导读:本文包含了胰岛淀粉样多肽论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:人胰岛淀粉样多肽,胆固醇,CARC,肽-胆固醇相互作用
胰岛淀粉样多肽论文文献综述
郝瑞杰[1]（2019）在《人胰岛淀粉样多肽与胆固醇相互作用的研究》一文中研究指出阿尔茨海默症、帕金森病、II型糖尿病(T2DM)和其它一些与老龄化相关的退行性疾病都与蛋白质的错误折迭以及随之产生的不溶性蛋白质的沉积相关,这些蛋白质沉积物由富含β-折迭的纤维状聚集体组成。人胰岛淀粉样多肽(hIAPP)是一种含有37个氨基酸残基的肽链,通常与胰岛素一起由胰岛β细胞分泌,hIAPP在胰岛β细胞表面的聚集以及由此形成淀粉样斑块的过程与T2DM的病理学有着密切的关系。在T2DM的异常代谢条件下,hIAPP会对β细胞产生破坏作用。胆固醇是细胞膜的重要组分,参与脂筏区的形成,在T2DM患者体内发现的胰岛β细胞中胆固醇含量的升高可能与β细胞功能的下降和胰岛素分泌的异常相关。然而,我们尚不清楚hIAPP在膜表面的聚集以及对膜的破坏活性与胆固醇有怎样的关系。因为hIAPP的N端11-17区域(R_(11)LANF_(15)LV_(17))的叁个残基R11、F15、V17的排列方式与介导跨膜蛋白与胆固醇结合的“反向的识别胆固醇的氨基酸共有序列(CARC)”的排列模式(K/R)-X_(1-5)-(Y/F)-X_(1-5)-(L/V)相符,因此我们想知道胆固醇能否调节hIAPP与磷脂膜的作用?hIAPP中组成CARC基序的叁个关键残基是否能够介导hIAPP与胆固醇的特异性识别?脂质体成分的不同如何影响hIAPP与胆固醇的作用?为此,我们首先使用染料泄漏荧光实验、ThT荧光光谱、核磁共振波谱、圆二色谱等方法探测了hIAPP和hIAPP_(1-19)与不同组成的脂质体(包括DOPC、DPPC和DOPC/DPPC)的相互作用以及胆固醇的影响,并研究了位于N端CARC区域的苯丙氨酸(F15)对肽与胆固醇识别的敏感作用。我们发现胆固醇的存在增加了hIAPP和hIAPP_(1-19)与这些磷脂膜结合的亲和力,加大了磷脂膜的损伤,而且胆固醇在磷脂膜内的聚集会进一步增加两个肽对磷脂膜的破坏程度。而由亮氨酸取代F15后,两个变异体对含胆固醇的磷脂膜的亲和力和破坏程度较野生型肽都显着减小。此外,F15还对hIAPP的纤维化聚集起加速作用,该作用在本质上与胆固醇无关。我们的结果表明,在hIAPP与胆固醇的特异性结合以及由此产生的对磷脂膜的破坏活性中,F15起了重要的作用。此外,我们还发现,胆固醇在不同成分磷脂膜内分布的不同会影响hIAPP与磷脂的相互作用以及hIAPP破坏磷脂膜的能力。随后,我们构建了更接近生物膜的脂质体系DOPC/DOPG/DPPC/DPPG20/5/70/5和DOPC/DOPG/DPPC/DPPG/Chol 20/5/45/5/25,进一步研究了hIAPP_(1-19)与磷脂膜的结合和对磷脂膜的破坏性能以及胆固醇在其中的作用,并研究了符合CARC基序模式的11-17肽片段中叁个骨架残基被其它残基替换后得到的各种hIAPP_(1-19)变异体与含有和不含胆固醇的磷脂膜的相互作用。我们还以SDS/DPC混合胶束作为膜模拟体系,利用二维NMR检测了hIAPP_(1-19)与胆固醇的相互作用模式。我们的结果表明,在叁个CARC骨架残基中,芳香族残基F15在介导hIAPP_(1-19)与胆固醇的相互作用中起最重要的作用,其次是第11位的精氨酸(R11),最后是第17位的缬氨酸(V17)。hIAPP_(1-19)与胆固醇之间的特异性相互作用促进了肽与磷脂膜的结合并加重了肽对磷脂膜的损伤。在胶束体系中通过核磁共振观测到了hIAPP_(1-19)与胆固醇的相互作用以及F15L残基替换导致的与胆固醇相互作用的减弱。(本文来源于《吉林大学》期刊2019-05-01）
田鹤[2]（2018）在《锌离子对胰岛淀粉样多肽沉积的影响及其机制研究》一文中研究指出目的:糖尿病是由多种病因引起的以慢性高血糖为主要特征的内分泌代谢紊乱性疾病,发病机制复杂。近年来,在2型糖尿病患者的尸检材料中发现,90%的患者胰岛内均有纤维状的胰岛淀粉样多肽(islet amyloid polypeptide,IAPP)蛋白沉积同时伴有β细胞数量显著减少,提示IAPP病理性沉积是影响胰岛β细胞存活和胰岛素分泌的重要原因之一。因此,深入研究IAPP在胰岛β细胞内病理性沉积的机制,对探讨糖尿病的发病机理以及寻找糖尿病防治的新靶点具有重要的理论和现实意义。研究证实,金属锌离子与IAPP的合成与代谢关系密切。锌离子通过与IAPP的第18位点的组氨酸残基结合,使相邻的IAPP单体交联,最终形成纤维状的IAPP聚集体。这一现象提示胰岛β细胞内锌离子代谢失衡可能是引起IAPP淀粉样沉积的重要原因。所以,调节糖尿病患者体内锌离子稳态,维持IAPP生成与降解的动态平衡,有望成为糖尿病治疗学的新策略。本课题通过小鼠和细胞模型,观察锌离子对胰岛淀粉样多肽沉积和胰岛细胞凋亡的影响,检测锌离子对IAPP合成和代谢相关酶类及胰岛β细胞凋亡相关蛋白的影响,旨在探讨锌离子影响胰岛淀粉样多肽病理性沉积的机制,为2型糖尿病治疗新靶点的选择提供实验依据。材料与方法:本研究以hIAPP转基因小鼠和转染hIAPP基因的INS-1细胞为研究对象,检测锌离子及锌离子螯合剂对淀粉样蛋白沉积及IAPP代谢和胰岛β细胞凋亡的影响及其机制。1、采用1月龄纯合hIAPP转基因雄性小鼠,高脂高糖饮食喂养,诱导产生2型糖尿病hIAPP转基因小鼠动物模型。成模后的小鼠分别给予锌离子和锌离子螯合剂(clioquinol,CQ)处理,观察小鼠的一般状态、监测血糖和体重变化情况;应用金属自显影技术(autometallography,AMG)观察锌离子沉积情况,应用免疫荧光组织化学染色观察锌离子对胰岛淀粉样多肽和胰岛素表达的影响;应用Western blot技术检测锌离子对小鼠胰腺内IAPP、胰岛素、IAPP合成代谢相关酶类含量的影响。2、培养稳定转染hIAPP基因的INS-1细胞,分别加入ZnSO_4和锌离子螯合剂(N,N,N?,N?-Tetrakis(2-pyridylmethyl)ethylenediamine,TPEN),应用Zinquin荧光染色观察不同组别细胞内锌离子的含量变化。应用免疫荧光双标染色观察锌离子对转hIAPP基因的INS-1细胞内IAPP和胰岛素分布和表达的影响。应用ELISA方法检测锌离子对hIAPP-INS-1细胞胰岛素分泌的影响。通过流式细胞术检测锌离子对hIAPP-INS-1细胞凋亡的影响。应用Western blot技术检测转hIAPP基因的INS-1细胞内IAPP、胰岛素、IAPP合成代谢相关酶类及细胞凋亡信号通路相关蛋白含量的变化。结果:1、锌离子影响hIAPP转基因小鼠的体重和血糖。髙脂高糖喂养的hIAPP转基因小鼠血糖升高,身体消瘦,出现糖尿病症状。与对照组小鼠相比,高锌喂养组小鼠体重下降明显,血糖值迅速升高,锌离子螯合剂CQ可改善小鼠糖尿病症状。2、CQ能够鳌合胰岛内的锌离子。