019-07-03论文,是一篇关于胚胎干细胞论文,自我更新论文,重编程论文,安徽大学2019-07-03论文的文章。本文可供学术参考使用,各位学者可以免费参考阅读下载,文章观点不代表本站观点,资料来自安徽大学2019-07-03论文网站,若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权,请联系我们删除。

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