AMG金属离子染色结果显示高锌处理组小鼠胰岛内可见大量锌离子沉积,而Zn+CQ组小鼠胰腺内锌离子沉积明显减少。3、锌离子促进hIAPP转基因小鼠胰岛内IAPP蛋白的沉积,减少胰岛素的表达。免疫荧光双标染色结果显示IAPP与胰岛素共表达于胰岛β细胞胞质,高锌组小鼠胰岛内IAPP荧光染色增强,而胰岛素荧光强度减弱。与高锌组比较,Zn+CQ组小鼠IAPP沉积减少,胰岛素表达增加。Western blot结果与免疫荧光染色结果一致,高浓度的锌离子可增加IAPP蛋白的含量,降低胰岛素的表达量,CQ能够逆转这一现象。4、锌离子影响hIAPP转基因小鼠胰腺内IAPP的合成。Western blot结果显示:与对照组相比,锌离子可增加hIAPP转基因小鼠胰腺内羧肽酶(carboxypeptidase,CPE)的含量,CQ处理可降低CPE的表达量,但是激素酶原转换酶1/3(prohormone convertase1/3,PC1/3)和激素酶原转换酶2(prohormone convertase 2,PC2)不受锌离子和锌离子螯合剂的影响。5、MTT比色实验结果显示50μM的ZnSO_4和1μM的TPEN孵育12h,不影响hIAPP-INS-1细胞的活性。6、Zinquin荧光染色显示50μM的ZnSO_4使hIAPP-INS-1细胞内锌离子荧光强度增加明显,而锌离子螯合剂TPEN能够螯合锌离子,降低hIAPP-INS-1细胞内的锌离子荧光强度。7、高浓度的锌离子增加hIAPP-INS-1细胞内IAPP的表达,减少胰岛素的表达。免疫荧光双标染色结果显示:高锌(Zn)组细胞内IAPP表达增强,胰岛素表达减弱;而锌螯合剂TPEN干预组(Zn+TPEN)细胞内IAPP表达明显低于高锌组,胰岛素表达增加。Western blot结果证实高锌降低细胞内胰岛素的分泌,增强IAPP蛋白的表达,TPEN能够减弱锌离子的作用。ELISA实验也证实过多的锌离子减少hIAPP-INS-1细胞分泌胰岛素的能力。8、锌离子影响hIAPP-INS-1细胞中IAPP合成酶的含量。Western blot结果显示:IAPP合成过程中的关键酶CPE受锌离子调控,高浓度锌离子明显增加CPE的表达,锌离子螯合剂降低CPE的含量。但是锌离子和锌离子螯合剂对PC1/3和PC2却无明显影响,蛋白含量无明显差别。9、流式细胞术检测结果证实锌离子诱导hIAPP-INS-1细胞发生凋亡,锌离子螯合剂能够抑制高锌诱导的细胞凋亡。10、锌离子通过ERK/JNK信号通路影响hIAPP-INS-1细胞凋亡。我们应用Western blot技术检测了高锌和锌螯合剂组细胞内P-ERK,ERK,P-JNK,JNK,P-c-jun,c-jun和caspase-3的含量,结果证实锌离子通过激活ERK/JNK通路,增加caspase-3蛋白的表达,促进hIAPP-INS-1细胞发生凋亡,TPEN抑制锌离子诱导的细胞凋亡。结论:1、高浓度锌离子可明显增加hIAPP转基因小鼠和hIAPP-INS-1细胞合成IAPP的能力,减少胰岛素的分泌,加重糖尿病症状。2、高浓度的锌离子可明显增强羧肽酶的活性,但是不影响激素酶原转换酶的表达,造成异常IAPP中间产物的增加,加剧淀粉样沉积。3、锌离子螯合剂能够抑制高锌诱导的细胞凋亡。4、高浓度的锌离子可激活胰岛细胞内ERK/JNK介导的细胞凋亡信号通路,诱导细胞凋亡的发生。(本文来源于《中国医科大学》期刊2018-10-01）
王正媚,裴轶劲,李洪梅,王丹丹[3]（2018）在《IL-1在介导人胰岛淀粉样多肽对胰岛细胞毒性中的作用研究》一文中研究指出目的:研究人胰岛淀粉样多肽(IAPP)对体外单层培养胰岛细胞的细胞毒性及白细胞介素1(IL-1)在介导IAPP细胞毒性中的作用。方法:胰岛细胞体外单层培养,MTT法检测IAPP的细胞毒性,获得半数抑制生长浓度IC50。细胞分为正常对照组,IAPP处理组,IAPP联合IL-1受体阻断剂(IL-1Ra)处理组,荧光染色法检测凋亡率,实时荧光定量PCR检测IL-1βmRNA表达。结果:IC50为4.72±0.93μmol/L;与其他两组比IAPP处理组的凋亡率为高(p<0.05);与对照组相比,IAPP处理组ⅡL-1βmRNA水平增加;IAPP联合IL-1Ra处理组比IAPP处理组减少(p<0.05)。结论:IAPP对体外培养的单层胰岛细胞有细胞毒性,IAPP引起细胞凋亡,与炎症细胞因子IL-1密切相关。(本文来源于《家庭医药.就医选药》期刊2018年07期）
张鹏飞[4]（2018）在《FeTPPS与血清白蛋白及人胰岛淀粉样多肽相互作用的研究》一文中研究指出5,10,15,20-四(4-磺酸基苯基)卟啉氯化铁(5,10,15,20-tetrakis(4-sulfonatophenyl)porphyrinato iron(III)chloride,FeTPPS)是常用的过氧亚硝酸盐清除剂,对内源性和外源性过氧亚硝酸盐引起的损伤有很好的保护作用。但是FeTPPS是血红素(heme)的水溶性衍生物,拥有和血红素相同的卟啉环和铁中心,因此FeTPPS可能具有和游离血红素类似的生物效应。事实上,血红素在体内可以发挥双重作用。作为血红素蛋白(heme proteins)辅基时,血红素可以在很多生理进程中起到至关重要的作用。但是高浓度的游离态血红素会通过Fenton反应催化自由基的产生并引起严重损伤。在H_2O_2和NaNO_2存在条件下,血红素还可以催化蛋白质酪氨酸硝化,但迄今为止研究却未发现FeTPPS会对细胞和组织产生明显的损伤,这与血红素显着不同。因此,研究FeTPPS对细胞和组织相对无害的原因,对于正确认识FeTPPS作为药物的安全性有重要的意义。此外,由于活性氮(reactive nitrogen species,RNS)和人胰岛淀粉样多肽(human islet amyloid polypeptide,hIAPP)聚集均参与了2型糖尿病的发生和发展,有必要研究作为血红素类似物和过氧亚硝酸盐清除剂的FeTPPS是否具有和血红素类似的抑制hIAPP聚集的能力,这可为将FeTPPS作为兼具清除过氧亚硝酸盐和抑制hIAPP毒性双重功效的防治2型糖尿病的潜在药物提供理论支持。为回答上述问题,本文从以下叁个方面对FeTPPS展开了研究。(1)FeTPPS催化细胞蛋白质酪氨酸硝化及其对细胞活力的影响。斑点印迹(Dot blotting)结果证明FeTPPS可以在H_2O_2和NaNO_2存在条件下引起人肝癌细胞(human hepatocellular carcinoma cell,HepG2)蛋白质酪氨酸发生一定程度的硝化,但细胞活力检测结果显示FeTPPS可以有效地减少H_2O_2引起的细胞损伤。免疫印迹结果表明FeTPPS不能使血红素氧化酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)的表达上调,这说明FeTPPS的保护作用与HO-1无关。(2)牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)与FeTPPS的结合特性及其对FeTPPS促氧化活性的抑制作用。荧光猝灭实验结果显示BSA可以以很高的亲和性与FeTPPS结合(K_b~10~9 M~(-1))。同步荧光猝灭光谱结果进一步发现结合FeTPPS会增加BSA中酪氨酸残基的极性,减少其疏水性。分子模拟对接结果表明FeTPPS的结合位点位于BSA的表面区域。研究发现结合BSA可以有效抑制FeTPPS的促氧化活性并且形成低反应活性的FeTPPS-BSA复合物。另外,BSA可以保护FeTPPS免受氧化分解,避免铁离子的释放。这些发现在一定程度上解释了FeTPPS可以在体内安全使用的原因。(3)FeTPPS抑制hIAPP淀粉样聚集及其对hIAPP引起的细胞损伤的影响。紫外-可见光谱显示FeTPPS可以与hIAPP单体结合。荧光探针、透射电镜(transmission electron microscope,TEM)和NuPAGE~?预制凝胶电泳结果显示FeTPPS可以有效地抑制hIAPP淀粉样聚集,并且FeTPPS的铁中心在其中起到了一定作用。另外,FeTPPS还具有一定的解聚hIAPP成熟纤维的能力。细胞活力实验表明了FeTPPS对hIAPP聚集诱导的细胞损伤有很强的抑制能力,并且其铁中心在该过程中起到了至关重要的作用。DCFH-DA实验表明FeTPPS可以抑制hIAPP淀粉样聚集诱导的氧化应激。本研究可能为设计以金属卟啉为基础的抗hIAPP聚集药物提供指导。(本文来源于《华中科技大学》期刊2018-06-01）
陆通[5]（2018）在《胰岛淀粉样多肽与磷脂膜的相互作用以及纤维化聚集抑制的研究》一文中研究指出蛋白质的错折迭与阿尔茨海默症、肌萎缩侧索硬化症、Ⅱ型糖尿病等多种疾病有关,开放式可溶解蛋白质经过错折迭并在细胞内和细胞外形成不溶性淀粉样沉积物是这些疾病的共同特征。尽管与这些疾病有关的各种淀粉样蛋白具有不同的氨基酸序列,但它们可能有着相似的聚集机制及诱导细胞膜破坏的毒性机理。由胰岛β细胞分泌的胰岛淀粉样多肽(IAPP)是Ⅱ型糖尿病患者体内胰岛β细胞中淀粉样斑块的主要成分。IAPP由37个氨基酸组成,在正常的生理条件下呈无规卷曲结构,在病理条件下聚集形成以β折叠为主导结构的纤维,导致β细胞机能丧失和凋亡,这可能是引发Ⅱ型糖尿病的重要原因。体内和体外的研究都发现破坏膜并产生细胞毒性的并不是成熟纤维,而是在聚集过程中产生的中间体寡聚物。因此研究IAPP与磷脂膜的相互作用以及IAPP寡聚体结构与其对磷脂膜破坏能力的关系对了解IAPP的聚集机制和毒性机理有重要的意义。此外,抑制IAPP纤维化聚集被认为是治疗Ⅱ型糖尿病的主要策略和药物研发的重要方法。本论文主要开展了胰岛淀粉多肽与磷脂膜的相互作用及纤维化抑制的研究工作,简要归纳如下:1、由于人胰岛淀粉样多肽(h IAPP)的寡聚体结构多样复杂而且不能够在溶液中稳定存在,我们选用聚集属性较弱的大鼠胰岛淀粉样多肽(rIAPP)为模型肽,使用POPC与POPG的混膜(4:1)作为模型膜,用不同的方法制备出了结构、尺寸、形貌不同的rIAPP寡聚体,研究了这些寡聚体对磷脂膜的破坏能力和作用机理。我们发现rIAPP的寡聚体对于磷脂膜的破坏能力是由寡聚体的尺寸和疏水区域暴露程度两个因素共同调节的。在寡聚体直径小于50 nm的尺寸下,寡聚体对磷脂膜的破坏程度随着疏水区域暴露的增加而增大;当寡聚体直径大于50 nm时,其破坏膜的能力大大减弱,寡聚体的破坏能力也不再与其疏水暴露程度正相关。2、IAPP在其N端区域包含有符合反向胆固醇识别共有序列CARC通式的片段(R11-F15-V17),该片段可能与胆固醇在胰岛淀粉样多肽与磷脂膜的作用中的调节功能相关,为探究CARC是否与胆固醇识别以及识别作用如何影响磷脂膜的性质,本论文工作中使用了聚集能力弱的rIAPP作为模型肽而不是聚集速度过快的hIAPP,并把CARC序列中的关键残基R11和F15分别替换成了A和L,把R18替换成了H(与h IAPP的18位残基相同),研究了rIAPP和这叁个变异体在与DPPC磷脂膜和DPPC/胆固醇混膜结合的强弱、对胆固醇在磷脂膜中排布的调节以及对磷脂膜的破坏程度的不同影响。结果表明,无论是野生型rIAPP还是其变异体,胆固醇的存在都减小了它们与磷脂膜的亲和力,加大了它们对磷脂膜的破坏程度。然而,这些肽与磷脂膜的作用机制存在差异:r IAPP和R18H都倾向于与胆固醇富集区结合,并减弱了胆固醇分子间的相互作用,但是rIAPP识别胆固醇的能力更强,对胆固醇在膜内分布影响更大;F15L和R11A的残基替换减小了肽与胆固醇的识别能力,使两个变异体更倾向于与胆固醇贫乏区结合。这些肽与胆固醇的不同作用可能导致了它们对DPPC/胆固醇磷脂膜破坏作用的不同。3、近年来越来越多的研究将氧化石墨烯(GO)用于淀粉样蛋白纤维化的抑制研究中,这得益于GO独特的二维结构、高疏水表面上的sp2杂化芳香环以及分散性好易改性等特点。本论文研究工作通过共价结合的方法在GO表面修饰聚乙烯亚胺(PEI)得到GO-PEI复合物。实验结果显示GO-PEI相比于GO在缓冲溶液中有着更好的稳定性,对h IAPP纤维化聚集的抑制能力更强。GO-PEI能够在聚集过程的成核初期起到了很好的抑制效果,对于生长期中寡聚体和原纤维的形成也有一定的抑制作用,但不能够使成熟的淀粉样纤维解聚。(本文来源于《吉林大学》期刊2018-06-01）
刘娜,段谟杰,杨明晖[6]（2017）在《胆固醇影响人类胰岛淀粉样多肽(hIAPP)低聚体与细胞膜的相互作用》一文中研究指出人类胰岛淀粉样多肽(hIAPP)在细胞内会发生错误折迭并聚集,形成低聚体及纤维体过程中破坏β-细胞,导致β-细胞无法正常分泌胰岛素,从而使人患Ⅱ型糖尿病。研究表明,细胞膜会加速hIAPP的聚集~([1])。胆固醇作为细胞膜中的重要组成成分,会改变细胞膜局域的性质,增加细胞膜的刚性及厚度。但是,胆固醇如何影响hIAPP低聚体与细胞膜的相互作用仍然存在很大的争议~([2,3])。本工作通过普通的分子动力学模拟及伞形采样技术,研究了hIAPP五聚体与不同成分细胞膜(包含胆固醇及不包含胆固醇)的相互作用。研究发现,胆固醇对细胞膜有一定的保护作用,胆固醇存在时,会减弱hIAPP五聚体对细胞膜的破坏作用(图1)。该研究有助于进一步理解胆固醇在hIAPP聚集和糖尿病中的作用。(本文来源于《第十叁届全国量子化学会议论文集——第四分会：生命、药物和材料量子化学》期刊2017-06-08）
毛烨炫[7]（2017）在《人胰岛淀粉样多肽11-20片段聚集行为和肽抑制剂的研究》一文中研究指出构象病是由于蛋白质错误折迭引起的一种疾病,其典型特征为具有正常功能的蛋白质构型发生非正常变化,引起错误折迭,导致蛋白质从正常形态逐渐变为富含大量β折叠结构的淀粉样斑块,沉积在组织器官中,从而使细胞功能衰退直至凋亡。2型糖尿病作为一种常见的构象病,由于它患病人数逐年增加,已经成为一种严重危害人类生活质量和身体健康的流行性疾病。胰岛淀粉样多肽的纤维化沉积被认为是2型糖尿病的主要病理特征之一。虽然口服降糖药以及直接注射胰岛素均可用于治疗2型糖尿病,但是此种干预性治疗只能初步改善和维持正常血糖值,在治疗后期,随着并发症逐渐发生,此种治疗方法具有一定局限性。胰岛淀粉样多肽聚集形成的淀粉样纤维能够破坏胰岛β细胞膜,导致β细胞逐渐凋亡,加剧了2型糖尿病的病症。抑制胰岛淀粉样多肽的聚集能够减缓2型糖尿病的病发,因此研发抑制胰岛淀粉样多肽聚集抑制剂为2型糖尿病的治疗提供了一种新方法。人胰岛淀粉样多肽(hIAPP)的不同片段具有不同性质,阻断hIAPP自身π-π堆积作用,可以有效减弱hIAPP成淀粉样纤维的能力。因此本论文针对人胰岛淀粉样多肽自聚集行为进行了研究并设计合成了多种多肽类抑制剂。首先,本研究以牛血清白蛋白(BSA)为模版蛋白,运用微量热泳动技术(MST)建立了一种能够研究蛋白聚集行为的方法,考察了人胰岛淀粉样多肽片段_(11-20)(hIAPP_(11-20))在不同溶液中聚集行为,最终以hIAPP_(11-20)为目标物,设计并合成了一系列具有不同构型的多肽,考察了它们对hIAPP_(11-20)淀粉样纤维形成的抑制效果,探讨了影响hIAPP_(11-20)淀粉样纤维形成的主要因素。具体研究内容如下:1.运用微量热泳动技术建立研究蛋白聚集行为的方法在药物研发过程中,探究蛋白与其目标分子的结合行为为药物分子设计提供了大量的基本信息。本实验以牛血清白蛋白(BSA)为模板蛋白,分别运用微量热泳动技术(MST)和普通荧光猝灭方法,考察了BSA与一种常见小分子异硫氰酸钠(FITC)之间的相互作用。MST实验表明,在短时间内,BSA与FITC发生了两种形式的相互作用。在MST竞争实验中,以华法林和布洛芬分别为BSA不同位点的特异性结合标记物,结果表明,FITC主要与BSA的位点II位结合,但也与位点I位有少量结合,同时也证明了FITC并不以标记的形式与BSA发生相互作用,而是与BSA聚集体发生结合,从而表现出2种结合方式。MST实验所得的结果与荧光实验结果相一致,进一步表明MST在研究生物分子间相互作用中的可靠性。因此,MST不仅可以为生物分子间相互作用提供大量有用的信息,也可以研究蛋白聚集行为,获得其它方法不能得到的信息。2.hIAPP_(11-20)在不同溶液中的聚集行为研究hIAPP_(11-20)能够在体外形成与全长类似的富含β折叠的淀粉样纤维,因此选择hIAPP_(11-20)作为探究淀粉样多肽聚集行为的目标物。本实验运用MST技术和传统的Th T荧光法,考察了hIAPP_(11-20)在不同溶液(Tris-HCl,HEPES,PBS和超纯水)中的淀粉样纤维的形成过程。实验结果表明,hIAPP_(11-20)在不同溶液中表现出不同的聚集行为,hIAPP_(11-20)不仅与自身发生相互作用,也可能与溶质分子发生结合,说明缓冲溶液不仅只是起到维持溶液环境稳定的作用,还有可能参与目标分子的相互作用。hIAPP_(11-20)与Tris的亲和力远大于hIAPP_(11-20)与其它溶质分子的亲和力,说明hIAPP_(11-20)在Tris-HCl缓冲溶液中自聚能力要远小于hIAPP_(11-20)在其它溶液中的自聚能力。在HEPES和超纯水中,hIAPP_(11-20)表现出相似的自聚集行为。PBS缓冲溶液中带负电的磷酸根离子可能会“中和”一部分hIAPP_(11-20)自身的正电,从而导致hIAPP_(11-20)在PBS中快速形成淀粉样纤维聚集。因此,在研究hIAPP_(11-20)淀粉样纤维化过程时,缓冲溶液的影响需考虑在内。同时,MST技术也为研究多肽或蛋白的早期聚集行为提供了一种简单有效的方法。3.新型阻断肽抑制hIAPP_(11-20)聚集效果的研究hIAPP错误折迭所产生的淀粉样纤维是2型糖尿病的一种重要病理特征。本实验设计并合成了17条具有不同长度,构型以及组成的多肽类抑制剂,以hIAPP_(11-20)为模板,考察了它们抑制hIAPP_(11-20)淀粉样纤维形成的效果。通过MST实验以及Th T荧光实验深入探究了这些多肽抑制hIAPP_(11-20)淀粉样纤维形成的机理,并用TEM表征了hIAPP_(11-20)最终形成淀粉样纤维的形貌。结果表明短肽AT、SA、RF、KS、KT和KN,以及环肽cyclic-KS、cyclic-KT和cyclic-KN能够有效抑制hIAPP_(11-20)淀粉样纤维的形成。其中,芳香型氨基酸的种类,多肽氨基酸的特定组成以及多肽的构型在抑制淀粉样纤维形成中起重要作用。MST实验量化了hIAPP_(11-20)与多肽之间的亲和力,表明具有较高亲和力的多肽在抑制聚集中表现出良好的抑制效果,该结果与Th T荧光实验以及分子对接结果相一致。因此,MST是一种简单快速的方法,可用于初步筛选聚集抑制剂。本研究也为以后设计多肽抑制剂提供了一些实验基础,同时也为探究其他蛋白构象病的抑制剂扩展了思路。4.脂肽抑制hIAPP_(11-20)聚集效果的研究根据有些脂肽能够保护细胞免受淀粉样纤维破环,而且脂肽与报道的抑制剂均含有较多的疏水基团等特点,本实验设计了一系列新型脂肽,以hIAPP_(11-20)为探究淀粉样多肽聚集的目标物,考察了这些脂肽抑制hIAPP_(11-20)淀粉样纤维形成的效果。我们通过MST、Th T荧光实验深入讨论了这些脂肽抑制聚集的机理,同时利用TEM表征了hIAPP_(11-20)最终形成淀粉样纤维的形貌及hIAPP_(11-20)与脂肽共同孵育后的hIAPP_(11-20)聚集形貌。结果表明,随着脂肽链长的逐渐增加,其抑制hIAPP_(11-20)聚集的效果逐渐增强。另外,含正电氨基酸的数量也在抑制hIAPP_(11-20)淀粉样纤维形成中起到一定作用。因此,本实验拓宽了hIAPP淀粉样纤维化抑制剂的研究范围。本论文通过运用MST建立了一种能够研究蛋白聚集行为的方法,并采用该方法联合使用其他技术考察了hIAPP_(11-20)在不同溶液中的自聚集行为,探讨了不同类型抑制剂的抑制hIAPP_(11-20)聚集的效果,总结出影响hIAPP_(11-20)淀粉样纤维化的因素,(本文来源于《郑州大学》期刊2017-05-01）
管丽萍[8]（2017）在《胆固醇对人胰岛淀粉样多肽与磷脂膜相互作用的影响》一文中研究指出淀粉样蛋白在病理条件下很容易发生错误折迭,聚集形成以β-折迭为主要结构的纤维状沉积物。多种疾病如老年痴呆症(AD)、II型糖尿病(T2DM)、牛海绵状脑病(BSE)、帕金森疾病(PD)等都与淀粉样蛋白的聚集沉积有关,与之相关的淀粉样蛋白得到了科学界广泛的关注和研究。其中,II型糖尿病(T2DM)给人类健康带来了极大的威胁,糖尿病患者体内人胰岛淀粉样多肽(h IAPP)的沉积可能是糖尿病产生的重要原因。h IAPP由37个氨基酸组成,在胰岛β细胞中与胰岛素共同分泌。h IAPP在病理条件下错折迭形成寡聚体,进一步聚集成纤维,并诱导胰岛β细胞死亡。h IAPP聚集过程中形成的寡聚中间体被认为是对细胞膜产生破坏作用的主要成分。h IAPP与膜的相互作用是其破坏膜的关键步骤,而h IAPP的N端肽段h IAPP1-19是肽与膜相互作用的主要区域。h IAPP1-19在水中和磷脂膜中纤维化倾向都极小,能维持相对稳定的结构,并且能产生与全长hIAPP类似的对膜的破坏作用,是研究h IAPP与膜相互作用很好的模型肽。胆固醇是细胞膜的重要成分,其和鞘磷脂在膜上形成的脂筏区能改变细胞膜的流动性、厚度及刚性等物理性质。糖尿病患者体内胆固醇含量较高,所以胆固醇可能对h IAPP与膜的相互作用有一定影响。另外,hIAPP1-19第11位到第17位的氨基酸序列(RLANFLV)满足反向胆固醇识别氨基酸序列(CARC)排列规则,因此可能有利于h IAPP与胆固醇产生倾向性结合。其中苯丙氨酸(F)对肽与胆固醇的识别可能起重要作用。基于hIAPP1-19在hIAPP与膜相互作用过程中的重要性,本文利用圆二色谱(CD)、核磁共振谱(~1H-NMR、31P-NMR)、离子泄漏实验、聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)等实验方法研究了h IAPP1-19和突变体肽hIAPP1-19/F15L与不同磷脂膜的相互作用,探究了胆固醇的影响。在含有阴离子成分的POPC/POPG(8:2)膜体系中,hIAPP1-19和突变体肽与膜的相互作用比较强,肽可能是插入到膜中。在没有胆固醇时,两个肽的结构、与膜的结合及破坏膜的能力都没有很大区别,混膜中胆固醇的加入使hIAPP1-19的α-螺旋结构含量增多,与膜的结合增强,并增加了对膜的破坏程度。而突变体肽h IAPP1-19/F15L受胆固醇的影响较小。我们的结果表明,hIAPP1-19可能与胆固醇存在相互作用,F15参与了hIAPP1-19与胆固醇的相互作用,由于F15突变成L以后削弱了这种相互作用,所以导致肽-膜相互作用及膜受损害程度的减小。在DOPC/DPPC(1:2)混膜中,h IAPP1-19和突变体肽hIAPP1-19/F15L主要以无规卷曲结构存在,结合常数比在阴离子膜中减弱了约两个数量级,对磷脂膜的破坏相对较小。按DOPC/DPPC/Chol摩尔比1:2:1混合后,胆固醇能在膜上形成脂筏区。尽管胆固醇的存在对两个肽的结构都没有很大的影响,但是它能促进h IAPP1-19对膜的破坏,而对hIAPP1-19/F15L的膜破坏能力影响很小。肽的结构可能与其破坏膜的能力没有绝对的相关性。对hIAPP1-19与膜的相互作用的研究及胆固醇的影响对了解hIAPP与磷脂膜的结合方式以及膜破坏机理有重要意义。(本文来源于《吉林大学》期刊2017-05-01）
张楠[9]（2017）在《人胰岛淀粉样多肽损伤大鼠海马神经元的机制研究》一文中研究指出阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)与二型糖尿病(typeⅡdiabetes mellitus,DM2)是两种常见的年龄相关性疾病。二者具有相似的流行病学及生物化学特征,且均与蛋白质聚集,最终形成纤维状结构有关——胰岛淀粉样多肽(Amylin)聚集于DM2的胰腺组织,β淀粉样蛋白(Aβ)聚集于AD的脑组织。大量研究表明,两种疾病具有明显的相关性。Amylin寡聚体在脑内的出现被认为是导致AD发生发展的新危险因素。虽然Amylin已被证实,其聚集过程可改变内钙([Ca~(2+)]_i)稳态,进而损伤胰岛β细胞,但其神经毒性机制仍不清楚。本文中,我们应用离子成像、全细胞膜片钳及免疫荧光等技术,探究Amylin对大鼠海马神经元的损伤机制。大量报道指出,Aβ蛋白在细胞膜表面形成寡聚体的过程中,可以产生大量的ROS,从而破坏细胞膜的稳定性。我们猜想高浓度hAmylin对神经元的损伤机制可能与之相似。因此,我们借助免疫荧光、活细胞工作站及扫描电镜,进一步探究hAmylin对神经元细胞膜稳定性的影响。第一部分胰岛淀粉样多肽对大鼠海马神经元内钙的影响目的:分析不同来源、不同浓度的Amylin对原代大鼠胎鼠海马神经元[Ca~(2+)]_i的影响及其机制。方法:培养原代大鼠胎鼠海马神经元,应用免疫荧光技术鉴定神经元纯度,及相关受体表达。利用钙成像技术记录神经元[Ca~(2+)]_i变化。利用免疫荧光观察Amylin受体的表达量。利用透射电镜观察Amylin的聚集状态。结果:1原代海马神经元纯度鉴定神经元细胞纯度>98%2 Amylin对原代海马神经元[Ca~(2+)]_i的影响应用不同浓度的hAmylin对原代大鼠海马神经元进行干预,发现1-30μM的hAmylin可诱导神经元[Ca~(2+)]_i显着增加(P<0.05)。神经元对3μM和10μM hAmylin的反应率分别为38.46%和55.05%。10μM hAmylin可使R(340/380)增长67.6±17.5%,EC50约等于2.53μM。海马神经元[Ca~(2+)]_i在给予10μM hAmylin约10 s后达峰,且可维持在峰值,无衰减。在撤药洗脱后约30 s,[Ca~(2+)]_i可恢复至基线。重复给药[Ca~(2+)]_i增加的峰值未见明显变化(P>0.05),说明没有药物脱敏现象。大约10%的神经元在给予10μM鼠来源的Amylin(r Amylin)及普兰林泰(hAmylin类似物,不发生聚集)后,产生[Ca~(2+)]_i增加现象。R(340/380)增长分别为22.1±4.0%和24.8±7.0%,与应用10μM hAmylin相比,反应显着降低(P<0.001)。10μM Amylin受体抑制剂AC187或AC253本身并不影响神经元[Ca~(2+)]_i,但可阻断1μM hAmylin、10μM普兰林泰及10μM r Amylin的作用,而10μM hAmylin所导致的[Ca~(2+)]_i增加现象不受影响。说明低浓度(1μM)hAmylin、10μM普兰林泰及10μM r Amylin所引起的[Ca~(2+)]_i增加现象是一种受体依赖的机制,而高浓度(10μM)hAmylin所引起的内钙增加现象是一种非受体依赖的机制。3 Amylin受体RAMP在胎鼠海马神经元及成年大鼠脑片海马区的表达应用免疫荧光技术,我们发现Amylin受体RAMP1、2亚型在胎鼠海马神经元及大鼠脑片海马区均有高表达。RAMP3亚型仅在胎鼠海马神经元高表达,而成年大鼠脑片海马区表达量较低。4浓度对hAmylin聚集的影响我们推测高浓度(10μM)hAmylin所诱导的[Ca~(2+)]_i增加与hAmylin的聚集有关。因此,我们应用透射电镜对hAmylin的聚集状态进行观察。高浓度hAmylin(10μM)在37℃孵育1 h和24 h后,分别观察到寡聚体及纤维状结构的产生。而在低浓度hAmylin(1μM)溶液中并未观察到类似结构。说明hAmylin诱导[Ca~(2+)]_i增加的非受体依赖机制,可能与其在高浓度下更容易出现错误折迭,产生寡聚体及纤维状结构的特性有关。第二部分人胰岛淀粉样多肽对TRPV4的兴奋性调节作用目的:探究高浓度hAmylin诱导神经元[Ca~(2+)]_i增加的非受体依赖机制方法:培养原代大鼠胎鼠海马神经元,利用钙成像技术记录神经元[Ca~(2+)]_i变化,利用全细胞膜片钳技术记录细胞静息电位。利用scRT-PCR,及siRNA技术探究TRPV4在hAmylin诱导[Ca~(2+)]_i增加反应中的作用。结果:1神经细胞膜钙通透性离子通道与hAmylin诱导的[Ca~(2+)]_i增加细胞[Ca~(2+)]_i增加的来源只能是胞外钙内流或(和)胞内钙库释放。为探究hAmylin所诱导的[Ca~(2+)]_i增加是否来源于外钙。我们使用了无钙细胞外液,并加入0.1 m M EGTA鳌合残存的外钙。在无钙外液中,10μM hAmylin诱导[Ca~(2+)]_i增加的现象消失。说明细胞膜上的钙离子通道在hAmylin诱导[Ca~(2+)]_i增加的现象中扮演重要角色。为进一步排除胞内钙库释放对该现象的影响,我们给予5μM环匹阿尼酸(cyclopiazonic acid,CPA)内质网钙ATP酶抑制剂,孵育1 min后,引起神经元[Ca~(2+)]_i增加。随后,再次给予hAmylin仍可引起神经元[Ca~(2+)]_i的快速增加,且增加程度与不应用CPA相比无明显变化(P>0.05)。用1μM毒胡萝卜素(thapsigargin,TG)替代CPA,重复该实验得到相同结果。说明增加的[Ca~(2+)]_i主要来源于胞外钙内流,而非胞内钙库释放。2电压门控性钙离子通道与hAmylin诱导的神经细胞[Ca~(2+)]_i增加我们利用膜片钳技术检测hAmylin对神经细胞膜静息电位的影响。我们发现在给予hAmylin后,细胞膜静息电位由-55.67±2.35m V上升至-35.00±2.80 m V。个别细胞还观察到动作电位的产生。考虑到细胞膜静息电位去极化至-40 m V时,即可激活L型钙通道。因此我们认为hAmylin诱导[Ca~(2+)]_i增加的现象有电压门控性钙离子通道参与。我们给予L型钙通道阻断剂氨氯地平(5μM)或N型钙通道阻断剂芋螺霉素(1μM)孵育1 min后,hAmylin诱导的R(340/380)增加率分别为44.49±13.84%和52.84±13.23%,与单独应用hAmylin(67.98±14.85%)相比,有明显差异(P<0.01)。说明电压门控性钙离子通道参与了hAmylin诱导神经元[Ca~(2+)]_i增加。然而,即便在同时给予氨氯地平和芋螺霉素时,仍不能完全抑制hAmylin的作用,提示仍有其他的钙通透性通道参与该反应。3 hAmylin诱导的神经细胞[Ca~(2+)]_i增加依赖于外钠参与为探究hAmylin导致神经细胞膜去极化的机制,我们用NMDG(一种不透过阳离子通道的大体积有机阳离子)代替了细胞外液中的Na+。在无钠外液中,hAmylin诱导[Ca~(2+)]_i增加的现象被显着抑制。反应阳性率降至18.2%,反应强度由65.39±15.91%降至34.34±4.57%(P<0.001)。说明hAmylin诱导[Ca~(2+)]_i增加依赖于外钠内流,进而使细胞膜去极化,膜静息电位抬高。有趣的是,当我们在正常外液中加入TTX(1μM)后,hAmylin诱导[Ca~(2+)]_i增加的现象无明显变化(P>0.05),说明电压门控性钠离子通道并不参与该反应。甚至在无钠外液中加入氨氯地平,仍然无法完全阻断hAmylin诱导的[Ca~(2+)]_i增加现象。因此我们考虑,可能有非选择性阳离子通道(如TRP家族)于上游进行调控。4 TRPV4参与hAmylin诱导的神经细胞[Ca~(2+)]_i增加我们在给予TRP通道广谱抑制剂RR(10μM)后,hAmylin诱导海马神经元[Ca~(2+)]_i增加的现象被显着抑制(P<0.01)。静息电位抬高了8.8±1.1 m V,与单独应用hAmylin(21.4±1.7 m V)相比,有显着差异(P<0.001)。为进一步探究参与反应的是TRP家族中的哪一种亚型,我们应用单细胞RT-PCR技术检测hAmylin反应阳性的海马神经元。发现6/7的阳性海马神经元表达TRPV4亚型,这与胰岛β细胞的结果一致。之后,我们使用TRPV4通道的选择性抑制剂HC067047(1μM)进行干预,发现hAmylin诱导神经元[Ca~(2+)]_i增加的现象被显着抑制(P<0.01)。静息电位抬高7.4±1.1 m V,与单独应用hAmylin(21.4±1.7 m V)相比,有显着差异(P<0.001)。在成年SD大鼠的脑切片中,TRPV4在海马区的表达很低,这与之前报道相一致。然而,在原代培养的SD大鼠胎鼠海马神经元中,TRPV4在部分神经元中表达,阳性率为54%,这与钙成像hAmylin反应阳性率相一致。为进一步确证TRPV4参与hAmylin诱导的[Ca~(2+)]_i增加,我们应用TRPV4通道激动剂(GSK1016790A,100 n M)对海马神经元进行干预。我们发现GSK1016790A与hAmylin诱导细胞[Ca~(2+)]_i增加的现象总是相伴出现在同一神经细胞。hAmylin的反应低于GSK1016790A。我们利用siRNA技术将TRPV4通道敲低后,GSK1016790A及hAmylin诱导的[Ca~(2+)]_i增加较未敲低组显着降低(P<0.05)。说明TRPV4通道是hAmylin诱导神经元[Ca~(2+)]_i增加上游反应的关键靶点,这一结果与胰岛β细胞的研究一致。为探究hAmylin是否可以直接激活TRPV4通道,我们对转染TRPV4通道的HEK293细胞,直接给予GSK1016790A(100 n M)与hAmylin。发现GSK1016790A诱导[Ca~(2+)]_i增加的反应仍然存在,而hAmylin诱导[Ca~(2+)]_i增加的反应消失。说明hAmylin并非直接激活TRPV4通道,或其需要某些因素共同参与时才可激活该通道。第叁部分人胰岛淀粉样多肽对细胞膜稳定性的影响目的:探究hAmylin激活TRPV4的机制方法:培养原代大鼠胎鼠海马神经元,应用离子成像技术记录神经元[Ca~(2+)]_i变化,线粒体膜电位的变化及ROS的生成。利用免疫荧光、活细胞工作站、扫描电镜观察hAmylin对细胞膜稳定性的影响。结果:1 hAmylin聚集状态的观察我们将N端标记FAM荧光的hAmylin加入细胞培养基中,37℃孵育15 min后,更换培养基,可观察到聚合的hAmylin荧光。用新鲜培养基进一步摇床洗脱之后,荧光消失。说明hAmylin更容易在细胞表面发生聚集,而没有进入细胞内发挥作用。为分析hAmylin的聚合过程是否可逆,我们在更换培养基后,持续观察聚合的hAmylin荧光12 h,荧光并未减少。说明hAmylin聚合的过程是不可逆的。2 hAmylin长时间作用对神经元形态的影响我们利用活细胞工作站,对高浓度(10μM)hAmylin作用下的神经元形态进行长时间观察。10μM hAmylin作用约4 h后,神经元开始出现核固缩;约9 h后,可观察到细胞凋亡。3 hAmylin对海马组织的直接影响为了观察hAmylin对海马组织的直接影响,我们给成年大鼠侧脑室注射5μL的10μM hAmylin,并于24 h后处死取脑,行冰冻切片。利用免疫荧光染色技术,我们观察到hAmylin导致的海马区神经元缺失。在我们的实验中,并未观察到明显的小胶质细胞浸润,说明炎症反应并非造成神经元缺失的主要原因。4 hAmylin对细胞膜完整性的影响我们猜想hAmylin诱导神经元[Ca~(2+)]_i增加可能与其寡聚体能在细胞膜表面形成非选择性离子通透性孔道有关。我们对HEK293细胞给予10μM hAmylin 1 min,并未观察到细胞[Ca~(2+)]_i的变化。在全细胞电压钳下也同样未观察到hAmylin引起电流变化。利用免疫荧光技术,对神经元及神经胶质分别进行特异性抗体染色。用hAmylin替代打孔剂Triton X-100后发现。神经元经短时间(1 min)hAmylin孵育后,镜下即可观察到免疫荧光。而胶质细胞短时间(1 min)hAmylin孵育后,并未观察到免疫荧光。若孵育时间延长至30 min,则神经元、胶质细胞于镜下均可观察到相应免疫荧光。说明hAmylin在细胞表面聚合过程中,确实可以导致细胞膜完整性的破坏,使一抗进入细胞内。但不同种类的细胞膜,所需孵育时间不同。这可能是导致hAmylin在短时间内,无法增加HEK293细胞[Ca~(2+)]_i的原因。为进一步确证hAmylin对细胞膜稳定性的影响,我们利用扫描电镜对细胞进行观察。发现经hAmylin孵育后,神经元及胶质细胞膜完整性遭到破坏。对HEK293细胞转染LifeAct质粒,标记细胞骨架(F-actin)后,在活细胞工作站中,观察hAmylin长时间作用。结果显示,10μM hAmylin的长时间作用同样可对HEK293细胞的细胞骨架造成损伤。5 hAmylin对神经元ROS生成及线粒体膜电位的影响有报道指出,Aβ蛋白破坏细胞膜完整性的机制主要与其在细胞表面聚合时生成ROS有关。我们猜想hAmylin破坏细胞膜完整性的机制可能与此相同。我们利用离子成像技术,对神经元ROS的生成进行观察。发现高浓度(10μM)hAmylin可以明显增加神经元ROS的生成(P<0.001),而低浓度(1μM)hAmylin无此作用。说明ROS的生成主要与hAmylin的聚合有关。我们利用JC-1染料,进一步观察hAmylin对神经元线粒体膜电位的影响。发现高浓度(10μM)hAmylin可以明显降低线粒体膜电位,而低浓度(1μM)hAmylin无此作用。当给予线粒体PTP开放抑制剂Cs A(1μM)后,高浓度(10μM)hAmylin所导致的线粒体膜电位降低现象被显着抑制(P<0.001),但不能抑制它所导致的[Ca~(2+)]_i增加及ROS的生成。说明hAmylin诱发的[Ca~(2+)]_i增加以及ROS生成还有其他机制。结论:hAmylin通过受体依赖及非受体依赖两种机制诱导大鼠海马神经元[Ca~(2+)]_i增加;低浓度hAmylin主要通过受体依赖机制,而高浓度hAmylin主要通过非受体依赖机制增加神经元[Ca~(2+)]_i。hAmylin在高浓度时容易发生错误折迭,形成寡聚体作用于神经元表面,激活TRPV4通道诱发细胞膜去极化,进而激活电压门控性钙通道,导致神经元[Ca~(2+)]_i进一步增加。随着hAmylin寡聚体在神经细胞表面聚集时间延长,细胞膜完整性受损、ROS生成增加以及线粒体膜电位下降,最终导致神经细胞凋亡。(本文来源于《河北医科大学》期刊2017-04-01）
李扬[10]（2016）在《人胰岛淀粉样多肽与磷脂膜相互作用的研究》一文中研究指出正常可溶性的蛋白质错误折迭形成高度有序的聚集体后可能引发一系列的疾病,II型糖尿病(T2DM)、阿尔兹海默症(AD)、帕金森病(PD)等神经退行性疾病都与这类蛋白质的错折迭相关。虽然这些蛋白质有各自的氨基酸序列和空间结构,但它们均可以由可溶性的蛋白质错折迭成不溶性的淀粉样沉积,由这类蛋白导致的淀粉样疾病很可能有相似的致病机理。其中,T2DM患者的显着特征是人胰岛淀粉样多肽(h IAPP)错折迭形成β-折迭结构的淀粉样纤维并沉积在胰岛β-细胞表面,导致β-细胞的死亡。h IAPP由37个氨基酸残基组成,和胰岛素共同由胰岛β-细胞分泌。在h IAPP对细胞产生毒性进而导致细胞死亡的过程中,其与膜的相互作用是关键的因素。因此了解h IAPP与磷脂膜是如何相互作用的,对抑制淀粉样蛋白的聚集和开发治疗此类疾病的药物都有重要的意义。由于细胞环境的复杂性,h IAPP与膜的结合受到许多环境因素的影响。此外,胆固醇是细胞膜中的重要成分,对淀粉样蛋白的聚集行为及毒性机理可能有重要的影响。本论文中,我们主要研究了h IAPP在磷脂膜上的聚集以及硫酸软骨素和血清白蛋白对h IAPP在磷脂膜上聚集的影响;我们还研究了胆固醇对h IAPP的N端区域与磷脂膜相互作用的影响。我们对h IAPP与磷脂膜相互作用的研究工作可以归纳为以下几点:1、我们用两性离子磷脂膜POPC、阴离子磷脂膜POPG以及它们以POPG:POPC为3:7的比例组成的混膜作为模型膜,通过Th T荧光实验、圆二色谱(CD)、原子力显微镜、31P-NMR等实验方法研究了硫酸软骨素(CSA)和牛血清白蛋白(BSA)对全长h IAPP在磷脂膜环境中聚集的影响。CSA和BSA属于细胞外基质的成分,它们的引入为h IAPP的聚集创造了一个多相异质环境。我们发现h IAPP在多相异质环境和在均相环境中的聚集行为是不一样的。在均相水环境中,CSA对h IAPP的聚集有促进作用,BSA则很好地抑制了h IAPP的聚集。而在POPC膜中,由于CSA和POPC的特异性结合,导致CSA对h IAPP聚集的促进作用有一个额外的增强效果。在含POPG的阴离子膜(POPG和POPG/POPC)中,BSA因与POPG磷脂成分的结合而减弱了对h IAPP的抑制作用。与单一环境相比,多相环境可能更接近h IAPP所处的真实环境,所以在含有磷脂膜和胞外基质成分的复杂体系中进行研究有可能为了解h IAPP的聚集机理提供更加有意义的信息。2、h IAPP的N端区域是其与膜结合的关键区域,研究发现,虽然h IAPP有很强的聚集倾向,但h IAPP1-19与全长的h IAPP不同,h IAPP1-19不管是在水溶液还是磷脂膜中都不会形成长纤维,有很弱的聚集倾向,但是有与全长h IAPP类似的细胞毒性。1-19肽段中包含的R11、F15和V17叁个残基组成反向胆固醇识别氨基酸共有序列(CARC),可能参与肽-胆固醇的结合,其中第15位的苯丙氨酸是CARC序列的关键残基。因此,我们选取1-19肽段(h IAPP1-19)作为h IAPP与膜相互作用的结构模型,并将第15位的苯丙氨酸(Phe或F)突变成亮氨酸(Leu或L)得到h IAPP1-19/F15L,通过差示扫描量热法(DSC)、31P-NMR、1H-NMR、CD和染料泄漏实验等实验方法研究了h IAPP1-19与DPPC膜的相互作用以及CARC序列对h IAPP1-19与DPPC膜相互作用的影响。我们发现,胆固醇可以在DPPC膜上形成脂筏区,并促进h IAPP1-19与DPPC的结合,诱导多肽的二级结构由无规卷曲转变为α-螺旋,产生更多的毒性寡聚体,对膜造成更大的破坏,在这个过程中,F15参与了肽与胆固醇的结合。3、我们在第二部分工作的基础上用具有柔性链的DOPC磷脂膜代替刚性链的DPPC膜,同样以野生型肽h IAPP1-19和突变体肽h IAPP1-19/F15L作为研究对象,用31P-NMR、1H-NMR滴定实验、CD和染料泄漏实验等实验方法研究了h IAPP1-19与DOPC膜的相互作用以及在这个过程中胆固醇的影响。我们发现,胆固醇也能增强h IAPP1-19与具有柔性链的DOPC膜的结合,并增加磷脂膜的透性,对磷脂膜造成破坏。但与DPPC膜的结果相比,h IAPP1-19与DOPC膜的结合较弱,这可能归因于胆固醇没能在柔性的DOPC膜上产生脂筏区。(本文来源于《吉林大学》期刊2016-11-01）
胰岛淀粉样多肽论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
目的:糖尿病是由多种病因引起的以慢性高血糖为主要特征的内分泌代谢紊乱性疾病,发病机制复杂。近年来,在2型糖尿病患者的尸检材料中发现,90%的患者胰岛内均有纤维状的胰岛淀粉样多肽(islet amyloid polypeptide,IAPP)蛋白沉积同时伴有β细胞数量显著减少,提示IAPP病理性沉积是影响胰岛β细胞存活和胰岛素分泌的重要原因之一。因此,深入研究IAPP在胰岛β细胞内病理性沉积的机制,对探讨糖尿病的发病机理以及寻找糖尿病防治的新靶点具有重要的理论和现实意义。研究证实,金属锌离子与IAPP的合成与代谢关系密切。锌离子通过与IAPP的第18位点的组氨酸残基结合,使相邻的IAPP单体交联,最终形成纤维状的IAPP聚集体。这一现象提示胰岛β细胞内锌离子代谢失衡可能是引起IAPP淀粉样沉积的重要原因。所以,调节糖尿病患者体内锌离子稳态,维持IAPP生成与降解的动态平衡,有望成为糖尿病治疗学的新策略。本课题通过小鼠和细胞模型,观察锌离子对胰岛淀粉样多肽沉积和胰岛细胞凋亡的影响,检测锌离子对IAPP合成和代谢相关酶类及胰岛β细胞凋亡相关蛋白的影响,旨在探讨锌离子影响胰岛淀粉样多肽病理性沉积的机制,为2型糖尿病治疗新靶点的选择提供实验依据。材料与方法:本研究以hIAPP转基因小鼠和转染hIAPP基因的INS-1细胞为研究对象,检测锌离子及锌离子螯合剂对淀粉样蛋白沉积及IAPP代谢和胰岛β细胞凋亡的影响及其机制。1、采用1月龄纯合hIAPP转基因雄性小鼠,高脂高糖饮食喂养,诱导产生2型糖尿病hIAPP转基因小鼠动物模型。成模后的小鼠分别给予锌离子和锌离子螯合剂(clioquinol,CQ)处理,观察小鼠的一般状态、监测血糖和体重变化情况;应用金属自显影技术(autometallography,AMG)观察锌离子沉积情况,应用免疫荧光组织化学染色观察锌离子对胰岛淀粉样多肽和胰岛素表达的影响;应用Western blot技术检测锌离子对小鼠胰腺内IAPP、胰岛素、IAPP合成代谢相关酶类含量的影响。2、培养稳定转染hIAPP基因的INS-1细胞,分别加入ZnSO_4和锌离子螯合剂(N,N,N?,N?-Tetrakis(2-pyridylmethyl)ethylenediamine,TPEN),应用Zinquin荧光染色观察不同组别细胞内锌离子的含量变化。应用免疫荧光双标染色观察锌离子对转hIAPP基因的INS-1细胞内IAPP和胰岛素分布和表达的影响。应用ELISA方法检测锌离子对hIAPP-INS-1细胞胰岛素分泌的影响。通过流式细胞术检测锌离子对hIAPP-INS-1细胞凋亡的影响。应用Western blot技术检测转hIAPP基因的INS-1细胞内IAPP、胰岛素、IAPP合成代谢相关酶类及细胞凋亡信号通路相关蛋白含量的变化。结果:1、锌离子影响hIAPP转基因小鼠的体重和血糖。髙脂高糖喂养的hIAPP转基因小鼠血糖升高,身体消瘦,出现糖尿病症状。与对照组小鼠相比,高锌喂养组小鼠体重下降明显,血糖值迅速升高,锌离子螯合剂CQ可改善小鼠糖尿病症状。2、CQ能够鳌合胰岛内的锌离子。AMG金属离子染色结果显示高锌处理组小鼠胰岛内可见大量锌离子沉积,而Zn+CQ组小鼠胰腺内锌离子沉积明显减少。3、锌离子促进hIAPP转基因小鼠胰岛内IAPP蛋白的沉积,减少胰岛素的表达。免疫荧光双标染色结果显示IAPP与胰岛素共表达于胰岛β细胞胞质,高锌组小鼠胰岛内IAPP荧光染色增强,而胰岛素荧光强度减弱。与高锌组比较,Zn+CQ组小鼠IAPP沉积减少,胰岛素表达增加。Western blot结果与免疫荧光染色结果一致,高浓度的锌离子可增加IAPP蛋白的含量,降低胰岛素的表达量,CQ能够逆转这一现象。4、锌离子影响hIAPP转基因小鼠胰腺内IAPP的合成。Western blot结果显示:与对照组相比,锌离子可增加hIAPP转基因小鼠胰腺内羧肽酶(carboxypeptidase,CPE)的含量,CQ处理可降低CPE的表达量,但是激素酶原转换酶1/3(prohormone convertase1/3,PC1/3)和激素酶原转换酶2(prohormone convertase 2,PC2)不受锌离子和锌离子螯合剂的影响。5、MTT比色实验结果显示50μM的ZnSO_4和1μM的TPEN孵育12h,不影响hIAPP-INS-1细胞的活性。6、Zinquin荧光染色显示50μM的ZnSO_4使hIAPP-INS-1细胞内锌离子荧光强度增加明显,而锌离子螯合剂TPEN能够螯合锌离子,降低hIAPP-INS-1细胞内的锌离子荧光强度。7、高浓度的锌离子增加hIAPP-INS-1细胞内IAPP的表达,减少胰岛素的表达。免疫荧光双标染色结果显示:高锌(Zn)组细胞内IAPP表达增强,胰岛素表达减弱;而锌螯合剂TPEN干预组(Zn+TPEN)细胞内IAPP表达明显低于高锌组,胰岛素表达增加。Western blot结果证实高锌降低细胞内胰岛素的分泌,增强IAPP蛋白的表达,TPEN能够减弱锌离子的作用。ELISA实验也证实过多的锌离子减少hIAPP-INS-1细胞分泌胰岛素的能力。8、锌离子影响hIAPP-INS-1细胞中IAPP合成酶的含量。Western blot结果显示:IAPP合成过程中的关键酶CPE受锌离子调控,高浓度锌离子明显增加CPE的表达,锌离子螯合剂降低CPE的含量。但是锌离子和锌离子螯合剂对PC1/3和PC2却无明显影响,蛋白含量无明显差别。9、流式细胞术检测结果证实锌离子诱导hIAPP-INS-1细胞发生凋亡,锌离子螯合剂能够抑制高锌诱导的细胞凋亡。10、锌离子通过ERK/JNK信号通路影响hIAPP-INS-1细胞凋亡。我们应用Western blot技术检测了高锌和锌螯合剂组细胞内P-ERK,ERK,P-JNK,JNK,P-c-jun,c-jun和caspase-3的含量,结果证实锌离子通过激活ERK/JNK通路,增加caspase-3蛋白的表达,促进hIAPP-INS-1细胞发生凋亡,TPEN抑制锌离子诱导的细胞凋亡。结论:1、高浓度锌离子可明显增加hIAPP转基因小鼠和hIAPP-INS-1细胞合成IAPP的能力,减少胰岛素的分泌,加重糖尿病症状。2、高浓度的锌离子可明显增强羧肽酶的活性,但是不影响激素酶原转换酶的表达,造成异常IAPP中间产物的增加,加剧淀粉样沉积。3、锌离子螯合剂能够抑制高锌诱导的细胞凋亡。4、高浓度的锌离子可激活胰岛细胞内ERK/JNK介导的细胞凋亡信号通路,诱导细胞凋亡的发生。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
胰岛淀粉样多肽论文参考文献
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